蛋白質(zhì)化學(xué)總復(fù)習(xí)

《蛋白質(zhì)化學(xué)》總復(fù)習(xí)課程內(nèi)容第二章蛋白質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、加工與修飾第三章蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能第四章蛋白質(zhì)的分離純化第五章蛋白質(zhì)定性定量檢測第六章蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)第七章蛋白質(zhì)組學(xué)理論與進(jìn)展第八章蛋白質(zhì)芯片理論與進(jìn)展第二章蛋白質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、加工與修飾基本概念SD序列/核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）信號肽分子伴侶回答問題：1．蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)合成時所涉及的幾個重要元素是什么？它們的結(jié)構(gòu)特征及其在蛋白質(zhì)生物合成中的作用如何？2．原核生物中蛋白質(zhì)合成過程分哪幾個階段？對每個階段的過程描述；每個階段所涉及的輔助因子及其功能？3.原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的核糖體理化性質(zhì)比較4．蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)跨膜位移過程中所涉及的重要元素有哪些？它們的結(jié)構(gòu)特征及其在蛋白跨膜機(jī)制中的作用如何？（簡述分泌性蛋白質(zhì)跨膜移位的信號假說）5．蛋白質(zhì)合成后一級結(jié)構(gòu)上和高級結(jié)構(gòu)上的修飾有哪些？理解分子伴侶的概念及其在蛋白折疊中的作用。（蛋白質(zhì)合成后的加工與修飾）第二章主要內(nèi)容1．蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)合成時所涉及的幾個重要元素2．原核生物中蛋白質(zhì)合成過程3．蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)跨膜位移過程4.蛋白質(zhì)合成后的修飾1．蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)合成時所涉及的幾個重要元素（1）信使RNA（messengerRNA,mRNA）（2）遺傳密碼（3）核糖體（4）轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transferRNA,tRNA）（1）信使RNA（messengerRNA,mRNA）SD序列/核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）：原核細(xì)胞mRNA的翻譯起始密碼子AUG的上游相距8～13個核苷酸處有一段由6～8個核苷酸組成的富含嘌呤的序列，以5’-AGGAGG-3’為核心，它與核糖體小亞基上的16S-rRNA的近3’末端處的一段短序列互補(bǔ)。（2）遺傳密碼三聯(lián)體密碼（tripletcode）/密碼子（codon）：mRNA采用每三個相鄰堿基編碼一個氨基酸。61個密碼分別代表各種氨基酸（aminoacid，aa）。一種aa少的只有1個密碼（色氨酸和蛋氨酸），多的可有6個，但以2個和4個居多。終止密碼子：UAA、UGA和UAG。起始密碼子/蛋氨酸密碼子：AUG（91％）/GUG（8％）。遺傳密碼的特點(diǎn)：遺傳密碼的連續(xù)性、通用性、簡并性、擺動性、不重疊性（3）核糖體核糖體上的4個活性部位：受位/A位：氨?；稽c(diǎn)。即接受氨酰-tRNA的部位。供位/P位：肽?；稽c(diǎn)。肽基-tRNA移交肽鏈后，tRNA被釋放的部位。肽基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)肽酶位：肽鏈合成過程中催化形成肽鍵的酶活性部位。GTP酶位：可水解GTP，為催化肽基-tRNA由A位轉(zhuǎn)到P位提供能量的酶活性部位。核糖體的存在形式：核糖體單體——無蛋白合成功能多聚核糖體：與mRNA結(jié)合——具有蛋白合成功能游離核糖體結(jié)合核糖體（與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合）原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的核糖體理化性質(zhì)比較（見課件）（4）轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transferRNA,tRNA）特點(diǎn)：分子量較小，沉降系數(shù)約為4S，約占細(xì)胞中RNA總含量的10～15％，在蛋白質(zhì)合成時起搬運(yùn)氨基酸的作用。它對不同的氨基酸有特異性，一種tRNA只能搬運(yùn)一種氨基酸。與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的位點(diǎn)氨基酸（aa）結(jié)合位點(diǎn)反密碼子位點(diǎn)識別aa-tRNA合成酶的位點(diǎn)。翻譯過程中行使“起動”作用的tRNA：能特異地識別起始密碼子AUG——蛋氨酰-tRNA（真核細(xì)胞）；甲酰蛋氨酰-tRNA（原核細(xì)胞或線粒體）氨酰-tRNA合成酶的專一性：對aa有極高的專一性，每種aa都有一個專一的酶。只作用于L-氨基酸，不作用于D-氨基酸。有的酶對aa的專一性并不很高，但對tRNA卻有極高的專一性。2．原核生物中蛋白質(zhì)合成過程（1）起始過程（2）肽鏈延伸（3）肽鏈合成的終止與釋放（4）原核生物中蛋白質(zhì)合成過程所涉及的蛋白因子（1）起始過程①大小亞基分開（在IF-3作用下）；②mRNA與小亞基結(jié)合③形成30S起始復(fù)合物：在IF-2作用下，fMet-tRNAt與mRNA分子中的AUG相結(jié)合（在P位上），即密碼子與反密碼子配對，形成30S起始復(fù)合物）④大小亞基結(jié)合，形成有生物學(xué)功能的70S起始復(fù)合物。此時核糖體的Ｐ位被fMet-tRNA和ＡＵＧ占據(jù)；而A位則空著，有待于對應(yīng)mRNA中第二個密碼的相應(yīng)氨基酰tRNA進(jìn)入，從而進(jìn)入延伸階段。（2）肽鏈延伸①進(jìn)位：Tu-GTP與aa2-tRNA2結(jié)合成復(fù)合物；aa2-tRNA2與A位點(diǎn)上mRNA密碼子結(jié)合；重新生成Tu-GTP。②肽鍵形成：在轉(zhuǎn)肽酶作用下，形成肽鍵，成2肽；P位點(diǎn)上fMet與tRNA脫離；此時，P位空出。③移位：在移位酶(G)作用下，消耗1個GTP,核糖體沿mRNA5’→3’移動了1個密碼子的距離.；A位上的肽酰-tRNA到P位，原來P位上無負(fù)載的tRNA離開核糖體。(此時核糖體的A位空著，有待于接受下一個aan-tRNAn)重復(fù)至肽鏈必需長度。（3）肽鏈合成的終止與釋放①RF與mRNA終止信號結(jié)合，激活轉(zhuǎn)肽酶；②水解肽鏈和tRNA間的鍵，新合成肽鏈、tRNA、mRNA離開核糖體，后者即解離成大、小亞基，進(jìn)入下一輪反應(yīng)。（4）原核生物中蛋白質(zhì)合成過程所涉及的蛋白因子①起始因子（IF1、IF2、IF3）IF1：無專門功能，協(xié)助IF2和IF3的作用。IF2：IF2先與GTP結(jié)合，再結(jié)合fmet-tRNA，形成fmet-tRNA-IF2-GTP復(fù)合物，同時推動mRNA在30S亞基上移動，使fmet-tRNA到達(dá)P位。IF3：翻譯起始時結(jié)合于核糖體30S亞基靠近50S亞基的邊界，使大小亞基拆離。②延長因子（EF）EF-Tu：按mRNA編碼序列攜帶氨酰-tRNA進(jìn)入A位。EF-Ts：使EF-Tu和GTP再生，參與肽鏈延長。EFG：具有轉(zhuǎn)位酶活性。使肽酰-tRNA從A位轉(zhuǎn)移到P位。③釋放因子（RF，RR）RF：辨認(rèn)終止密碼子和促進(jìn)肽鏈C端與tRNA3’-OH酯鍵的水解，使肽鏈從翻譯中的核糖體上釋放下來。RF1：辨認(rèn)UAA和UAG，進(jìn)入A位。RF2：辨認(rèn)UAA和UGA，進(jìn)入A位。RF3：激活核糖體上的轉(zhuǎn)肽酶。轉(zhuǎn)肽酶受RF3作用后發(fā)生變構(gòu)，表現(xiàn)出酯酶的水解活性，水解肽酰-tRNA之間的酯鍵，使P位上的肽與tRNA分離。RR：使tRNA、mRNA及RF均從核糖體脫落。3．蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)跨膜位移過程（1）信號假說中涉及的幾個重要元素信號肽信號識別顆粒（SRP）

