血紅蛋白分離提取大題

本文格式為Word版，下載可任意編輯——血紅蛋白分離提取大題一、根基學(xué)識(shí)蛋白質(zhì)分開(kāi)和提取的原理,㈠凝膠色譜法（調(diào)配色譜法）,1、凝膠：,一些微小多孔的球體（內(nèi)含大量貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖）,2、概念：,根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分開(kāi)蛋白質(zhì)的有效方法,3、原理：,一、根基學(xué)識(shí)蛋白質(zhì)分開(kāi)和提取的原理,用凝膠色譜法分開(kāi)蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)A．路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢B．路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較快C．路程較短，移動(dòng)速度較慢D．路程較短，移動(dòng)速度較快,D,4、概括過(guò)程,一、根基學(xué)識(shí)蛋白質(zhì)分開(kāi)和提取的原理,相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的舉行過(guò)程可表示為圖中哪一個(gè),B,1、概念：在確定的范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來(lái)少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。,㈡緩沖溶液：,2、作用：

能夠抗拒（）對(duì)溶液（）的影響，維持PH根本不變。,外界的酸或堿,pH值,3、緩沖溶液的配制,通常由（）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)理緩沖劑的（）就可以制得（）使用的緩沖液。,1－2,使用比例,在不同PH范圍內(nèi),斟酌：說(shuō)出人體血液中緩沖液。,NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3,磷酸緩沖液，保證血紅蛋白的正常布局和功能，便于查看(紅色)和科學(xué)研究其(活性),4、在本課題中使用的緩沖液？,（三）電泳：,1.概念：,帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。,2.原理：,①大量重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在確定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。②在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。③電泳利用了待分開(kāi)樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，外形的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分開(kāi)。,3.類型:,瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。,,在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng),瓊脂糖凝膠電泳示意圖,4、聚丙稀酰胺凝膠電泳,（1）聚丙稀酰胺凝膠：是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N，亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀布局的凝膠。,蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。

為了消釋凈電荷對(duì)遷移率的影響，可以在凝膠中參與SDS。,（2）原理：,SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷區(qū)別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。,（3）SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳作用機(jī)理:,4、聚丙稀酰胺凝膠電泳,使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過(guò)程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子外形的差異,,蛋白質(zhì)的提取和分開(kāi)一般分為四步：

（1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；

血紅蛋白稀釋；

離心等操作收集到的血紅蛋白溶液。

（2）粗分開(kāi)：透析除去分子較小的雜質(zhì)。

（3）純化：通過(guò)凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。

（4）純度鑒定：通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。,二、測(cè)驗(yàn)操作：樣品處理→粗分開(kāi)→純化→純度鑒定,1.血液有哪些成分？,2.你認(rèn)為鳥(niǎo)類血液和哺乳動(dòng)物血液中，最好哪種血液來(lái)提取血紅蛋白？為什么？,二、測(cè)驗(yàn)操作：樣品處理→粗分開(kāi)→純化→純度鑒定,學(xué)識(shí)回想,（一）樣品處理,1、紅細(xì)胞的洗滌：

2、血紅蛋白的釋放：

3、分開(kāi)血紅蛋白溶液：

4、透析：（如何除無(wú)機(jī)鹽離子和小分子有機(jī)物質(zhì)呢？）,血液＋檸檬酸鈉→低速短時(shí)離心→吸出上層血漿→紅細(xì)胞＋5倍體積生理鹽水→緩慢攪拌10min→低速短時(shí)離心→吸出上清液→反復(fù)洗滌直至上清液無(wú)黃色,在蒸餾水和甲苯（？）作用下，紅細(xì)胞破碎釋放,紅細(xì)胞破碎混合液→中速長(zhǎng)時(shí)離心（2000c/min×10min）→濾紙過(guò)濾除去脂質(zhì)→分液漏斗分開(kāi)出血紅蛋白，得到紅色通明液體。,裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。,二、測(cè)驗(yàn)操作：樣品處理→粗分開(kāi)→純化→純度鑒定,分開(kāi)血紅蛋白溶液,有機(jī)溶劑無(wú)色通明的甲苯層,脂類物質(zhì)白色脂溶性物質(zhì)沉淀層,血紅蛋白溶液紅色通明液體,紅細(xì)胞破碎物沉淀暗紅色沉淀物,透析過(guò)程動(dòng)畫演示,練習(xí)穩(wěn)定,1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時(shí)代，對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來(lái)越深入，首先要做的一步是A弄清各種蛋白質(zhì)的空間布局B弄清各種蛋白質(zhì)的功能C弄清各種蛋白質(zhì)的合成過(guò)程D獲得高純度的蛋白質(zhì),2、用凝膠色譜法分開(kāi)蛋白質(zhì)的過(guò)程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的表達(dá)，正確的是A相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)D二者根本無(wú)法對(duì)比,3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過(guò)程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子外形的差異4、在采血容器中參與檸檬酸鈉的目的是A調(diào)理pHB維持紅細(xì)胞的能量供給C防止微生物生長(zhǎng)D防止血液凝固,5、一分子血紅蛋白最多可攜帶的O2分子數(shù)和CO2分子數(shù)分別是A4、2B4、4C2、1D、1、16、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層依次自上而下是：

