藥物分析第6章藥物含量測(cè)定方法

化學(xué)分析法

重量分析容量分析含量測(cè)定儀器分析法效價(jià)測(cè)定（生物學(xué)法）紫外高效液相色譜法氣相色譜法第1頁(yè)/共39頁(yè)第一頁(yè)，共40頁(yè)。

第1節(jié)容量分析法（滴定法）1.滴定分析：是將一種已知準(zhǔn)確濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加到被溶液中，直到化學(xué)反應(yīng)完全為止，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和體積求得被測(cè)組份含量的一種方法。在進(jìn)行滴定分析時(shí)：一方面要會(huì)配制滴定劑溶液并能準(zhǔn)確測(cè)定其濃度另一方面要準(zhǔn)確測(cè)量滴定過(guò)程中所消耗滴定劑的體積第2頁(yè)/共39頁(yè)第二頁(yè)，共40頁(yè)。⑴滴定：將滴定液從滴定管滴加到被測(cè)物質(zhì)溶液中的過(guò)程⑵化學(xué)計(jì)量點(diǎn)：滴加的標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測(cè)物質(zhì)按照一定的化學(xué)反應(yīng)式定量反應(yīng)完全之點(diǎn)⑶滴定終點(diǎn)：在滴定過(guò)程中，指示劑正好發(fā)生顏色變化的轉(zhuǎn)變點(diǎn)。⑷指示劑：能夠指示終點(diǎn)變化的試劑。⑸滴定誤差：滴定終點(diǎn)與化學(xué)計(jì)量點(diǎn)不一定恰好符合，它們之間存在著很小的差別，由此引起測(cè)定結(jié)果的誤差稱(chēng)為滴定誤差。（6）標(biāo)準(zhǔn)溶液已知準(zhǔn)確濃度的溶液（mol/L）第3頁(yè)/共39頁(yè)第三頁(yè)，共40頁(yè)。2.滴定液的配制和標(biāo)定基準(zhǔn)物質(zhì)：能用來(lái)直接配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的化學(xué)試劑滴定度：每毫升標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于被測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量（g或mg），以符號(hào)T表示直接法（不需標(biāo)定）間接法（標(biāo)定）：先將其配制成近似于所需濃度的溶液，然后利用基準(zhǔn)物質(zhì)或另一種標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)確定其準(zhǔn)確濃度。第4頁(yè)/共39頁(yè)第四頁(yè)，共40頁(yè)。標(biāo)定：用基準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確測(cè)定滴定液濃度的過(guò)程。校正因子（F）：表示滴定液準(zhǔn)確濃度與標(biāo)示濃度的比值。其范圍應(yīng)在1.05～0.95之間，超出該范圍應(yīng)加入適當(dāng)?shù)娜苜|(zhì)或溶劑予以調(diào)整，并重新標(biāo)定。第5頁(yè)/共39頁(yè)第五頁(yè)，共40頁(yè)。標(biāo)定注意事項(xiàng)：a.操作中所用的天平、滴定管、容量瓶和移液管均應(yīng)校正合格的。b.標(biāo)定工作應(yīng)在室溫（10℃～30℃）下進(jìn)行，并記錄標(biāo)定時(shí)的溫度。c.根據(jù)滴定液的消耗量選用適宜的滴定管，盛裝滴定液前，先用少量滴定液淋洗三次，盛裝滴定液后，應(yīng)用小燒杯蓋住管口。d.標(biāo)定中的空白試驗(yàn)，是指在不加供試品或以等量溶劑代替供試液的情況下，按同法滴定所得的結(jié)果。e.標(biāo)定工作應(yīng)由初標(biāo)者和復(fù)標(biāo)者在相同條件下各做3份平行試驗(yàn)，3份平行試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不得大于0.1%；初標(biāo)者的平均值和復(fù)標(biāo)者的平均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）也不得大于0.1%；最后結(jié)果按初、復(fù)標(biāo)二者的平均值計(jì)算，取4位有效數(shù)字。f.配制后的滴定液按藥典規(guī)定的貯藏條件儲(chǔ)存，并在瓶外貼上標(biāo)簽，注明滴定液名稱(chēng)、標(biāo)示濃度、真實(shí)濃度或F值、配制和標(biāo)定日期、標(biāo)定時(shí)的溫度、配制者、標(biāo)定者、復(fù)標(biāo)者等。g.當(dāng)?shù)味ㄒ簶?biāo)定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（一般不超過(guò)3個(gè)月）、或標(biāo)定與使用時(shí)的溫度超過(guò)10℃時(shí)，應(yīng)加溫度補(bǔ)償值或重新進(jìn)行標(biāo)定，。h.當(dāng)?shù)味ㄒ撼霈F(xiàn)渾濁或其他異常情況時(shí)，不得使用。倒出剩余的滴定液不得再倒回原瓶，避免污染。第6頁(yè)/共39頁(yè)第六頁(yè)，共40頁(yè)。3.滴定的分類(lèi)按反應(yīng)方式分類(lèi)：直接滴定法：滴定液與被測(cè)物質(zhì)直接反應(yīng)間接滴定法：包括剩余滴定和置換滴定含量%=含量%=第7頁(yè)/共39頁(yè)第七頁(yè)，共40頁(yè)。按反應(yīng)類(lèi)型分：酸堿滴定：在水溶液中以酸堿中和反應(yīng)來(lái)測(cè)定物質(zhì)含量的方法配位（絡(luò)合）滴定法：以形成穩(wěn)定配合物的配位反應(yīng)為基礎(chǔ)的滴定分析法。用于金屬離子的測(cè)定采用金屬指示劑（如鉻黑T），如EDTA（乙二胺四醋酸二鈉）氧化還原滴定法：