SRP受體（SRP-R）移位子（易位子）（2）蛋白質(zhì)跨膜位移的機(jī)制信號肽與SRP結(jié)合→肽鏈延伸暫時終止→SRP與受體結(jié)合→SRP脫離信號肽→肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上繼續(xù)合成，同時信號肽引導(dǎo)新生肽鏈進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔→信號肽切除→肽鏈延伸至終止。4.蛋白質(zhì)合成后的加工與修飾（1）一級結(jié)構(gòu)的加工與修飾共價修飾蛋白質(zhì)前體的剪切。包括信號肽、前導(dǎo)肽或插入肽的剪切。氨基酸側(cè)鏈的共價修飾。糖基化、羧基化、磷酸化、乙?；?、甲基化、二硫鍵的形成（多肽鏈內(nèi)或鏈間）和脂基化等。去除N-甲?；騈-蛋氨酸。水解修飾。指一條多肽鏈經(jīng)翻譯后加工產(chǎn)生多種不同活性的蛋白質(zhì)或肽。（2）高級結(jié)構(gòu)的加工與修飾蛋白質(zhì)亞基的聚合——具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)由兩條以上的肽鏈通過非共價鍵聚合，形成寡聚體蛋白質(zhì)。輔基鏈接——形成結(jié)合蛋白質(zhì)。分子伴侶（molecularchaperones）：一類參與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊、聚合和解聚、錯誤折疊后的重新折疊、水解以及原始蛋白質(zhì)活性的調(diào)控等一系列功能的保守蛋白質(zhì)家族。第三章蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能基本概念氨基酸（aa）的結(jié)構(gòu)物質(zhì)的構(gòu)型和構(gòu)象肽鍵與異肽鍵肽單元/肽鍵平面蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)生物學(xué)蛋白質(zhì)工程回答問題：1．蛋白質(zhì)的各種結(jié)構(gòu)層次的基本概念和特點(diǎn)？2.肽鍵和異肽鍵的區(qū)別？肽鍵的結(jié)構(gòu)特征。3.二級結(jié)構(gòu)的分類及其形成的內(nèi)在原因？α-螺旋的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?β-折疊/β-片層的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?β-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?4.蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)及其組合方式；超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的區(qū)別與聯(lián)系。5.維系蛋白三級結(jié)構(gòu)的主要作用力有哪些？什么情況下蛋白質(zhì)存在四級結(jié)構(gòu)？6．蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能有哪些？7．結(jié)構(gòu)生物學(xué)的基本概念？蛋白質(zhì)工程的基本概念？蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別與聯(lián)系？第三章主要內(nèi)容1．蛋白質(zhì)的各種結(jié)構(gòu)層次2．蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能3．結(jié)構(gòu)生物學(xué)1．蛋白質(zhì)的各種結(jié)構(gòu)層次蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位