有機(jī)溶劑脂類物質(zhì)血紅蛋白溶液紅細(xì)胞破碎物沉淀,（二）凝膠色譜操作純化,1、凝膠色譜柱的制作：,,二、測(cè)驗(yàn)操作：樣品處理→粗分開(kāi)→純化→純度鑒定,色譜柱的制作過(guò)程：打定材料→加工橡皮塞→安裝色譜柱,ＡＣＤ,凝膠色譜柱取長(zhǎng)為40cm，內(nèi)徑為1．6cm，有關(guān)說(shuō)法中，正確的是(多項(xiàng)選擇)A．一般凝膠色譜柱直徑的大小不影響分開(kāi)的效果B．凝膠色譜柱過(guò)高明過(guò)1m，不影響分開(kāi)的效果C．凝膠色譜柱過(guò)矮，那么影響混合物的分開(kāi)度D．凝膠色譜柱直徑過(guò)大會(huì)耗用過(guò)多洗脫液，樣品的稀釋度過(guò)大,2、凝膠色譜柱的裝填,裝配好的凝膠柱,3、樣品參與與洗脫調(diào)理緩沖液面→參與蛋白質(zhì)樣品→調(diào)理緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì),（1）調(diào)理緩沖液面：開(kāi)啟下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

（2）滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)留神不要破壞凝膠面。

（3）樣品滲入凝膠床：加樣后開(kāi)啟下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。

（4）洗脫：提防參與pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，開(kāi)啟下端出口舉行洗脫。

（5）收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分開(kāi)過(guò)程中，假設(shè)紅色區(qū)帶平勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作告成）（6）留神：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。,留神：正確的加樣操作是（1）不要觸及并破壞凝膠面。（2）貼壁加樣。（3）使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。,3、樣品參與與洗脫調(diào)理緩沖液面→參與蛋白質(zhì)樣品→調(diào)理緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì),斟酌下面的問(wèn)題：,讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持布局和功能。,,1、在血紅蛋白的整個(gè)過(guò)程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？,2、與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對(duì)你舉行蛋白質(zhì)得分開(kāi)有什么意義？,血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分開(kāi)時(shí)可以通過(guò)查看顏色來(lái)判斷什么時(shí)候理應(yīng)收集洗脫液。這使血紅蛋白的分開(kāi)過(guò)程分外直觀，大大簡(jiǎn)化了測(cè)驗(yàn)操作。,3、你能描述血紅蛋白分開(kāi)的完整過(guò)程嗎？,血紅蛋白提取和分開(kāi)的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分開(kāi)、純化和純度鑒定。首先通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；

再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分開(kāi)；

然后通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去，即:樣品的純化；

結(jié)果經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳舉行純度鑒定。,收集得到的純化后的蛋白,,在裝填凝膠柱時(shí)，不能有氣泡存在的理由是A、氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分開(kāi)效果B、氣泡阻礙蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)C、氣泡與蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)回響D、氣泡在裝填凝膠的時(shí)候，使凝膠不精細(xì),A,樣品的參與和洗脫的操作不正確的是A．加樣前，開(kāi)啟色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面B．加樣后，開(kāi)啟下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)C．等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口D．用吸管提防的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面,A,以下是有關(guān)血紅蛋白提取和分開(kāi)的相關(guān)操作，其中正確的是（）A．可采集豬血作為測(cè)驗(yàn)材料B．用蒸餾水重復(fù)洗滌紅細(xì)胞C．血紅蛋白釋放后應(yīng)低速短時(shí)間離心D．洗脫液接近色譜柱底端時(shí)開(kāi)頭收集流出液,A,三、SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳,鑒定血紅蛋白純度。,目的：,查看你處理的血液樣品離心后是否分層（見(jiàn)教科書圖5-18），假設(shè)分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的理由。此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純真的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。,四、測(cè)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià),1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？,2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得告成嗎？你是如何判斷的？,由于凝膠是一種半通明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得平勻。此外，還可以參與大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，查看色帶移動(dòng)的處境。假設(shè)色帶平勻、狹窄、平整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好。假設(shè)色譜柱展現(xiàn)紋路或是氣泡，輕小扣打柱體以消釋氣泡，消釋不了時(shí)要重新裝柱。,假設(shè)凝膠色譜柱裝填得很告成、分開(kāi)操作也正確的話，能領(lǐng)會(huì)地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶平勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；

假設(shè)紅色區(qū)帶歪