2022年醫(yī)學專題-土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

課題(kètí)2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)專題2微生物的培養(yǎng)(péiyǎng)與應用第一頁，共三十八頁。一、課題(kètí)背景1、尿素(niàosù)的利用

尿素是一種重要的農業(yè)氮肥。尿素不能直接被農作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能(cáinéng)被植物利用。2、細菌利用尿素的原因

土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3第二頁，共三十八頁。3、常見(chánɡjiàn)的分解尿素的微生物(異養(yǎng)需氧型)芽孢桿菌(gǎnjūn)、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌。硝化細菌、固氮菌、根瘤菌：硝化細菌固氮菌根瘤菌代謝方式自養(yǎng)需氧型異養(yǎng)需氧型異養(yǎng)需氧型能量來源NH3有機物豆科植物的有機物轉換過程將NH3轉變成NO2-、NO3-固氮酶催化機理總反應式為：

N2+8

e-+8

H++16

Mg·ATP+16

H2O→2

NH3+H2+16Mg·ADP

+

16

Pi在固氮酶的作用下，根瘤中的菌體將分子態(tài)氮轉化為氨態(tài)氮（同左）第三頁，共三十八頁。4、課題(kètí)目的①從土壤中分離出能夠分解尿素(niàosù)的細菌②統(tǒng)計(tǒngjì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目㈢.設置對照第四頁，共三十八頁。1、實例(shílì)：啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)(gēnjù)它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。原因：因為(yīnwèi)熱泉溫度70～800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細菌被篩選出來。DNA多聚酶鏈式反應是一種在體外將少量DNA大量復制的技術，此項技術要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。第五頁，共三十八頁。2、實驗室中微生物的篩選(shāixuǎn)原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(tóngshí)抑制或阻止其他微生物生長。第六頁，共三十八頁。15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細菌(xìjūn)的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：①從物理性質(wùlǐxìngzhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從功能上屬于哪類培養(yǎng)基？固體(gùtǐ)培養(yǎng)基②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素選擇培養(yǎng)基唯一氮源第七頁，共三十八頁?！妓伎?〗該培養(yǎng)基對微生物

（具有(jùyǒu)，不具有(jùyǒu)）選擇作用。如果具有(jùyǒu)，其選擇機制是

。具有(jùyǒu)只有能夠(nénggòu)以尿素作為氮源的微生物才能在該培養(yǎng)基上生長第八頁，共三十八頁。培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能(cáinéng)分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。4、培養(yǎng)基選擇(xuǎnzé)分解尿素的微生物的原理選擇培養(yǎng)基：在微生物學中，將允許特定(tèdìng)種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。第九頁，共三十八頁。※幾種(jǐzhǒnɡ)常見選擇培養(yǎng)基1、加入(jiārù)青霉素的培養(yǎng)基分離酵母菌、霉菌(méjūn)等真菌2、不加氮源的無氮培養(yǎng)基分離固氮菌3、不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基分離自養(yǎng)型微生物4、加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基分離金黃色葡萄球菌第十頁，共三十八頁。1.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）（1）常用(chánɡyònɡ)方法：每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋(xīshì)度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。

當樣品的稀釋(xīshì)度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。（2）原理：稀釋涂布平板法。㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目：第十一頁，共三十八頁。注意事項:①為了保證(bǎozhèng)結果準確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進行計數(shù)。②為使結果接近真實值可將同一稀釋度涂布至少3個平板，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低。第十二頁，共三十八頁。如何(rúhé)從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)？統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計3個平板，計算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式(gōngshì)進行計算教材(jiàocái)P22第十三頁，共三十八頁。2、顯微鏡直接(zhíjiē)計數(shù)：利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定(yīdìng)容積里樣品中微生物的數(shù)量。㈡.統(tǒng)計(tǒngjì)菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；缺點第十四頁，共三十八頁。實例(shílì)分析P22

你認為哪個(nǎge)同學的結果更接近真實值？你認為這兩位同學的實驗需要改進嗎？如果需要，如何改進？第十五頁，共三十八頁。實例(shílì)分析P22

第一同學只涂布了一個平板，沒有設置重復組，因此結果(jiēguǒ)不具有說服力。第二位同學考慮到設置重復組的問題，涂布了三個平板，但是其中1個平板的計數(shù)結果與2個相差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地將3個平板的計數(shù)值用來求平均值。第十六頁，共三十八頁。

設置對照的主要目的(mùdì)是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。（三）.設置(shèzhì)對照：