——氨基酸和肽鍵

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)：在多肽鏈內(nèi)順序上相互鄰近的二級結(jié)構(gòu)常常在空間折疊中靠近，彼此相互作用，形成規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)組合體。它們可直接作為三級結(jié)構(gòu)的“建筑塊”或結(jié)構(gòu)域的組成單位，是蛋白質(zhì)構(gòu)象中二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)之間的一個層次，故稱超二級結(jié)構(gòu)。目前發(fā)現(xiàn)的超二級結(jié)構(gòu)有三種組合方式：α-螺旋組合(αα)；β-折疊組合(ββ)和α-螺旋β-折疊組合(βαβ)，其中以βαβ組合最為常見。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域：是蛋白質(zhì)構(gòu)象中二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)之間的一個層次。在較大的蛋白質(zhì)分子中，由于多肽鏈上相鄰的超二級結(jié)構(gòu)緊密聯(lián)系，形成二個或多個在空間上可以明顯區(qū)別它與蛋白質(zhì)亞基結(jié)構(gòu)的區(qū)域。一般每個結(jié)構(gòu)域約由100～200個氨基酸殘基組成，各有獨(dú)特的空間構(gòu)象，并承擔(dān)不同的生物學(xué)功能。

蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)

2．蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能

酶的催化機(jī)械支持運(yùn)輸和儲存協(xié)調(diào)動作免疫保護(hù)生長和分化的控制神經(jīng)沖動的傳遞細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)跨膜運(yùn)輸電子傳遞3．結(jié)構(gòu)生物學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)：以分子生物物理學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合化學(xué)和分子生物學(xué)方法測定生物大分子復(fù)合體的空間結(jié)構(gòu)、精細(xì)結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)的運(yùn)動，闡明其相互作用的規(guī)律和發(fā)揮生物功能的機(jī)制，從而揭示生命現(xiàn)象本質(zhì)的科學(xué)。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究方法借助現(xiàn)代分析手段（X線晶體學(xué)、核磁共振及電子晶體學(xué)等）直接得到蛋白質(zhì)三維構(gòu)象的信息；借助數(shù)學(xué)模型、計算機(jī)軟件等工具，根據(jù)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)來預(yù)測其空間結(jié)構(gòu)。利用蛋白質(zhì)工程的技術(shù)手段，得到非天然存在的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程是指通過蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)和蛋白質(zhì)動力學(xué)等研究獲取關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和物化性質(zhì)等方面的信息，在此基礎(chǔ)上對編碼該蛋白的基因進(jìn)行有目的的設(shè)計改造，并通過基因工程等手段將其進(jìn)行表達(dá)和分離純化，最終將其投入實(shí)際應(yīng)用。它以現(xiàn)有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，以制造具有新性能的新型蛋白質(zhì)為最終目的。第四章蛋白質(zhì)的分離純化基本概念蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的變性、蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的沉淀、鹽析法蛋白質(zhì)的結(jié)絮作用、蛋白質(zhì)的凝固蛋白質(zhì)的紫外吸收、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)差速離心、密度梯度離心聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、SDS梯度膠電泳等電聚焦電泳（IEF）IEF/SDS聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳（2-DE）毛細(xì)管電泳

回答問題：1．蛋白質(zhì)有哪些理化性質(zhì)？等電點(diǎn)、酸性蛋白、堿性蛋白的概念？可逆沉淀和不可逆沉淀、可逆變性和不可逆變性的概念？2．蛋白質(zhì)分離純化的常用方法有哪些？理解每種方法的基本原理和分類——分離純化蛋白質(zhì)樣品的常用沉淀法有哪幾種？膜分離法的分類。3．電泳技術(shù)的基本原理和分類？常用的幾種電泳技術(shù)——聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳及毛細(xì)管電泳的基本原理和特點(diǎn)。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）中制備凝膠所涉及的組分及其作用；蛋白質(zhì)被PAGE電泳所分離主要基于的效應(yīng)；SDS的原理/SDS在SDS中的主要作用。4.IEF/SDS與其單相電泳具體操作的差別；電泳后蛋白質(zhì)的回收方法。第四章主要內(nèi)容1.蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)2.蛋白質(zhì)分離純化的常用方法3.電泳技術(shù)1．蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

（1）蛋白質(zhì)的兩性電離特性

（2）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

（3）蛋白質(zhì)的沉淀特性

（4）蛋白質(zhì)的變性

（5）蛋白質(zhì)的紫外吸收特性

（6）蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)

（1）蛋白質(zhì)的兩性電離特性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。酸性蛋白（pI<7）和堿性蛋白（pI>7）當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液的pH大于等電點(diǎn)時，該蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，反之則帶正電荷。（2）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

