熒光定量PCR基礎(chǔ)原理

○PCR擴(kuò)增的理論模式○RealtimePCR理論基礎(chǔ)第1頁/共39頁第一頁，共40頁。PCR是將樣本中微量的DNA模版放大來研究模版特性。隨著研究的深入，要了解樣本中基因的表達(dá)模式與疾病的關(guān)系，就需要了解標(biāo)本中的DNA原始拷貝數(shù)。第2頁/共39頁第二頁，共40頁。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不同的PCR反應(yīng)體系進(jìn)入平臺期的時間和平臺期的高低都有很大變化，即使是重復(fù)實驗，各種條件基本一致，最后得到的DNA拷貝數(shù)也往往不同。因此經(jīng)過PCR擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物量不能反映起始模板量的真實情況。通過凝膠電泳EB染色或者同位素標(biāo)記只能定量PCR的終產(chǎn)物量，而不能定量起始DNA模版的拷貝數(shù)。第3頁/共39頁第三頁，共40頁。實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR技術(shù)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實時熒光定量PCR技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高，特異性和可靠性強(qiáng)，重復(fù)性好，自動化程度高、無污染性等突出優(yōu)勢，因此被公認(rèn)為當(dāng)今世界用于臨床的最先進(jìn)核酸分子診斷技術(shù)。第4頁/共39頁第四頁，共40頁。PCR擴(kuò)增的理論模式PCR中，隨著擴(kuò)增周期的增加，模板以指數(shù)方式進(jìn)行擴(kuò)增。PCR理論方程：N=N0×(1+E)nN:擴(kuò)增子數(shù)量N0:起始模板數(shù)量E：擴(kuò)增效率n:循環(huán)數(shù)此公式僅在指數(shù)擴(kuò)增期（20-30個循環(huán)）內(nèi)成立。第5頁/共39頁第五頁，共40頁。PCR分期——“S”形曲線對PCR擴(kuò)增過程的詳細(xì)分析表明，PCR擴(kuò)增曲線可被分為三個典型時期：早期背景擴(kuò)增期、中期指數(shù)擴(kuò)增期（或?qū)?shù)線形擴(kuò)增期），以及晚期的平臺期第6頁/共39頁第六頁，共40頁。理論上PCR過程中反應(yīng)產(chǎn)物是以指數(shù)規(guī)模增長的，但實際的PCR擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線；因為隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率降低，產(chǎn)物生成的速度逐漸減緩，最終進(jìn)入平臺期。第7頁/共39頁第七頁，共40頁。兩種定量方法第8頁/共39頁第八頁，共40頁。第9頁/共39頁第九頁，共40頁。兩種定量方法終點定量起點定量無規(guī)律對數(shù)期分析：平行性好終點產(chǎn)物數(shù)量：誤差大拐點產(chǎn)物數(shù)量：重現(xiàn)性好，誤差小影響因素多擴(kuò)增效率恒定，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性起始DNA量，更具意義重現(xiàn)性好，誤差小擴(kuò)增效率恒定，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性第10頁/共39頁第十頁，共40頁。普通PCR技術(shù)的檢測模式普通PCR儀器擴(kuò)增，約2.5小時瓊脂糖凝膠電泳，約1小時EB染色，約20分鐘紫外成像陰性陽性樣品檢測結(jié)果無法定量第11頁/共39頁第十一頁，共40頁。實時熒光定量PCR的檢測模式熒光定量PCR儀器擴(kuò)增，約2小時檢測過程有實時監(jiān)測數(shù)據(jù)光滑的S型指數(shù)曲線，陽性無S型指數(shù)曲線，陰性第12頁/共39頁第十二頁，共40頁。實時熒光定量PCR的檢測模式需絕對定量時四個已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線系統(tǒng)即可自動計算出未知樣品的濃度第13頁/共39頁第十三頁，共40頁。陰性結(jié)果曲線圖示第14頁/共39頁第十四頁，共40頁。陽性結(jié)果曲線圖示第15頁/共39頁第十五頁，共40頁。實時熒光定量PCR基本原理在常規(guī)PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上，加入熒光染料或熒光標(biāo)記的探針，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR產(chǎn)物不段累積，熒光信號強(qiáng)度等比增強(qiáng)。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測，從而對起始模板定量及定性的分析。第16頁/共39頁第十六頁，共40頁。熒光擴(kuò)增曲線分三階段熒光背景信號，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，平臺期熒光背景信號階段：該時期擴(kuò)增的熒光信號被背景信號所掩蓋，擴(kuò)增產(chǎn)物量無法判斷。平臺期：擴(kuò)增產(chǎn)物不再呈指數(shù)增加，PCR終產(chǎn)物量與起始模板量無線性關(guān)系，無法計算起始DNA拷貝數(shù)。熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段：該時期，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量呈線性關(guān)系，因此選擇這一階段進(jìn)行定量分析。引入兩個概念：熒光閾值和Ct值。第17頁/共39頁第十七頁，共40頁。實時定量PCR的兩個重要概念（1）熒光域值（

threshold）：熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定一個值，以PCR反應(yīng)的前15

個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，一般熒光域值定義為3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10

倍。閾值=基線信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差x10第18頁/共39頁第十八頁，共40頁。實時定量PCR的兩個重要概念(2)Ct值：也稱循環(huán)閾值，C代表Cycle，t代表threshold。指在PCR循環(huán)過程中熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。在實際操作中，Ct值也就是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值的循環(huán)次數(shù),可見Ct值取決于閾值。

