色譜分析法概論

色譜分析法概論1第一頁，共四十八頁，2022年，8月28日17.1.1.色譜法的起源和發(fā)展混合物最有效的分離、分析方法。俄國植物學家茨維特在1906年使用的裝置：色譜原型裝置，如圖。色譜法是一種分離技術色譜法（層析法）不僅用于有色物質(zhì)分離，且大量用于無色物質(zhì)分離。管內(nèi)填充物，稱為固定相。另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。17.1概述2第二頁，共四十八頁，2022年，8月28日30年代出現(xiàn)薄層色譜法40年代紙色譜法(塔板理論)50年代氣相色譜法興起，奠定了現(xiàn)代色譜法的基礎，可“在線”分析。（速率理論）60年代氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術70年代高效液相色譜法(HPLC)的崛起,把色譜法又推進到一個新里程碑。80年代液相色譜聯(lián)用技術、超臨界流體色譜90年代毛細管電泳法發(fā)展歷程3第三頁，共四十八頁，2022年，8月28日(1)．按兩相分子的聚集狀態(tài)分：流動相固定相類型液相色譜液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜氣相色譜17.1.2.色譜法的分類4第四頁，共四十八頁，2022年，8月28日(2)．按操作形式分類：3．按分離機制分：平板色譜

紙色譜薄層色譜高分子薄膜色譜柱色譜

填充柱色譜毛細管柱色譜

分配色譜：利用分配系數(shù)的不同

吸附色譜：利用物理吸附性能的差異

離子交換色譜：利用離子交換原理

空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同5第五頁，共四十八頁，2022年，8月28日色譜法氣相色譜法(GC)GasChromatography液相色譜法(LC)LiquidChromatography超臨界流體色譜法（SFC）柱色譜法氣固色譜氣液色譜平板色譜法柱色譜法毛細管電泳法紙色譜法薄層色譜離子交換液固液液空間排阻6第六頁，共四十八頁，2022年，8月28日17.2色譜過程與術語

當流動相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時，其與固定相發(fā)生相互作用。隨著流動相的移動，混合物在兩相間經(jīng)過反復多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中流出。（動畫）兩相及兩相的相對運動構(gòu)成了色譜法的基礎17.2.1色譜過程7第七頁，共四十八頁，2022年，8月28日

經(jīng)色譜柱分離后的樣品組份通過檢測器時，所產(chǎn)生的電信號強度對時間作圖，所繪得曲線稱為色譜圖或流出曲線17.2.2基本術語(P436)1.色譜8第八頁，共四十八頁，2022年，8月28日(1)

基線基線是在操作條件下，沒有組份流出時的流出曲線基線反映儀器的噪音隨時間的變化穩(wěn)定的理想基線應該是一條水平直線．基線漂移:基線在一段時間內(nèi)朝某一個方向變化.9第九頁，共四十八頁，2022年，8月28日(2)峰高或峰面積

色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以h表示，10第十頁，共四十八頁，2022年，8月28日

用來衡量色譜峰寬度的重要參數(shù)，有三種表示方法：（1）標準差()：正態(tài)分布曲線上兩拐點間距離的一半。反映組分分散程度。（2）峰底寬

(W)：W=4（3）半峰寬

(W1/2)：色譜峰高一半處的寬度W1/2=2.355

或W=1.699W1/2(3)峰寬11第十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日保留時間和調(diào)整保留時間是色譜法的基本定性參數(shù)(1)保留時間（tR）：試樣從進樣開始到某個組份色譜峰頂點的時間間隔，稱為保留時間；(3)調(diào)整保留時間（tR

＇）：tR＇=tR－t0

(2)死時間（t0）：不與固定相作用的物質(zhì)（如空氣）的保留時間；2.保留值12第十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日

(4)保留體積（VR）：

VR=tR×FcFc為流動相流速，單位：mL/min。

(5)死體積（V0）：

V0=t0×Fc

(6)調(diào)整保留體積(VR＇)：

V

R＇=VR

－V0

VR’

