中成藥口服給藥制劑與其原料藥檢出污染微生物的關(guān)聯(lián),生物制藥論文

中成藥口服給藥制劑與其原料藥檢出污染微生物的關(guān)聯(lián),生物制藥論文六味地黃丸、牛黃消炎片和西黃丸，由于處方中含有動(dòng)物藥(人工牛黃、麝香、珍珠母、蟾酥)、植物藥(熟地黃、酒萸肉、乳香、沒藥、山藥、牡丹皮、大黃、茯苓、澤瀉、青黛、天花粉)和礦物藥(雄黃)，且制法為以部分生藥粉入藥，所以均屬于含藥材原粉的中成藥口服給藥制劑。相對(duì)于化學(xué)藥品，固然中成藥通過(guò)炮制、加工、提取等手段處理后其微生物種類和數(shù)量都有一定程度的下降，但仍具有微生物客觀存在的事實(shí)，國(guó)外藥典均收載了中藥材(飲片)的微生物限度檢查方式方法和標(biāo)準(zhǔn)，而中國(guó)藥典尚未收載相關(guān)內(nèi)容。據(jù)此，本文根據(jù)2018年版中國(guó)藥典和16版日本藥局方的微生物限度檢查方式方法，對(duì)上述3種中成藥及其主要原料藥(珍珠母、熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、沒藥)進(jìn)行微生物限度檢查，并將從樣品中檢出污染微生物進(jìn)行菌株鑒定分析，討論中成藥口服給藥制劑與其原料藥檢出污染微生物之間的相關(guān)性，為中成藥和中藥材(飲片)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)合理化和產(chǎn)品質(zhì)量提高，提供參考根據(jù)。1儀器與材料生物安全柜(美國(guó)Thermo公司)，生化培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder公司)，Phoenix100型全自動(dòng)細(xì)菌鑒定試驗(yàn)系統(tǒng)(美國(guó)BD公司)，CrystalSpec型比濁儀(美國(guó)BD公司)。六味地黃丸:144批(30、36、54、60、72g瓶－1，6g袋－1，9g丸－1)，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠、廣州白云山和記黃埔中藥有限公司、貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥有限公司、哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠等54個(gè)藥廠。牛黃消炎片:114批(0.05g片－1)，長(zhǎng)春海外制藥集團(tuán)有限公司、大連輝仁制藥有限公司、多多藥業(yè)有限公司、撫順澎健藥業(yè)有限公司、哈爾濱華雨制藥集團(tuán)有限公司、哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠、河北永豐藥業(yè)有限公司、黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司、吉林省輝南天宇藥業(yè)股份有限公司、金昌金丹藥業(yè)有限公司、山東仙河藥業(yè)有限公司、上?；氏箬F力藍(lán)天制藥有限公司、煙臺(tái)天正藥業(yè)有限公司、藥都制藥集團(tuán)股份有限公司。西黃丸:67批(3g瓶－1)，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠、本溪仙草堂藥業(yè)有限公司、吉林濟(jì)邦藥業(yè)有限公司、濟(jì)南宏濟(jì)堂制藥有限責(zé)任公司、九寨溝天然藥業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司、遼寧華鑫藥業(yè)有限公司、遼寧仙鶴制藥有限責(zé)任公司、四川康定金珠制藥有限責(zé)任公司、天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂仁堂制藥廠、通化金馬藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司、通化玉圣藥業(yè)股份有限公司、武漢健民大鵬藥業(yè)有限公司、浙江天一堂藥業(yè)有限公司。原料藥:珍珠母(205042)、熟地黃(204211)、酒山茱萸(301161)、牡丹皮(303091)、醋沒藥(208071)，(500g袋－1)，北京華邈中藥工程技術(shù)開發(fā)公司。培養(yǎng)基:膽鹽乳糖增菌液、玫瑰紅鈉瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、改進(jìn)馬丁、改進(jìn)馬丁瓊脂、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)分別為1009162、1007052、1103092、100628、090903、090925、120730，北京三藥科技開發(fā)有限公司，靈敏度實(shí)驗(yàn)符合2018年版中國(guó)藥典規(guī)定)?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)［CMCC－B63501］、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)［CMCC－B26003］、大腸埃希菌(Escherichiacoli)［CMCC－B44102］、白色念珠菌(Candidaalbicans)［CMCC－F98001］，中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心;黑曲霉(Aspergillusniger)［CMCC－F98003］，中國(guó)食品藥品檢定研究院。試劑:鑒定培養(yǎng)液、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌鑒定/藥敏板、革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定/藥敏板(批號(hào)分別為2107002、2046476、2088399，碧迪醫(yī)療器械上海有限公司)2方式方法參照2018年版中國(guó)藥典一部微生物限度檢查法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，簡(jiǎn)述如下。2.1菌液制備接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48h。