由于蛋白質(zhì)屬高分子物質(zhì)（分子量范圍10—1000kDa），它在水中的顆粒大小約1—100nm，能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)形成親水膠體溶液的穩(wěn)定因素：分子表面的水化層和電荷層。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如擴(kuò)散慢、黏度大、不能透過半透膜等應(yīng)用：由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。（3）蛋白質(zhì)的沉淀特性蛋白質(zhì)的沉淀：蛋白質(zhì)分子凝聚而從溶液中析出的現(xiàn)象?？赡娉恋恚涸诔恋磉^程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀（或可逆沉淀）。不可逆沉淀：在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。（4）蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性：在某些物理或化學(xué)因素作用下，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象破壞（不包括肽鏈的斷裂等一級結(jié)構(gòu)變化），導(dǎo)致蛋白質(zhì)若干理化性質(zhì)和生物學(xué)活性的改變。可逆變性：蛋白質(zhì)在變性后，除去變性因素仍可恢復(fù)其活性，稱為可逆變性（可逆變性也是蛋白純化中常用的一種手段）。不可逆變性：蛋白質(zhì)變性時其空間結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，除去變性因素后不能恢復(fù)其生物學(xué)活性，稱為不可逆變性。蛋白質(zhì)變性的因素：物理因素：高溫、高壓、紫外線、X射線照射、超聲波、劇烈震蕩和劇烈攪拌等?；瘜W(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽、有機(jī)溶劑、尿素和十二烷基磺酸鈉（SDS）等。生物學(xué)活性的喪失并不一定完全是變性的結(jié)果，如蛋白質(zhì)肽鏈水解斷裂、去除輔基和應(yīng)用抑制劑等，均可導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活。蛋白質(zhì)的復(fù)性：若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，有些蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原來的構(gòu)象及功能。蛋白質(zhì)變性的發(fā)展結(jié)絮作用：通過強(qiáng)酸/強(qiáng)堿變性后的蛋白，當(dāng)溶液的pH調(diào)到其等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)會形成絮狀的不溶物，稱為蛋白質(zhì)的結(jié)絮作用。凝固作用：結(jié)絮后的蛋白進(jìn)行加熱后會變?yōu)楸容^堅(jiān)固的凝塊，稱為蛋白質(zhì)的凝固作用。如：煮熟的雞蛋、豆腐的形成等。（5）蛋白質(zhì)的紫外吸收特性蛋白質(zhì)分子中有含有共軛雙健的酪氨酸、色氨酸等殘基在280nm波長下具有最大光吸收。因此280nm的光吸收度是蛋白質(zhì)的一種普遍性質(zhì)。在一定波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在280nm吸光度與其濃度成正比，故可作定量測定。（6）蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)

茚三酮反應(yīng)：還原型的茚三酮可與氨基酸加熱分解產(chǎn)生的氨結(jié)合，再于另一分子茚三酮縮合成為藍(lán)紫色的化合物。此化合物的最大吸收峰在570nm波長處。由于此吸收峰值的大小與氨基酸釋放出的氨量成正比，因此可作為氨基酸定量分析方法。雙縮脲反應(yīng)：蛋白質(zhì)和多肽分子在堿性溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，稱為雙縮脲反應(yīng)。2．蛋白質(zhì)分離純化的常用方法（1）離心法（2）沉淀法（3）膜分離法（1）離心法沉降速度法/差速離心：如果兩種蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)相差一個數(shù)量級以上，可用差速離心，反復(fù)多次達(dá)到分離效果。開始在一個較低的速度下離心，使沉降系數(shù)大的物質(zhì)沉淀，其他物質(zhì)仍保留在溶液中。取上清，在更大的離心場中再離心，又會獲得一些沉淀物質(zhì)，如此反復(fù)多次，便可使混合物逐級被分開。密度梯度離心：如果兩種蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)相差不到一個數(shù)量級，用差速離心很難奏效，若改用密度梯度離心，便可獲得比較滿意的分離效果。在離心管中造成一個梯度密度環(huán)境，使介質(zhì)的最大密度大于分離物的最大密度。而后加入待分離物，在離心力的作用下，當(dāng)分離物的密度與介質(zhì)密度相等時，分離物即停留在與其密度相同的區(qū)域，從而達(dá)到分離目的。離心時離心管中的介質(zhì)是不均一的，從近中心到遠(yuǎn)中心密度不斷增加，形成梯度。常用的梯度介質(zhì)有甘油、蔗糖、溴化鉀、氯化銫。（2）沉淀法等電點(diǎn)沉淀法：蛋白質(zhì)分子在等電點(diǎn)時，凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)：可與水混合的有機(jī)溶劑，如酒精、甲醇和丙酮等，對水的親和力很大，能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，在等電點(diǎn)時使蛋白質(zhì)沉淀。鹽析法：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出。常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。有機(jī)聚合物沉淀法：有機(jī)聚合物沉淀劑與水分子通過氫鍵結(jié)合，使溶質(zhì)溶解度降低，從而得到沉淀。沉淀劑為非離子聚合物，如：PEG——聚乙二醇（PEG2000、PEG4000和PEG6000）、PVP及葡聚糖等。（3）膜分離法定義分類根據(jù)推動力不同，可分為：透析法（Dialysis，DS）（以膜兩側(cè)的濃度差為推動力）膜過濾法（以膜兩側(cè)的壓力差為推動力）根據(jù)膜孔徑大小不同，膜過濾法可分為：微過濾（Microfiltration，MF）超濾（Ultrafiltration，UF）

反滲透法（Reverseosmosis，RO）納濾法(Nanofiltration，

NF)