第19頁/共39頁第十九頁，共40頁?；€閾值Ct值第20頁/共39頁第二十頁，共40頁。Ct值∝DNA起始濃度Ct值與模板DNA的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。起始拷貝數(shù)越多，達(dá)到熒光閾值的Ct值越小。Rn=RB+X0(1+E)nRs總信號=本底信號+分子數(shù)量×單位信號強(qiáng)度Rn：第n個循環(huán)時的總信號RB：本底RS：單位信號強(qiáng)度X0：起始DNA數(shù)目E：PCR效率第21頁/共39頁第二十一頁，共40頁。Rn=RB+X0(1+E)nRs當(dāng)循環(huán)次數(shù)n=CT值時：RT=RB+X0(1+E)CTRslg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs即CT=-klgX0+b（線性方程）第22頁/共39頁第二十二頁，共40頁。定量方法利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，橫坐標(biāo)代表Ct值。所以，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。第23頁/共39頁第二十三頁，共40頁。RealtimePCR化學(xué)原理雙鏈DNA結(jié)合染料染色-非特異性檢測–SYBR?GreenI–溴乙錠(EthidiumBromide)探針標(biāo)記-特異性檢測–TaqManTM–TaqManMGB–Dual-oligoFRETpairs–分子信標(biāo)(Molecularbeacons)–ScorpionsTM/AmplifluorTM第24頁/共39頁第二十四頁，共40頁。SYBR

Green

I熒光染料的作用原理SYBR

Green

I是一種只與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料，可與所有的各種序列的雙鏈DNA分子結(jié)合。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；變性時，DNA雙鏈分開時，熒光信號急劇減弱。在延伸結(jié)束階段，采集熒光信號。因此，在一個體系內(nèi)，信號強(qiáng)度與DNA雙鏈總數(shù)目成正比其信號強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。第25頁/共39頁第二十五頁，共40頁。退火：產(chǎn)生熒光信號結(jié)合SYBRGreenI第26頁/共39頁第二十六頁，共40頁。SYBRGreenI染料僅在與雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合時發(fā)射熒光，所發(fā)射的光波是藍(lán)色光。SYBRGreenI不會與單鏈DNA結(jié)合，因此變性時熒光強(qiáng)度最低。dsDNA形成單鏈（圖A）合成雙鏈（圖B）時，SYBRGreenI結(jié)合于dsDNA上，結(jié)合的SYBRGreenI（綠色光）的熒光信號強(qiáng)度增強(qiáng)。延伸末期（圖C）時，所有DNA均是雙鏈，結(jié)合狀態(tài)的SYBRGreenI含量達(dá)最大，該PCR周期中熒光信號也達(dá)最大。因此，通常是在延伸期結(jié)束時進(jìn)行SYBRGreenI熒光信號測定。第27頁/共39頁第二十七頁，共40頁。染料法優(yōu)缺點優(yōu)點缺點成本低只能檢測單一模板，無法多重檢測通用性好無模板特異性，非特異性擴(kuò)張和引物二聚體也產(chǎn)生熒光適合初步篩查敏感度低，不能準(zhǔn)確測序低拷貝模板融解曲線功能，分析非特異性擴(kuò)增熒光本底高，易引起假陽性第28頁/共39頁第二十八頁，共40頁。第29頁/共39頁第二十九頁，共40頁。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）當(dāng)某個熒光基團(tuán)的發(fā)射譜與另一個熒光基團(tuán)的吸收光譜重疊，且兩個基團(tuán)距離足夠近時，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長波長（低能量）的熒光基團(tuán)，這個過程稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，實際相當(dāng)于短波長熒光基團(tuán)釋放的熒光被屏蔽。Hybprobe探針和水解探針均基于FRET（熒光共振能量傳遞）的原理設(shè)計的。第30頁/共39頁第三十頁，共40頁。TaqMan探針法-水解探針PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。TaqMan探針為一寡核苷酸，包含兩個分子標(biāo)記，探針的5′端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)，如TAMRA等。第31頁/共39頁第三十一頁，共40頁。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被近距離的淬滅基團(tuán)吸收；隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5‘－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，游離于反應(yīng)體系中，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。第32頁/共39頁第三十二頁，共40頁。第33頁/共39頁第三十三頁，共40頁。TaqMan探針的數(shù)量關(guān)系每擴(kuò)增一條DNA鏈，就切斷一條探針；每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個單位熒光信號，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步；信號強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比，報告信號的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。因此該技術(shù)可對模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。由于擴(kuò)增產(chǎn)物較短時效率較高，故擴(kuò)增長度一般為50—150bp。第34頁/共39頁第三十四頁，共40頁。TaqMan探針的優(yōu)點特異性高多重基因定量熒光強(qiáng)度正比于產(chǎn)物不可逆反應(yīng)信號生成后不會自動淬滅第35頁/共39頁第三十五頁，共40頁。RealtimePCR優(yōu)點對整個PCR實時監(jiān)控，明確了指數(shù)擴(kuò)增期，進(jìn)而可對起始模板進(jìn)行定量，且定量范圍廣；測定敏感性高，比電泳方法的靈敏度高2-3個數(shù)量級；測定準(zhǔn)確度和重復(fù)性好，Ct值和模板起始濃度有函數(shù)關(guān)系；大大降低實驗室“污染”的可能性。無需后續(xù)處理產(chǎn)物，可分樣本處理區(qū)，加樣去，檢測區(qū)三區(qū)即可。第36頁/共39頁第三十六頁，共40頁。定性檢測 （A或B？有或無？是什么？）特定病原的檢測疾病的診斷GMO檢測基因分型（如SNP、耐藥性檢測）辨別真?zhèn)蔚臋z測定量分析 (有多少？差幾倍？）絕對定量 病原載量的定量GMO成分的評估殘留DNA的測定 相對定量基因表達(dá)差異的比較治療手段的效果評估實時熒光定