也是常用的色譜定性參數(shù)之一13第十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日

又稱Kovats指數(shù)，是一種重現(xiàn)性較好的定性參數(shù)。測定方法：將正構(gòu)烷烴作為標準，規(guī)定其保留指數(shù)為分子中碳原子個數(shù)乘以100（如正己烷的保留指數(shù)為600）。其它物質(zhì)的保留指數(shù)（IX）是通過選定兩個相鄰的正構(gòu)烷烴，其分別具有Z和Z＋1個碳原子。被測物質(zhì)X的調(diào)整保留時間應在相鄰兩個正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留值之間如圖所示：(7)保留指數(shù)(I)14第十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日保留指數(shù)計算方法15第十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日例在ApiezolL柱上，柱溫100℃，用正庚烷及正辛烷為參考物質(zhì)對，測得t0=30.0s，正庚烷的tR=204.0s，乙酸正丁酯的tR=340.0s及正辛烷的tR=403.4s。說明乙酸正丁酯在ApiezolL柱上的保留行為相當于7.756個碳原子的正構(gòu)烷烴的保留行為。Ix=100（）=775.616第十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日3.分配系數(shù)與容量因子(P439)(1)分配系數(shù)

組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達到平衡時的濃度（單位：g/mL）比，稱為分配系數(shù)，用K表示，即：分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。17第十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日分配系數(shù)K的討論

一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時，K主要取決于固定相性質(zhì)；某組分的K=0時，即不被固定相保留，最先流出。K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)（或稱交換系數(shù)），凝膠色譜法為滲透參數(shù)18第十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日容量因子是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的質(zhì)量比：分配系數(shù)與容量因子都是與組分及固定相的熱力學性質(zhì)有關的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。分配系數(shù)與容量因子都是衡量色譜柱對組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時間越長。容量因子可以由實驗測得。容量因子也稱：分配比；質(zhì)量分配系數(shù)；(2)容量因子19第十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日(3)分配系數(shù)和容量因子的關系20第二十頁，共四十八頁，2022年，8月28日(4)分配系數(shù)和容量因子與保留時間關系k值相當于組分被固定相滯留的時間和流動相通過系統(tǒng)所需時間的比值21第二十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日tR與K的關系：22第二十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日

結(jié)論：色譜分離前提→各組分分配系數(shù)不等

注：應選擇合適分離條件使得難分離的組分K不等23第二十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日4.分離參數(shù)(1)分離因子(α)兩種物質(zhì)調(diào)整保留值之比，又稱為分配系數(shù)比或選擇性系數(shù)24第二十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日色譜分離中的幾種情況如圖所示：分離度（Rs

），又稱分辨率：反映組分在色譜柱分離情況。(2)分離度(Rs)25第二十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日分離度的表達式：R=0.8：兩峰的分離程度可達89%；R=1：分離程度95.4%；（4σ）R=1.5：達99.7%（相鄰兩峰完全分離的標準）。26第二十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含組份的最少個數(shù)．根據(jù)色譜峰的保留值(或位置），可以進行定性分析．根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以進行定量分析．色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾龋窃u價色譜柱分離效能的依據(jù)．色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相(和流動相)選擇是否合適的依據(jù)．小結(jié)：色譜流出曲線的物理意義27第二十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日組分保留時間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時間：色譜過程的熱力學因素控制；（組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）色譜峰變寬：色譜過程的動力學因素控制；（兩相中的運動阻力，擴散）17.3色譜分離的基本理論塔板理論速率理論

色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學和動力學問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評價指標及其關系。28第二十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日1.塔板理論最早由Martin等人提出塔板理論，把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，同時引人理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標29第二十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日塔板理論的四個基本假設（i）色譜柱是由一系列連續(xù)、等距的水平塔板組成。在柱內(nèi)每層塔板內(nèi)部，組分可以在兩相間迅速達到平衡。（ii）流動相進入色譜柱不是連續(xù)進行的，而是間歇式前進，每次前進為一個塔板體積。（iii）所有組分開始時存在于第1號塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴散可忽略。（iv）分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)。30第三十頁，共四十八頁，2022年，8月28日分配色譜過程模型的舉例根據(jù)上述假定，在色譜分離過程中，該組分分布可計算如下：開始時，若有單位質(zhì)量，即m=1（例1mg或1μg）的該組分加到第1號塔板上。由于kA=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。KB=0。（動畫）31第三十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日理論塔板高度和理論塔板數(shù)H=σ2/Ln=L/Hn=16(tR/W)2n=(tR/σ)2n=5.54(tR/W1/2)2理論塔板高度(H)和理論塔板數(shù)(n)都是柱效指標。σ或W1/2↓，H↓，柱效↑用t’R代替tR計算塔板數(shù)，稱為有效理論塔板數(shù)(nef)；求得的塔板高度為有效理論塔板高度（Hef）32第三十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日從上兩式可以看出：1：色譜峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指標。2：在同一色譜柱上，不同組分得到不同的理論塔板數(shù)，同一組分在不同色譜條件下理論塔板數(shù)也不相等。n=16(tR/w)2n=L/H33第三十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日2.速率理論1956年荷蘭學者范第姆特（VanDeemter）等在研究氣液色譜時，提出了色譜過程動力學理論——速率理論。他們吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴散和傳質(zhì)過程，從而在動力學基礎上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對氣相、液相色譜都適用。范第姆特（VanDeemter）方程的數(shù)學簡化式為式中u為流動相的線速度；A，B，C為常數(shù)，分別代表渦流擴散項系數(shù)、縱向擴散項系數(shù)、傳質(zhì)阻抗項系數(shù)?，F(xiàn)分別敘述各項系數(shù)的物理意義。34第三十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日（1）渦流擴散項的概念