上述培養(yǎng)物用0.9%的無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改進(jìn)馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7d，參加0.9%的無(wú)菌氯化鈉溶液3～5mL，將孢子洗脫。吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用0.9%的無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數(shù)為50～100cfu的孢子懸液。2.2供試液制備稱樣品10g，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100mL，用勻漿儀混勻或搖勻，得1∶10供試液，備用。2.3細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)檢查驗(yàn)證試驗(yàn)培養(yǎng)基稀釋法:取不同量的供試液(1∶10)入皿，參加驗(yàn)證菌，然后每皿加營(yíng)養(yǎng)瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基約20mL，搖勻，即培養(yǎng)基稀釋。如1mL皿－1為1∶200稀釋，0.5mL皿－1為1∶400稀釋。細(xì)菌置35℃培養(yǎng);霉菌和酵母菌置25℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果。2.4細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)檢查試驗(yàn)培養(yǎng)基稀釋法:為保證樣品中污染微生物計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，取不同量的供試液(1∶10)、(1∶100)入皿，然后每皿加營(yíng)養(yǎng)瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基約20mL，搖勻。細(xì)菌置35℃培養(yǎng);霉菌和酵母菌置25℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果。2.5污染菌株分析使用無(wú)菌棉簽挑取從六味地黃丸、牛黃消炎片和西黃丸及其原料藥中分離的污染菌落至鑒定培養(yǎng)液中，混勻，使用比濁儀調(diào)節(jié)菌液濃度在0.5～0.6McF范圍內(nèi)。將菌液倒入藥敏板，將藥敏板放入全自動(dòng)細(xì)菌鑒定試驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行菌株分析。3結(jié)果與討論3.1微生物限度檢查法的建立采用培養(yǎng)基稀釋法檢查六味地黃丸、牛黃消炎片和西黃丸時(shí)，樣品經(jīng)1:200稀釋后對(duì)挑選菌株枯草芽孢桿菌的平均回收率為92%、89%、90%，在這里條件下，用其余4株驗(yàn)證菌株進(jìn)一步驗(yàn)證，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉以及白色念珠菌的平均回收率，結(jié)果見表1。采用上述方式方法檢查珍珠母、熟地黃、酒山茱萸、牡丹皮、醋沒藥時(shí)，樣品對(duì)挑選菌株枯草芽孢桿菌的平均回收率為96%、94%、89%、90%、96%、，在這里條件下，用其余4株驗(yàn)證菌株進(jìn)一步驗(yàn)證，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉以及白色念珠菌的平均回收率，結(jié)果見表2?！颈?-2】3.2六味地黃丸、牛黃消炎片和西黃丸及其原料藥的微生物限度檢查結(jié)果六味地黃丸的細(xì)菌數(shù)檢查結(jié)果，＜10cfug－1為39批;10～100cfug－1為63批;100～500cfug－1為22批;500～1000cfug－1為11批;1000～5000cfug－1為6批;5000～10000cfug－1為3批。霉菌和酵母菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果，均為＜10cfug－1。牛黃消炎片的細(xì)菌數(shù)檢查結(jié)果，＜10cfug－1的有24批;10～100cfug－1的有19批;100～500cfug－1的有21批;500～1000cfug－1的有6批;1000～5000cfug－1的有28批;5000～10000cfug－1的有16批。霉菌和酵母菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果，均＜10cfug－1。西黃丸的細(xì)菌數(shù)檢查結(jié)果，＜10cfug－1的有45批;10～100cfug－1的有5批;100～500cfug－1的有6批;500～1000cfug－1的有2批;1000～5000cfug－1的有5批;5000～10000cfug－1的有4批。霉菌和酵母菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果，均＜10cfug－1。所有批次的檢品中，六味地黃丸、牛黃消炎片和西黃丸的細(xì)菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果，＜10cfug－1的有108批;10～1000cfug－1的有154批;1000～10000cfug－1的有62批;霉菌和酵母菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果，均為＜10cfug－1。其主要原料藥的3次細(xì)菌數(shù)檢查平均結(jié)果分別為:珍珠母7800cfug－1;熟地黃670cfug－1;酒山茱萸290cfug－1;牡丹皮3600cfug－1;醋沒藥6700cfug－1。3次霉菌和酵母菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果均為＜10cfug－1。3.3污染菌株鑒定結(jié)果對(duì)從六味地黃丸、牛黃消炎片和西黃丸中檢出的污染菌進(jìn)行菌株分析。