3．電泳技術(shù)（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳（2）等電聚焦電泳（3）雙向凝膠電泳（4）毛細(xì)管電泳（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠的形成原理：是由單體丙烯酰胺（Acrylamide，Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（Bisacrylamide，Bis），在加速劑四甲基乙二胺（TEMED）和催化劑過硫酸銨（AP）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。蛋白質(zhì)被PAGE電泳所分離，主要基于電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。如果緩沖液系統(tǒng)為不連續(xù)系統(tǒng)，還要加上濃縮效應(yīng)（凝膠濃度的不連續(xù)性、離子成分及pH的不連續(xù)性、電位梯度的不連續(xù)性）。當(dāng)所分離的蛋白成分復(fù)雜、分子質(zhì)量范圍較大時，使用濃度梯度PAGE進(jìn)行分離效果更好。濃度梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳是指隨著凝膠濃度逐漸增高，凝膠孔徑逐漸減小，不同大小蛋白質(zhì)分子的移動就會在不同的區(qū)域受阻，形成較窄的區(qū)帶。SDS的原理SDS在SDS中的作用是什么？（2）等電聚焦電泳等電聚焦（isoelectrofocusing，IEF）聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理：等電聚焦就是在電解槽中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時，即形成一個由陽極到陰極逐步增加的pH梯度。蛋白質(zhì)在此體系中因解離而帶不同的電荷，其泳動率也不同。各蛋白質(zhì)分子泳動到各自的等電點(diǎn)時即停止移動，形成很窄的一個區(qū)帶，彼此得以分離。（3）雙向凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳（2-DE）的第一向是等電聚焦電泳，第二向是SDS。IEF/SDS的第一相常用柱狀電泳，第二相常用板狀電泳。雖然IEF/SDS的原理與IEF、SDS單相電泳的原理基本相同，但在具體操作上卻有較大的差別。第一相的電泳分離系統(tǒng)與IEF不同第二相的加樣操作與SDS不同第一相的電泳分離系統(tǒng)與IEF不同第一向相電泳系統(tǒng)中的樣品處理液中加入高濃度的尿素和適量的非離子型去垢劑NP-40，還需加入二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）。這些試劑可破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，使蛋白質(zhì)變性，有利于第二相中蛋白質(zhì)與SDS充分結(jié)合；這些試劑本身并不帶電荷，不會影響蛋白質(zhì)原有的電荷量和等電點(diǎn)。第一向電泳的環(huán)境溫度保持在20～35℃。尿素在低溫時容易析出，在高溫時容易分解。第二相的加樣操作與SDS不同第一向電泳結(jié)束后，凝膠柱用去離子水洗3次，再放入第二向SDS的濃縮膠緩沖液〔含β-巰基乙醇（β-ME）和SDS〕中震蕩平衡。使凝膠柱內(nèi)原有的第一相電泳分離系統(tǒng)被第二相的電泳分離系統(tǒng)所取代。β-ME使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵保持還原狀態(tài)，以便蛋白質(zhì)與SDS充分結(jié)合，從而完成第二向的樣品處理。經(jīng)平衡處理后的凝膠柱包埋在第二相的凝膠板上端，完成第二相電泳的加樣。（4）毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳（CE）是在內(nèi)徑為25～100μm的石英毛細(xì)管中進(jìn)行電泳。它的分離原理是被分離物質(zhì)差速運(yùn)動的結(jié)果。在毛細(xì)管電泳中，物質(zhì)主要有兩種運(yùn)動：電泳和電滲。（理解電滲現(xiàn)象的基本概念）物質(zhì)粒子在毛細(xì)管中的運(yùn)動速度是這兩種運(yùn)動速度之和。通常電滲流的速度是電泳流速度的5～7倍，因而粒子的速度主要由電滲速度決定，因而可以實(shí)現(xiàn)所有的樣品組分向同一方向泳動及正負(fù)離子的同時分離。正離子的泳動方向與電滲方向相同，最先流出；中性離子的泳動速度為零，在正離子后流出；負(fù)離子的泳動方向與電滲方向相反，最后流出。第五章蛋白質(zhì)的定性定量檢測基本概念免疫組織化學(xué)ABC法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）Westernblotting/免疫印跡回答問題：1．免疫組織化學(xué)基本概念和操作過程、顯色反應(yīng)——ABC法的基本原理及其操作過程。2．免疫組織化學(xué)的具體應(yīng)用——酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的基本原理和幾種不同的實(shí)驗(yàn)方法；敘述使用雙抗體夾心法/三明治法檢測某種蛋白質(zhì)的簡要步驟。3．免疫印跡法的基本原理和實(shí)驗(yàn)過程；敘述使用Westernblot/免疫印跡法檢測某種蛋白質(zhì)的簡要步驟4．?dāng)⑹龈鞣N蛋白質(zhì)的定量檢測方法的實(shí)驗(yàn)原理。第五章主要內(nèi)容1.免疫組織化學(xué)2.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）3.免疫印跡法（Westernblotting