實例(shílì)：教材P23

原因：

⑴土樣不同⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質)第十七頁，共三十八頁。小結：通過這個事例可以(kěyǐ)看出，實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少的。方案一：由其他同學用與A同學相同(xiānɡtónɡ)土樣進行實驗方案二：將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明(zhèngmíng)培養(yǎng)基是否受到污染。結果預測：如果結果與A同學一致，則證明A無誤；如果結果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。第十八頁，共三十八頁。菌落計數(shù)配制土壤溶液系列稀釋涂布平板與培養(yǎng)根據(jù)圖示2－7填寫以下實驗(shíyàn)流程：實驗設計：第十九頁，共三十八頁。

實驗的具體操作

㈠.土壤取樣（微生物的天然培養(yǎng)基）

從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣（3-8cm），將樣品裝入事先準備(zhǔnbèi)好的信封中?！羧⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。第二十頁，共三十八頁。

準備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此共需要15個選擇培養(yǎng)基，5個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準備8個滅菌(mièjūn)的試管和1個滅菌的移液管。第二十一頁，共三十八頁?！魬诨鹧媾苑Q取土壤(tǔrǎng)10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^程中，每一步都要在火焰旁進行◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的(mùdì)：保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計數(shù)的平板[三]樣品(yàngpǐn)的稀釋第二十二頁，共三十八頁。

為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量(shùliàng)，選用的稀釋范圍相同嗎？原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層(shàngcéng)樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。結論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。第二十三頁，共三十八頁。㈣.取樣(qǔyàng)涂布◆實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記。注明培養(yǎng)基類型(lèixíng)、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等?！羧绻玫搅?個或2個以上(yǐshàng)菌落數(shù)目在30——300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)相差較大，表明實驗不精確，需要重新實驗。第二十四頁，共三十八頁。㈤.微生物的培養(yǎng)(péiyǎng)與觀察

在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目(shùmù)。

選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目。

培養(yǎng)(péiyǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)(péiyǎng)溫度。細菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d

放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d

霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。第二十五頁，共三十八頁。

當菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)(jìshù)。在同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復計數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應的稀釋度計算出樣品中細菌的數(shù)目。

第二十六頁，共三十八頁。微生物的培養(yǎng)(péiyǎng)與觀察第二十七頁，共三十八頁。（六）鑒定：篩選后必鑒定鑒別培養(yǎng)基：加入某種指示劑或化學藥品，不影響微生物的生存酚紅培養(yǎng)基：鑒定分解尿素的細菌。原理：脲酶催化(cuīhuà)尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強→酚紅變紅→脲酶陽性第二十八頁，共三十八頁。三、操作(cāozuò)提示

無菌操作(cāozuò)

做好標記(biāojì)

制定計劃

第二十九頁，共三十八頁。課題成果(chéngguǒ)與評價

（一）培養(yǎng)(péiyǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)(péiyǎng)基是否篩選出菌落

對照的培養(yǎng)(péiyǎng)皿在培養(yǎng)(péiyǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。第三十頁，共三十八頁。如果學生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計的結果應該接近。如果結果相差太遠，需要(xūyào)進一步分析產(chǎn)生差異的原因。（二）樣品的稀釋操作(cāozuò)是否成功

如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說明稀釋操作比較成功(chénggōng)，并能夠進行菌落的計數(shù)。

（三）重復組的結果是否一致第三十一頁，共三十八頁。1.水中大腸桿菌數(shù)目的檢測（P26）

伊紅美藍培養(yǎng)基2.空氣中微生物總數(shù)的檢測3.牛奶中細菌的分離(fēnlí)與計數(shù)4.土壤中真菌（或放線菌）的分離與計數(shù)相關(xiāngguān)連接：第三十二頁，共三十八頁。相關(xiāngguān)連接：空氣中微生物總數(shù)(zǒngshù)的檢測第三十三頁，共三十八頁。本課題(kètí)知識小結:第三十四頁，共三十八頁。1.對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（）

A.在液體培養(yǎng)基上進行B.至少接種一種細菌

C.接種一個細菌D.及時補充消耗的營養(yǎng)物質2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）

A.培養(yǎng)細菌

B.培養(yǎng)真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他(qítā)微生物加以區(qū)別3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素實踐(shíjiàn)訓練A

CD第三十五頁，共三十八頁。4.下列說法不正確的是（）

A.科學家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶

B.統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值

C.設置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度

D.同其他生物環(huán)境相比(xiānɡbǐ)，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（）

A.較多的氮源物質B.較多的碳源物質

C.青霉素類藥物D.高濃度食鹽BC第三十六頁，共三十八頁。（09，寧夏，15分）（1）在大腸桿菌培養(yǎng)過程中，除考慮(kǎolǜ)營養(yǎng)條件外，還要考慮(kǎolǜ)______、______和滲透壓等條件。由于該細菌具有體積小、結構簡單、變異類型容易選擇、______、______等優(yōu)點，因此常作為遺傳學研究的實驗材料。（2）在微生物培養(yǎng)操作過程中，為防止雜菌污染，需對培養(yǎng)