碘量法：如碘滴定液、硫代硫酸鈉滴定液、淀粉指示劑鈰量法：以硫酸鈰[Ce（S04）2]作為滴定液、鄰二氮菲作指示劑亞硝酸鈉滴定法：溴量法：Na2S2O3滴定液、Br2滴定液第8頁(yè)/共39頁(yè)第八頁(yè)，共40頁(yè)。沉淀滴定法：以沉淀反應(yīng)為基礎(chǔ)，多以硝酸銀為滴定液，也稱(chēng)銀量法。按所用指示劑的不同分為鉻酸鉀指示劑法鐵銨礬指示劑法吸附指示劑法非水滴定法：在非水溶劑（有機(jī)溶劑與不含水的無(wú)機(jī)溶劑）中進(jìn)行滴定分析的方法。

非水堿量法：是以冰醋酸為溶劑，高氯酸為滴定液，甲紫微指示劑，測(cè)定弱堿性藥物及其鹽類(lèi)非水酸量法：是在堿性溶液中，以甲醇鈉為滴定液，麝香草酚藍(lán)為指示劑，二甲基甲酰胺等為溶劑，滴定弱酸性藥物第9頁(yè)/共39頁(yè)第九頁(yè)，共40頁(yè)。

第2節(jié)分光光度法分光光度法:

是通過(guò)測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度或發(fā)光強(qiáng)度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。光是電磁波,常用的波長(zhǎng)范圍為：(1)200～400nm----紫外光區(qū)；(2)400～760nm----可見(jiàn)光區(qū)；(3)760～2500nm（12800cm-1～4000cm-1）----近紅外光區(qū)（4）2.5～25μm（按波數(shù)計(jì)為4000cm-1～400cm-1）----紅外光區(qū)。第10頁(yè)/共39頁(yè)第十頁(yè)，共40頁(yè)。

紫外-可見(jiàn)分光光度法

物質(zhì)吸收紫外和可見(jiàn)光區(qū)的電磁波產(chǎn)生的吸收光譜進(jìn)行定性和定量分析的方法1.基本原理：朗伯─比耳定律

A為吸收度；T為透光率；L為液層厚度，單位為cm；E為吸收系數(shù)，常用的是百分吸收系數(shù)()，其物理意義為當(dāng)溶液濃度為1％(g/ml)，液層厚度為1cm時(shí)的吸收度值；C為100ml溶液中所含被測(cè)物質(zhì)的量g（按干燥品或無(wú)水物計(jì)算）第11頁(yè)/共39頁(yè)第十一頁(yè)，共40頁(yè)。2.儀器的基本結(jié)構(gòu)光源：200～400nm為紫外光區(qū)（氘燈）、400～850nm為可見(jiàn)光區(qū)（鎢燈）3.儀器的校正和檢定（1）波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度（2）吸收度的準(zhǔn)確度（3）雜散光的檢查光源單色器吸收池檢測(cè)器數(shù)據(jù)記錄處理第12頁(yè)/共39頁(yè)第十二頁(yè)，共40頁(yè)。4.吸光度的測(cè)定《中國(guó)藥典》2010版對(duì)吸光度的測(cè)定做了以下要求：（1）溶劑：