）4.各種蛋白質(zhì)的定量檢測方法1.免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)：免疫學(xué)與組織化學(xué)相結(jié)合的一個分支學(xué)科。以免疫學(xué)的抗原-抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的理論，其可作為蛋白質(zhì)定位、定性及半定量檢測的方法之一。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡（包括熒光顯微鏡和電子顯微鏡等）的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等），也可在原位顯示相應(yīng)的基因和基因表達(dá)產(chǎn)物。免疫組織化學(xué)的簡要步驟包括：（1）抗體的制備。1）抗原的提取和純化。2）免疫動物制備多克隆抗體或細(xì)胞融合制備單克隆抗體。3）抗體效價檢測和純化。4）標(biāo)記復(fù)合物的制備。（2）抗原的檢測。1）細(xì)胞或組織切片的制備。2）免疫組織化學(xué)反應(yīng)和顯色。（3）結(jié)果觀察和記錄。ABC法（avidin-biotin-enzymecomplex，ABC）：美籍華人Hsu于1981年首次報道。它是以卵白素作為橋，把生物素化的抗體（二抗）與生物素結(jié)合酶（如生物素標(biāo)記的HRP）連接起來，形成avidin－biotin－enzymecomplex，即ABC。ABC法的操作過程2.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）基本原理：先將已知抗體或抗原結(jié)合在某種固體載體上，并保持其免疫活性；利用標(biāo)記技術(shù)，將酶標(biāo)記到抗體（或抗原）上。測定時，將待測樣本和酶標(biāo)抗體或抗原按不同步驟與固體載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，形成抗體-抗原復(fù)合物；加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其吸光度值的大小進(jìn)行定性或定量分析。實(shí)驗(yàn)方法（分類）間接法（用于測定抗體的常用方法）雙抗體夾心法（用于測定抗原的常用方法）/橋連ABC-ELISA夾心法競爭法（用于測定抗原、半抗原及抗體）使用雙抗體夾心法/三明治法檢測某種蛋白質(zhì)向微孔板內(nèi)加入單克隆抗體進(jìn)行包被，4oC反應(yīng)24-36h。用PBST洗滌3次。加入封閉液，37oC封閉反應(yīng)2h或4oC反應(yīng)過夜。向微孔板內(nèi)加入待側(cè)樣品，37oC反應(yīng)45-60min。用PBST洗滌3次。向微孔板內(nèi)加入酶標(biāo)抗體，37oC反應(yīng)45-60min。用PBST洗滌5次。顯色反應(yīng)。室溫避光反應(yīng)15min。酶標(biāo)議檢測。結(jié)果分析。3．免疫印跡法Westernblotting/免疫印跡：蛋白樣品經(jīng)過SDS分離后，轉(zhuǎn)移到膜上，然后應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測的方法。它是檢測蛋白質(zhì)混合溶液中某種特定目的蛋白的定性方法，也可以作為確定同一種蛋白在不同細(xì)胞或同一種細(xì)胞在不同條件下的相對含量的半定量方法。應(yīng)用：使用Westernblotting/免疫印跡法檢測某種蛋白質(zhì)。使用免疫印跡法檢測某種蛋白質(zhì)用純化的蛋白免疫小鼠，得到某種蛋白特異性的抗血清。制備樣品，用SDS電泳分離。用半干式電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜或NC膜上。將膜在封閉液中室溫反應(yīng)45-60min。轉(zhuǎn)移膜至用封閉液稀釋的蛋白特異性的抗血清（一抗工作液）中，室溫反應(yīng)45-60min。TBST漂洗3×10min。轉(zhuǎn)移膜至用封閉液稀釋的堿性磷酸酶（AP）偶聯(lián)的羊抗鼠IgG（二抗工作液）中，室溫反應(yīng)45-60min。TBST漂洗3×10min。顯色反應(yīng)。將膜浸泡在NBT/BCIP顯色液中，避光靜置，待出現(xiàn)清晰條帶后，把膜轉(zhuǎn)移至蒸餾水中中止反應(yīng)。4．各種蛋白質(zhì)的定量檢測方法凱氏定氮法。雙縮脲法。Folin-酚試劑法（Lowry法）。紫外-分光光度法?？捡R斯亮藍(lán)G-250染色法。BCA法。第六章蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)

理論基本概念序列對比序列的相似性（similarity）序列的同源性（homology）直系同源旁系同源局部和整體相似性序列對比回答問題：1．蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)的概念及內(nèi)容。2．國際上最著名的三大DNA數(shù)據(jù)庫是什么？3.世界上第一個專門從事蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)、功能和蛋白質(zhì)2D圖譜等的分析網(wǎng)站是什么？4．序列對比和數(shù)據(jù)庫搜索的基本概念：同源性和相似性的區(qū)別，數(shù)據(jù)庫搜索和數(shù)據(jù)庫查詢的區(qū)別。5.簡述序列對比的理論基礎(chǔ)。4．較廣泛的序列相似性搜索工具有那些？第六章主要內(nèi)容1．蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)的概念及內(nèi)容2．常用的幾個DNA數(shù)據(jù)庫3．序列對比和數(shù)據(jù)庫搜索4．生物信息學(xué)研究的主要工具1．蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)的概念及內(nèi)容生物信息學(xué)的基本概念廣義上講，生物信息學(xué)是對生物信息的獲取、加工、儲存、發(fā)布、分析和解釋，并綜合運(yùn)用數(shù)學(xué)、計算機(jī)科學(xué)和生物學(xué)等工具，以達(dá)到理解數(shù)據(jù)中的生物學(xué)含義的目標(biāo)。是生物與信息技術(shù)的結(jié)合。狹義上講，生物信息學(xué)是把基因組DNA序列分析作為源頭，找到基因組序列中代表蛋白質(zhì)和RNA基因的編碼區(qū)，闡明非編碼區(qū)的信息實(shí)質(zhì)，破譯隱藏在DNA序列中的遺傳規(guī)律；同時，在此基礎(chǔ)上，歸納、整理與基因組遺傳信息釋放及其調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄譜和蛋白質(zhì)譜的數(shù)據(jù)，從而揭示生命體的生長、發(fā)育、代謝和進(jìn)化的規(guī)律。生物信息學(xué)的研究內(nèi)容建立可以存放和管理大量生物信息學(xué)數(shù)據(jù)集開發(fā)確定大數(shù)據(jù)集中各成員關(guān)系的算法和統(tǒng)計方法，并設(shè)計一些相應(yīng)的工具軟件。使用這些工具來分析和解釋不同類型的生物數(shù)據(jù)，包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)及生化途徑。蛋白質(zhì)生物信息學(xué)的主要內(nèi)容基因功能表達(dá)譜的研究，探討基因在特定時空中的表達(dá)。確定核酸序列中編碼蛋白質(zhì)的基因，了解蛋白質(zhì)的功能及其分子基礎(chǔ)，運(yùn)用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬與分子設(shè)計進(jìn)行功能預(yù)測對已知的各種代謝途徑和相關(guān)的生物分子的結(jié)構(gòu)和功能及它們之間的相互作用進(jìn)行整理，用以研究細(xì)胞發(fā)育、分化途徑和疾病的發(fā)生與發(fā)展的途徑，并將這些信息與生命體和生命過程的生理生化信息相結(jié)合，闡明其分子機(jī)制，最終進(jìn)行蛋白質(zhì)及核酸的分子設(shè)計、藥物設(shè)計和個體化的醫(yī)療保健設(shè)計等。其他。例如，序列對比，結(jié)構(gòu)對比；計算機(jī)輔助基因識別，非編碼區(qū)分析；分子進(jìn)化和比較基因組學(xué)；基因芯片設(shè)計；序列重疊群裝配；生物信息處理并行算法的研究；蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析等等。2．常用的幾個DNA數(shù)據(jù)庫美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫，歐洲生物信息學(xué)研究所（EBI）維護(hù)的EMBL核酸序列數(shù)據(jù)庫日本國立遺傳學(xué)研究所（NIG）建立的日本DNA數(shù)據(jù)庫（DDBJ），并列為國際上最著名的三大DNA數(shù)據(jù)庫。3．序列對比和數(shù)據(jù)庫搜索在生物信息學(xué)研究中，序列對比是最常用和最經(jīng)典的一個研究手段。將研究對象進(jìn)行相互比較來尋找研究對象可能具備的某些特性。從核酸及蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)方面來分析序列的相同點(diǎn)和不同點(diǎn)，從而能夠推測它們的結(jié)構(gòu)、功能及進(jìn)化上的聯(lián)系。序列對比的理論基礎(chǔ)是進(jìn)化學(xué)說。如果基因和蛋白質(zhì)序列之間具有足夠的相似性，就推測兩者可能有共同的進(jìn)化祖先，經(jīng)過序列內(nèi)殘基的替換、缺失以及序列重組等遺傳變異過程分別演化而來。序列的相似性（similarity）：在序列對比中描述兩條序列之間相同堿基或氨基酸殘基所占比例（可進(jìn)行量化）。序列的同源性（homology）：指從大量數(shù)據(jù)中推斷出的兩個基因在進(jìn)化上具有共同祖先的結(jié)論（不可進(jìn)行量化）。在生物信息學(xué)研究中，局部相似性序列對比更合理，應(yīng)用也比較廣泛。其生物學(xué)基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域的高度保守性。所以，通過比較分析保守位點(diǎn)上的殘基可以對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測。4．生物信息學(xué)研究的主要工具