在填充色譜柱中，當組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進中形成紊亂的類似“渦流”的流動，故稱渦流擴散。（動畫）35第三十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日渦流擴散項的影響因素1:渦流擴散項與填充物的平均直徑的大小和填充不規(guī)則因子有關，與流動相的性質(zhì)、線速度和組分性質(zhì)無關。2:為了減少渦流擴散，提高柱效，使用細而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對于空心毛細管，不存在渦流擴散。因此A＝0。

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子36第三十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日（2）縱向擴散項的概念

縱向擴散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加入，其濃度分布的構(gòu)型呈“塞子”狀。如右圖所示。它隨著流動相向前推進，由于存在濃度梯度，“塞子”必然自發(fā)地向前和向后擴散，造成譜帶展寬。（動畫）37第三十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日

B=2γ

Dg

γ

：擴散阻礙因子。填充柱色譜，γ

<1。

Dg：試樣組分分子在氣相中的擴散系數(shù)（cm2·s-1）

(1)存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴散;(2)擴散導致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差;(3)分子擴散項與流速有關，流速↓，滯留時間↑，擴散↑;(4)擴散系數(shù)：Dg

∝(M載氣)-1/2；M載氣↑，B值↓?？v向擴散項的影響因素38第三十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日傳質(zhì)過程的概念在氣—液填充柱中，將高沸點液體(固定液)涂在多孔性載體上構(gòu)成固定相。樣品混合物被載氣帶入色譜柱后，組分在氣—液界面進入固定液，并擴散至固定液深部，進而達到動態(tài)分配“平衡”。當純凈載氣或含有低于“平衡”濃度的載氣到來時，固定液中該組分的分子將逐次回到氣—液界面，逸出，而被載氣帶走(轉(zhuǎn)移)。這種溶解、擴散、轉(zhuǎn)移的過程稱為傳質(zhì)過程。影響此過程進行的阻力稱為傳質(zhì)阻抗，用傳質(zhì)阻抗系數(shù)描述。（3）傳質(zhì)阻抗項（動畫）39第三十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日傳質(zhì)阻抗對峰寬的影響由于液相傳質(zhì)阻抗的存在，增加了組分在固定液中停留的時間，而晚回到載氣中去。因此這些組分的分子落后于在兩相界面迅速平衡并隨同載氣流動的分子，使峰展寬，如圖所示。40第四十頁，共四十八頁，2022年，8月28日減少傳質(zhì)阻抗的辦法降低固定液液膜厚度(df)是減小傳質(zhì)阻抗系數(shù)的主要方法。在能完全覆蓋載體表面的前提下，適當減少固定液的用量。但固定液也不能太少，否則柱壽命短。且df還影響k值，df小，k小。41第四十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日載氣流速與柱效——最佳流速載氣流速高時：

傳質(zhì)阻抗項是影響柱效的主要因素，流速，柱效。載氣流速低時：

縱向擴散項成為影響柱效的主要因素，流速,柱效。H-u曲線與最佳流速：

由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對流速的一階導數(shù)有一極小值。以塔板高度H對應載氣流速u作圖，曲線最低點的流速即為最佳流速。42第四十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日速率理論的要點(1)組分