檢出枯草芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、宏大芽孢桿菌、簡(jiǎn)單芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、莫海威芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、彎曲芽孢桿菌、短芽孢桿菌、斯?jié)櫧鹧堪麠U菌、陰溝腸桿菌、流感嗜血桿菌、少動(dòng)鞘氨醇桿菌、糖原甲基菌、成團(tuán)泛菌、非脫羧勒克氏菌、弗氏志賀氏菌、溶黃嘌呤厄氏菌、傷口埃希氏菌、莫拉氏菌、金氏金氏菌、路鄧葡萄球菌、人葡萄球菌、克氏葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、肺炎克雷伯菌臭鼻亞種、假單胞菌某些種、科氏葡萄球菌科氏亞種、西地西菌EO－2群，共計(jì)31株污染菌。從珍珠母、熟地黃、酒山茱萸、牡丹皮、醋沒藥中檢出金黃色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、宏大芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、克氏葡萄球菌、緩慢葡萄球菌、環(huán)狀芽孢桿菌、雞葡萄球菌、矮小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、松鼠葡萄球菌、凝固芽孢桿菌、短芽孢桿菌，共計(jì)13株污染菌。近年來(lái)隨著大量抗生素和免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，很多傳統(tǒng)上不致病或無(wú)毒性的微生物越來(lái)越多地成為人體感染的主力軍。例如:金黃色葡萄球菌、假單胞菌、芽孢桿菌、微小桿菌等均會(huì)在人體基礎(chǔ)病變引起機(jī)體防衛(wèi)功能降低時(shí)導(dǎo)致各種時(shí)機(jī)感染。所以，固然上述污染菌株多為環(huán)境常見菌，沒有危害性較大的致病菌，但也屬于條件致病菌，其用藥對(duì)象若是嬰幼兒及衰弱患者，就會(huì)導(dǎo)致使用該藥品的患者遭到感染。4討論藥品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)是保證藥品質(zhì)量的重要因素，從上述菌株鑒定結(jié)果可知，六味地黃丸、牛黃消炎片和西黃丸與其主要原料藥中檢出的污染微生物均有重復(fù)出現(xiàn)，華而不實(shí)絕大部分為芽孢桿菌，因而從上述3種中成藥中分離得到的污染菌，很可能來(lái)自其生產(chǎn)所用的原料(中藥材和飲品)。中藥材和飲品因含有大量的有機(jī)質(zhì)，在生長(zhǎng)、儲(chǔ)藏、加工經(jīng)過(guò)中易受各種微生物的污染，尤其極易遭到芽孢桿菌屬的污染，直接影響制劑成品的質(zhì)量，例如:芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌主要來(lái)源于土壤。而且，中成藥口服給藥制劑多源于天然植物、動(dòng)物和礦物，其生產(chǎn)工藝特殊，固然通過(guò)炮制、加工、提取等手段處理后其微生物種類和數(shù)量都有一定程度的下降，但相對(duì)于化學(xué)藥品，仍具有微生物客觀存在的事實(shí)。所以，假如不重視中成藥口服給藥制劑生產(chǎn)經(jīng)過(guò)的微生物控制，就會(huì)增加誘發(fā)其微生物污染因素，部分污染菌在產(chǎn)品的滅菌、烘干等加工經(jīng)過(guò)中還會(huì)構(gòu)成能夠抵抗物理和化學(xué)屏障的生物膜，甚至變異為傳統(tǒng)生理生化方式方法無(wú)法檢出的條件致病菌。因而要意識(shí)到成品控制知足不了產(chǎn)品污染微生物的控制，需要結(jié)合更多生產(chǎn)經(jīng)過(guò)控制保證產(chǎn)品質(zhì)量，例如:將污染菌株的分離、鑒定與分析作為中成藥口服給藥制劑及其原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要組成部分，進(jìn)一步開展生產(chǎn)經(jīng)過(guò)與微生物限度檢查結(jié)果相關(guān)性的研究，以減少中成藥生產(chǎn)各工序環(huán)節(jié)中誘發(fā)藥品微生物污染因素。除此之外，中成藥生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)徹底改變傳統(tǒng)的生產(chǎn)相貌，例如，采用標(biāo)準(zhǔn)廠房、標(biāo)準(zhǔn)取樣室和標(biāo)準(zhǔn)凈化實(shí)驗(yàn)室，生產(chǎn)上構(gòu)成機(jī)械化、管道化、連續(xù)化的制劑和包裝工序的生產(chǎn)線，將所用藥材按規(guī)定進(jìn)行揀選、整理、洗滌等前處理加工，生產(chǎn)經(jīng)過(guò)控制在不同干凈級(jí)別的廠房?jī)?nèi)，就能把微生物的含量控制在一定范圍內(nèi)，并輔以適宜的滅菌方式方法，就能保證藥品的衛(wèi)生質(zhì)量，例如:含原生藥粉的丸劑，國(guó)家規(guī)定的微生物限度為不超過(guò)30000cfug－1，若前處理后微生物含量為200000cfug－1，用6kGy輻照的輻照劑量，把微生物降低89%～97%(即為6000～22000cfug－1)，就能符合微生物控制標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，還可將計(jì)算機(jī)用于生產(chǎn)經(jīng)過(guò)控制和管理，采用先進(jìn)的檢測(cè)儀器，例如:利用水活度檢測(cè)技術(shù)，控制中成藥微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵控制指標(biāo)。并建議適當(dāng)改變國(guó)家藥典的中成藥口服制劑質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，例如，參考國(guó)外中成藥質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，增加中成藥的控制菌檢查種類。這樣，將才有助于中藥的健康發(fā)展，最終使我們國(guó)家中成藥生產(chǎn)企業(yè)能夠介入國(guó)際藥品貿(mào)易競(jìng)爭(zhēng)和中藥產(chǎn)品的國(guó)際貿(mào)易簽證體制。以下為參考文獻(xiàn)［1］DUANBin(段彬)，WEIYu－h(huán)ui(