蛋白質(zhì)分析專家系統(tǒng)（ExpertProteinAnalysisSystem，ExPASy）是于1994年由瑞士生物信息學(xué)院（SwissInstituteofBioinformatics，SIB）創(chuàng)立的世界上第一個分子生物學(xué)網(wǎng)站，專門從事蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)、功能和蛋白質(zhì)2D圖譜等的分析。較廣泛的序列相似性搜索工具：FASTA、BLAST和BLITZ等。第七章蛋白質(zhì)組學(xué)理論與進(jìn)展基本概念基因組（genome）DNA微陣列蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組學(xué)表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)串聯(lián)質(zhì)譜肽質(zhì)量指紋譜回答問題：1.蛋白質(zhì)組學(xué)的基本概念及意義。2.蛋白質(zhì)組和基因組的主要區(qū)別。3.蛋白質(zhì)組學(xué)研究的幾個重要的技術(shù)平臺。4.二維電泳的基本原理和實(shí)驗(yàn)過程。5.質(zhì)譜技術(shù)的基本原理和質(zhì)譜儀的組成部分。6.兩種常用的軟電離技術(shù)的基本原理和特點(diǎn)，為什么它們可以用于生命科學(xué)領(lǐng)域的研究？7.幾種常用的質(zhì)量分析器的基本原理和特點(diǎn)。8.質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的基本流程。9.質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)及多肽分析中的應(yīng)用。10.酵母雙雜交的基本原理、缺陷及其發(fā)展。11.蛋白質(zhì)組學(xué)在醫(yī)藥學(xué)中的應(yīng)用。