（2）空白試驗(yàn)校正：（3）測(cè)定波長(zhǎng)的檢查（4）供試品溶液的濃度：應(yīng)考慮使吸光度在0.3～0.7范圍內(nèi)（5）狹縫寬度的選擇第13頁(yè)/共39頁(yè)第十三頁(yè)，共40頁(yè)。5.應(yīng)用（1）鑒別和檢查：比較吸收光譜的特征參數(shù)、吸光度比值、吸收光譜的一致性（2）含量測(cè)定：a.對(duì)照品比較法：

b.吸收系數(shù)法：c.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法：借助電腦的Excel電子表格計(jì)算含量%=第14頁(yè)/共39頁(yè)第十四頁(yè)，共40頁(yè)。6.注意事項(xiàng)（1）空白溶液與供試品溶液必須澄清，不得有渾濁。如有渾濁，應(yīng)預(yù)先過(guò)濾，并棄去初濾液。（2）測(cè)定時(shí)，除另有規(guī)定外，應(yīng)以配制供試品溶液的同瓶溶劑為空白對(duì)照，采用1cm的石英吸收池。（3）在測(cè)定時(shí)或改測(cè)其它檢品時(shí)，應(yīng)用待測(cè)溶液沖洗吸收池3～4次，用干凈綢布或擦鏡紙擦凈吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨損），放入樣品室每次方向應(yīng)一致。（4）取吸收池時(shí)，應(yīng)拿毛玻璃兩面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。使用完后及時(shí)用測(cè)定溶劑沖凈，再用純化水沖凈，用干凈綢布或擦鏡紙擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防塵保存。若吸收池內(nèi)外壁沾污，用脫脂棉纏在細(xì)玻璃棒上蘸上乙醇，輕輕擦試，再用純化水沖凈。（5）務(wù)必注意經(jīng)常保持硅膠的干燥，目的是保護(hù)光學(xué)元件和光電放大器系統(tǒng)不致受潮損壞而影響儀器的正常工作。（6）儀器經(jīng)過(guò)搬動(dòng)請(qǐng)及時(shí)檢查并糾正波長(zhǎng)精度，并應(yīng)經(jīng)常校準(zhǔn)波長(zhǎng)精度。第15頁(yè)/共39頁(yè)第十五頁(yè)，共40頁(yè)。第3節(jié)色譜分析法色譜法的分離過(guò)程：是被分離組分在互不相溶的兩相間分配平衡的過(guò)程，由于混合物中各組分的分配系數(shù)不同，或被吸附劑吸附能力的不同，則被流動(dòng)相攜帶移動(dòng)的速度也不同，達(dá)到分離的目的。液相色譜法：以液體為流動(dòng)相氣相色譜法：以氣體為流動(dòng)相第16頁(yè)/共39頁(yè)第十六頁(yè)，共40頁(yè)。一、高效液相色譜法高效液相色譜法：采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱將待測(cè)組分進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法?；瘜W(xué)鍵合相色譜：最廣泛的將固定相的官能團(tuán)鍵合在載體上，形成的固定相，一般屬于分配色譜法，不易流失

第17頁(yè)/共39頁(yè)第十七頁(yè)，共40頁(yè)。（一）基本概念：1.色譜圖：信號(hào)---時(shí)間曲線(xiàn)2.基線(xiàn)：無(wú)樣品時(shí)，用流動(dòng)相沖洗檢測(cè)出的流出曲線(xiàn)，一般平行于時(shí)間軸3.噪聲：基線(xiàn)信號(hào)的波動(dòng)4.漂移：基線(xiàn)隨時(shí)間的變化5.色譜峰：6.拖尾因子：衡量色譜峰的對(duì)稱(chēng)性，應(yīng)為0.95-1.057.峰寬：8.半峰寬9.標(biāo)準(zhǔn)偏差10.峰面積11.保留時(shí)間12.理論塔板數(shù)（柱效）：表示色譜柱的分離效率第18頁(yè)/共39頁(yè)第十八頁(yè)，共40頁(yè)。（二）基本原理待分離物質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配時(shí)，在固定相中溶解度較小的組分，在色譜柱中向前遷移速度較快；在固定相中溶解度較大的組分，在色譜柱中向前遷移速度較慢，從而達(dá)到分離的目的。依固定相與流動(dòng)相極性的不同，分為正相色譜和反相色譜1.正相色譜法

流動(dòng)相極性小于固定相一般用極性物質(zhì)作固定相，非極性溶劑(如苯、正己烷等)作流動(dòng)相，主要用于分離極性化合物，極性小的組分先流出，極性大的組分后流出。2.反相色譜法

流動(dòng)相極性大于固定相一般用非極性物質(zhì)作固定相，極性溶劑(如水、甲醇、己腈等)作流動(dòng)相，主要用于分離非極性或弱極性化合物，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。第19頁(yè)/共39頁(yè)第十九頁(yè)，共40頁(yè)。（三）固定相和流動(dòng)相1.固定相

