葉綠體色素不同提取方法的比較研究

葉綠體色素不同提取方法的比較研究摘要：本文通過不同提取方法提取了幾種植物葉片葉綠體色素，并對(duì)其含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示：不同實(shí)驗(yàn)處理比較，提取過程加碳酸鈣的提取液各色素含量均高于未加碳酸鈣的提取液；3種提取方法比較，95%乙醇沸水浴法提取的色素含量高于95%乙醇研磨法和80%丙酮研磨法；不同實(shí)驗(yàn)材料比較，法國(guó)梧桐葉片和胡蘿卜葉片色素含量較高，有利于層析分離效果的觀察。關(guān)鍵詞：葉綠體色素；色素含量；提取方法植物葉綠體色素主要有三類即葉綠素、類胡蘿卜素和藻膽素。高等植物葉綠體中含有前兩類，藻膽素僅存在于藻類植物中。葉綠體是光合作用的場(chǎng)所，做好葉綠體中色素的提取和分離實(shí)驗(yàn)，有助于通過該實(shí)驗(yàn)使學(xué)生了解葉綠體色素的種類、性質(zhì)及其與光合作用的關(guān)系，以加深對(duì)光合作用相關(guān)內(nèi)容的理解。研究表明，不同種類植物的葉片，其色素含量和色素種類也各不相同，恰當(dāng)?shù)倪x擇葉片是獲得高濃度葉綠體色素的保障[1]。根據(jù)葉綠體色素各成分在層析液中分配系數(shù)的不同，可將不同的葉綠素逐一分開，但在實(shí)驗(yàn)中，常因?qū)嶒?yàn)材料中色素含量低提取制備較難，層析分離后色帶清晰度差，甚至色帶種類不全等諸多因素，最后影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中葉綠體色素的提取、過濾與點(diǎn)樣、分離與層析是取得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵問題，也是本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選取較為常見的實(shí)驗(yàn)材料，通過設(shè)置對(duì)比研究不同的實(shí)驗(yàn)材料和提取方法對(duì)色素含量的影響，試圖從中找出一種便于操作，結(jié)果清晰的實(shí)驗(yàn)方法和高效的實(shí)驗(yàn)材料，以便學(xué)生進(jìn)一步對(duì)“葉綠體色素層析分離”實(shí)驗(yàn)的理解和辯證。1實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料新鮮的菠菜葉、胡蘿卜葉、法國(guó)梧桐葉和油菜葉。1.2實(shí)驗(yàn)方法采取孔祥生等植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)“葉綠體色素的提取與分離”[2]和“葉綠體色素的定量測(cè)定”[3]。2結(jié)果與分析2.1加碳酸鈣提取和不加碳酸鈣提取色素含量的比較葉綠體中色素所處的環(huán)境為微堿性，實(shí)驗(yàn)中研磨或加熱使細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞液(具有微酸性)流出[4-6]。酸性的細(xì)胞液就會(huì)直接與葉綠體中的色素接觸，致使葉綠素的分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，這是因?yàn)槿~綠素是一種含鎂的化合物，其中的鎂易被氫離子、二價(jià)銅離子、鋅離子等取代，形成去鎂葉綠素，使葉綠素失鎂，呈黃褐色。而碳酸鈣是強(qiáng)堿弱酸鹽，碳酸鈣在水中的溶解度很小，呈現(xiàn)一種弱堿性，中和了細(xì)胞液的酸性，保護(hù)了葉綠體的色素。由圖2-1可以看出，在乙醇沸水浴法提取葉綠體色素的方法中，加碳酸鈣和不加碳酸鈣提取的葉綠體色素含量表現(xiàn)出差異，加碳酸鈣提取的葉綠素a含量和類胡蘿卜素含量明顯高于不加碳酸鈣提取的色素含量。2.2不同方法提取葉綠素含量的比較分別用95%乙醇沸水浴法、95%乙醇研磨法和80%丙酮研磨法提取菠菜葉片色素并測(cè)其含量，結(jié)果如圖2-2所示，3種方法提取的色素含量有明顯差異，色素含量從高到低為95%乙醇沸水浴法＞80%丙酮研磨法＞95%乙醇研磨法。其中95%乙醇沸水浴法提取的效果最好，各色素含量最高，95%乙醇研磨法提取的色素含量最低。2.3乙醇研磨法測(cè)定不同植物葉片色素含量的比較如圖2-3，用95%乙醇研磨法測(cè)定不同植物葉片色素含量，結(jié)果顯示，法國(guó)梧桐葉和胡蘿卜葉的色素含量較高，明顯高于菠菜葉片和油菜葉片所提取的色素含量。因此，理論上講，法國(guó)梧桐葉、胡蘿卜葉是本實(shí)驗(yàn)較為理想的實(shí)驗(yàn)材料。3討論與結(jié)論一般認(rèn)為，碳酸鈣的作用在于中和提取過程中產(chǎn)生的H+，防止葉綠素被破壞，通過乙醇沸水浴法提取色素并測(cè)定色素含量比較，證明提取過程加碳酸鈣的提取液色素含量高于不加碳酸鈣的提取液色素含量，為了避免加入碳酸鈣導(dǎo)致提取液混濁的現(xiàn)象，可用碳酸鈉代替碳酸鈣[7]。對(duì)3種不同方法提取的色素液測(cè)其含量表明，乙醇沸水浴法不需研磨，提取色素所需要的時(shí)間比較短，大約6分鐘，色素提取液含量較高，效果明顯。與研磨方法比，避免了實(shí)驗(yàn)程序繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、濾液混濁等缺點(diǎn)。在材料的選擇上，很多植物葉片，如大葉黃楊等取材方便，但是難以研磨。采用乙醇沸水浴法不受季節(jié)、氣候和地域等因素的影響。另外，用95%乙醇研磨和用80%丙酮研磨所測(cè)得的色素含量，黃色素和綠色素區(qū)別明顯，95%乙醇研磨提取的綠色素含量高一些，而80%丙酮研磨提取的黃色素含量高一些。這可能和綠色素在乙醇中的溶解度比較高，而黃色素在丙酮中的溶解度較高有關(guān)，是否還有其它因素的影響，有待進(jìn)一步研究探討。實(shí)驗(yàn)材料為法國(guó)梧桐葉片和胡蘿卜葉片色素含量高，特別是黃色素含量較其它材料較高，這對(duì)于層析分離時(shí)同學(xué)們對(duì)黃色素的清晰分離有重要的影響。（收稿：2011-12-04）參考文獻(xiàn)[1]歐陽菲.關(guān)于《葉綠體色素提取與分離》實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)分析及其改進(jìn)方法.伊犁教育學(xué)院學(xué)報(bào).2001，14(2)：94～95.[2]孔祥生，易現(xiàn)峰.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),73～74.[3]孔祥生，易現(xiàn)峰.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),77～80.[4]石淵偉.《葉綠體中色素的提取和分離》實(shí)驗(yàn)存在的問題及實(shí)驗(yàn)改進(jìn).實(shí)驗(yàn)教學(xué)與儀器.2009，26(9)：22～23.[5]王睿博,韓萍.葉綠體色素提取和分離實(shí)驗(yàn)中色素帶擴(kuò)散高度的探究.生物學(xué)教學(xué).2003，28(7)