第七章主要內(nèi)容1.蛋白質(zhì)組學(xué)的基本概念及意義2．蛋白質(zhì)組學(xué)研究的幾種重要的技術(shù)平臺3.蛋白質(zhì)組學(xué)在醫(yī)藥學(xué)中的應(yīng)用1.蛋白質(zhì)組學(xué)的基本概念及意義基因組（genome）：生物體內(nèi)一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和。由基因和基因外的核苷酸序列組成。包括基因組DNA（某些病毒為RNA）、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA和葉綠體DNA。DNA微陣列（DNAMicroarray）又稱為基因芯片（GeneChip）或DNA芯片（DNAChip），是在核酸水平進(jìn)行目的基因表達(dá)規(guī)律研究的方法。它采用原位合成或直接點(diǎn)樣的方法將DNA片段或寡核苷酸片段排列在硅片或玻璃等介質(zhì)上形成微陣列，待檢樣品（cDNA）用熒光分子或同位素標(biāo)記后與微陣列雜交，通過信號掃描及計算機(jī)分析即可獲得樣品中大量的基因序列及表達(dá)信息，以達(dá)到快速、高效和高通量地分析基因表達(dá)規(guī)律的目的。蛋白質(zhì)組：指由一個基因組、細(xì)胞或組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組和基因組的主要區(qū)別：蛋白質(zhì)組是動態(tài)的；基因組是相對恒定的。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）：從整體上研究細(xì)胞或組織內(nèi)，特定的時間和空間內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成及其相互作用規(guī)律的學(xué)科。通過蛋白質(zhì)的定性鑒定、定量檢測、細(xì)胞內(nèi)定位以及相互作用等研究，闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式，最終揭示蛋白質(zhì)功能。蛋白質(zhì)組學(xué)按照研究的內(nèi)容可以分為：表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)和細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)。表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究在不同機(jī)體狀態(tài)中細(xì)胞或組織中全部蛋白質(zhì)的表達(dá)及其變化。細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)主要研究蛋白質(zhì)間的相互作用，以明確細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的復(fù)雜機(jī)制等。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的意義：蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的最終產(chǎn)物和基因功能的實(shí)施者，有其自身特有的活動規(guī)律，例如，蛋白質(zhì)的加工與修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)定位、結(jié)構(gòu)形成、代謝以及蛋白質(zhì)分子之間復(fù)雜的相互作用等，均無法從基因組水平上的研究獲知?；蚪M內(nèi)各個基因的表達(dá)隨著機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的變化呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。即表達(dá)產(chǎn)物的種類和數(shù)量受到嚴(yán)格的調(diào)控而表現(xiàn)時空特異性。不僅在同一機(jī)體的不同發(fā)育階段有明顯的差異，在機(jī)體的不同組織和不同細(xì)胞中，以及生理狀態(tài)和疾病狀態(tài)也各不相同。由于蛋白質(zhì)翻譯后的加工與修飾，基因和蛋白質(zhì)不是1個基因?qū)?yīng)1個蛋白質(zhì)的關(guān)系。1個基因可以產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，而且形式各異。所以，蛋白質(zhì)數(shù)量比基因更大，相互作用也更復(fù)雜。mRNA的豐度并不一定與蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物有直接的關(guān)系。蛋白質(zhì)組學(xué)研究是基因組學(xué)研究的重要補(bǔ)充和延伸。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對揭示生命活動規(guī)律、探討重大疾病機(jī)制、疾病診斷和防治以及新藥的開發(fā)等提供重要的理論基礎(chǔ)。2．蛋白質(zhì)組學(xué)研究的幾種重要的技術(shù)平臺（1）二維電泳（2）質(zhì)譜技術(shù)（3）酵母雙雜交（4）蛋白質(zhì)芯片（1）二維電泳第一向是等電聚焦電泳，第二向是SDS。第一向IEF電泳系統(tǒng)中含有高濃度的尿素和適量的非離子型去垢劑NP-40，而且蛋白質(zhì)樣品處理液中還需含有二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）。這些試劑可破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，使蛋白質(zhì)變性，有利于第二向中蛋白質(zhì)變性后的肽鏈與SDS充分結(jié)合；這些試劑本身并不帶電荷，不會影響蛋白質(zhì)原有的電荷量和等電點(diǎn)。第一向電泳結(jié)束后，凝膠柱用去離子水洗3次，再放入第二向SDS的濃縮膠緩沖液〔含β-巰基乙醇（β-ME）和SDS〕中震蕩平衡。β-ME使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵保持還原狀態(tài)，以便蛋白質(zhì)與SDS充分結(jié)合，從而完成第二向的樣品處理。第一向電泳的環(huán)境溫度保持在20～35℃。尿素在低溫時容易析出，在高溫時容易分解。電泳后蛋白質(zhì)的回收方法包括：擴(kuò)散洗脫和電泳洗脫。（2）質(zhì)譜技術(shù)基本原理質(zhì)譜儀組成軟電離技術(shù)基質(zhì)輔助激光解吸電離源（MALDI）電噴霧電離源（ESI）

質(zhì)量分析器飛行時間（timeofflight，TOF）分析器四極桿分析器離子阱分析器

質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的基本流程樣品制備后進(jìn)行2-DE分析。將感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠上切割下來。凝膠上的蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶消化后，斷裂成多個肽段。所得的肽片段質(zhì)量用MALDI-TOP-MS或ESI-MS進(jìn)行測定。將得到的肽質(zhì)量指紋譜的數(shù)據(jù)在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索。配比的結(jié)果是按照數(shù)據(jù)庫中肽片段與未知蛋白共有的肽片段數(shù)目作一排行榜?！肮谲姟钡鞍踪|(zhì)具有與未知蛋白質(zhì)最相近的組分，從而進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。

肽質(zhì)量指紋譜（peptidemassfingerprint，PMF）由Henzel等人于1993年提出。原理：用酶（最常用的是胰蛋白酶）對由2-DE分離的蛋白質(zhì)在膠上或在膜上于精氨酸或賴氨酸的C-末端處進(jìn)行斷裂，斷裂所產(chǎn)生片段的精確分子量通過質(zhì)譜來測量（MALDI-TOF-MS或ESI-MS）。所有的肽質(zhì)量最后與數(shù)據(jù)庫中理論肽質(zhì)量相配比（理論肽是由實(shí)驗(yàn)所用的酶來“斷裂”蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的）。配比的結(jié)果是按照數(shù)據(jù)庫中肽片段與未知蛋白共有的肽片段數(shù)目作一排行榜。

質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)及多肽分析中的應(yīng)用：蛋白質(zhì)的鑒定磷酸化位點(diǎn)的分析（3）酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交體系的基本原理：由于真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子由兩部分獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNAbindingdomain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain，AD）。將與BD融合的已知蛋白質(zhì)作為“誘餌”，與AD融合的另一待測蛋白質(zhì)作為“獵物”。如果兩種蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞核內(nèi)有相互作用時，則BD與AD靠近并激活報告基因的轉(zhuǎn)錄，借此可研究蛋白質(zhì)間的相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)的缺陷：不能檢測到一些依靠翻譯后修飾的相互作用（需用三雜交系統(tǒng)）。所得到的蛋白質(zhì)相互作用信息可能存在“假陰性”或“假陽性”，還需通過進(jìn)一步的驗(yàn)證加以確定和排除。該系統(tǒng)并非對所有的蛋白質(zhì)都適用。由于有些蛋白質(zhì)本身有激活轉(zhuǎn)錄活性，不經(jīng)過雙雜交相互作用就能激活報告基因的表達(dá)，因此酵母雙雜交系統(tǒng)不適用。根據(jù)其原理，融合蛋白的相互作用激活報告基因轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的，而表達(dá)的