常用化學(xué)鍵合相，分極性和非極性鍵合相，如十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18或ODS）和辛基硅烷鍵合硅膠（C8）為最常用的非極性鍵合相，用于反相色譜法；氨基和氰基硅烷鍵合相為常用的極性鍵合相，用于正相色譜法。2.流動(dòng)相有機(jī)溶劑+水混合一般為色譜純?cè)噭?，?jīng)0.45um的微孔濾膜過(guò)濾，需脫氣處理第20頁(yè)/共39頁(yè)第二十頁(yè)，共40頁(yè)。（四）儀器的基本結(jié)構(gòu)

第21頁(yè)/共39頁(yè)第二十一頁(yè)，共40頁(yè)。日本島津液相色譜儀第22頁(yè)/共39頁(yè)第二十二頁(yè)，共40頁(yè)。1.色譜柱柱管-不銹鋼，填充硅膠和化學(xué)鍵合固定相內(nèi)徑4.6mm長(zhǎng)15cm、20cm和25cm的三種，如安捷倫色譜柱、迪馬色譜柱、迪馬鉆石柱等。第23頁(yè)/共39頁(yè)第二十三頁(yè)，共40頁(yè)。色譜柱的維護(hù)1.最好使用預(yù)柱保護(hù)分析柱；2.大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2－7.5，盡量不超過(guò)該色譜柱的pH范圍；3.避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化；4.樣品要采用0.22或0.45μm濾膜過(guò)濾，流動(dòng)相采用0.45μm濾膜過(guò)濾并脫氣；5.每次做完分析，要進(jìn)行沖洗：分析用流動(dòng)相中若無(wú)酸、堿、鹽類(lèi)物質(zhì)，建議用90％甲醇沖洗30～60min；

如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，要先用10％甲醇沖洗1小時(shí)左右，再梯度走到90％甲醇沖洗30～60min（若用多元泵）。若長(zhǎng)時(shí)間不用該色譜柱，要沖洗好后，用純甲醇或乙腈封存；6.若流動(dòng)相中用到離子對(duì)試劑，更應(yīng)該好好沖洗，且該色譜柱最好作為專(zhuān)用，不能再做其它物質(zhì)分析用；7.普通C18柱盡量避免在40℃以上的溫度下分析；8.壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號(hào)。第24頁(yè)/共39頁(yè)第二十四頁(yè)，共40頁(yè)。2.檢測(cè)器常用紫外檢測(cè)器其次有二極管陣列檢測(cè)器(DAD)熒光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢側(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器等

第25頁(yè)/共39頁(yè)第二十五頁(yè)，共40頁(yè)。（五）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)定義：指用規(guī)定的對(duì)照品對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，應(yīng)符合要求。包括理論板數(shù)分離度重復(fù)性拖尾因子等第26頁(yè)/共39頁(yè)第二十六頁(yè)，共40頁(yè)。1.理論板數(shù)(N)：說(shuō)明分離過(guò)程，色譜柱的塔板數(shù)越多，柱效越高2.分離度(R)：應(yīng)大于1.53.重復(fù)性：相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%4.拖尾因子(T)：符合規(guī)定第27頁(yè)/共39頁(yè)第二十七頁(yè)，共40頁(yè)。

（六）在雜質(zhì)檢查和含量測(cè)定中的應(yīng)用1.內(nèi)標(biāo)法2.外標(biāo)法

第28頁(yè)/共39頁(yè)第二十八頁(yè)，共40頁(yè)。進(jìn)樣操作第29頁(yè)/共39頁(yè)第二十九頁(yè)，共40頁(yè)。3.加校正因子的主成分自身對(duì)照法（測(cè)定雜質(zhì)含量）4.不加校正因子的主成分自身對(duì)照法（無(wú)雜質(zhì)對(duì)照品）5.面積歸一化法（只能用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量）第30頁(yè)/共39頁(yè)第三十頁(yè)，共40頁(yè)。二、氣相色譜法1.分離原理注入進(jìn)樣口的樣品經(jīng)加熱氣化后，被載氣帶入色譜柱，由于其分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離，各組分先后進(jìn)入檢測(cè)器，信號(hào)記錄儀、積分儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)。分配系數(shù)小的組分先流出，分配系數(shù)大的組分后流出。第31頁(yè)/共39頁(yè)第三十一頁(yè)，共40頁(yè)。2.色譜儀的基本結(jié)構(gòu)由載氣源、進(jìn)樣器、色譜柱、柱溫箱、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成第32頁(yè)/共39頁(yè)第三十二頁(yè)，共40頁(yè)。1.載氣（流動(dòng)相）：

如氦、氮和氫等2.進(jìn)樣器：直接進(jìn)樣或頂空進(jìn)樣

微量注射器第33頁(yè)/共39頁(yè)第三十三頁(yè)，共40頁(yè)。3.固定相和載體

色譜柱為填充柱或毛細(xì)管柱常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例組成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。*新填充柱和毛細(xì)管柱在使用前需老化以除去殘留溶劑及