HPLC色譜柱選擇與維護(hù)保養(yǎng)(安捷倫科技)

HPLC色譜柱選擇與維護(hù)(Hu)保養(yǎng)Sa安捷倫科技

第一頁，共六十七頁。安捷倫HPLC色譜(Pu)柱選擇第二頁，共六十七頁。分(Fen)離模式的選擇樣品溶于有機(jī)溶劑溶于水溶于四氫呋喃非離子化離子化溶于有機(jī)溶劑溶于水溶于正己烷溶于甲醇或甲醇/水或乙腈或乙腈/水用硅膠的正相模式用鍵合相的正相模式用鍵合相的反相模式用鍵合相的反相模式低分子凝膠滲透色譜用鍵合相的反相模式抑制電離反相鍵合相色譜離子對(duì)鍵合相的反相模式用硅膠的正相模式離子交換模式凝膠滲透色譜凝膠過濾色譜大孔填料的離子交換模式用大孔填料的反相模式分子量>2,000分子量<2,000第三頁，共六十七頁。

反(Fan)相分配色譜極性:固定相<流動(dòng)相 固定相-非極性 流動(dòng)相(甲,乙醇,乙腈,THF,二氯乙烷)-極性 非極性物質(zhì)后出峰正相吸附色譜

極性:固定相>流動(dòng)相 固定相-極性 流動(dòng)相(己烷,庚烷)-非極性 極性物質(zhì)后出峰正相色譜20%反相色譜80%正相&反相色譜第四頁，共六十七頁。

硅膠基質(zhì)-pH3~8Al2O3

.nH2O-pH1~14

聚合(He)物基質(zhì)-pH1~14高或低pH下,硅膠會(huì)溶解化學(xué)修飾困難孔結(jié)構(gòu)復(fù)雜,孔徑不均勻?qū)е轮Р粔蚋?有機(jī)溶劑可能導(dǎo)致聚合物基質(zhì)溶漲而受損柱填料基質(zhì)第五頁，共六十七頁。C-18柱---性能(Neng)影響因素鍵合類型碳覆蓋率封端化學(xué)性質(zhì)物理性質(zhì)硅膠純度色譜柱尺寸顆粒形狀粒徑表面積孔徑第六頁，共六十七頁。硅膠純度 ?填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度色譜柱尺寸 ?填料床的長(zhǎng)度和內(nèi)徑顆(Ke)粒形狀 ?球型或不規(guī)則型粒徑 ?平均顆粒直徑,通常3-10μm表面積 ?顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和,以m2/gram表示孔徑 ?顆粒的孔或腔的平均尺寸,范圍80-300?色譜柱物理性質(zhì)C-18柱---性能影響因素第七頁，共六十七頁。鍵合類型 ?單體鍵合-鍵合相分子與基體單點(diǎn)相連 ?聚合體鍵合-鍵合相分子與基體多點(diǎn)相連碳覆蓋率 ?與基體物質(zhì)相連的鍵合相的量封端

?鍵合步驟之后,用短鏈(Lian)將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來色譜柱化學(xué)性質(zhì)C-18柱---性能影響因素第八頁，共六十七頁。A類硅膠OriginalZORBAXSIL(1970s)由于帶負(fù)電荷的殘留硅羥基和酸性表面上金屬含(Han)量高(硅羥基的pKa低),導(dǎo)致堿性化合物發(fā)生拖尾B類硅膠(高純)ZORBAXRx-Sil(1987)由于金屬含量低,硅羥基pKa高,堿性化合物不發(fā)生拖尾ZorbaxRx-SIL:11種金屬<35ppm(未檢出其他雜質(zhì),<1ppm);99.995%純度的二氧化硅C-18柱---性能影響因素第九頁，共六十七頁。ZORBAX?生產(chǎn)工(Gong)藝硅膠+脲(pH=2)+甲醛CH2O孔徑80A&300A

DO2250oC粒徑1.8μm3.5μm5.0μm7.0μm微球表面的略微融合專利技術(shù)增強(qiáng)了硅膠填料的耐流動(dòng)相沖刷能力---Zorbax色譜柱使用壽命長(zhǎng)的技術(shù)保障安捷倫擁有此項(xiàng)溶膠-凝膠填料專利技術(shù)StableBondEclipseXDBBonus-RPExtendZORBAXRx多孔硅膠微球第十頁，共六十七頁。色譜柱(Zhu)尺寸---對(duì)色譜分離的影響 ?短柱(15-100mm)-運(yùn)行時(shí)間短,柱壓低 ?長(zhǎng)柱(150-250mm)-分辨率高,運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng) ?窄徑柱(2.1mm)-檢測(cè)器靈敏度高 ?寬徑柱(3-21.2mm)-載樣量高C-18柱---性能影響因素第十一頁，共六十七頁。顆粒形狀---對(duì)色譜分離的影響

當(dāng)使用黏度較大的流動(dòng)(Dong)相50:50=MeOH:H2O時(shí),球型顆粒可以降低柱壓,延長(zhǎng)色譜柱壽命C-18柱---性能影響因素球形不規(guī)則形粒徑---對(duì)色譜分離的影響

較小的顆粒柱效較高,但會(huì)引起柱壓過高.3.5μm粒徑的常用于分離復(fù)雜的多組份樣品,而組份單一的樣品多采用5μm的粒徑1.8μm3.5μm 5μm 7μm 10μm第十二頁，共六十七頁。表面積---對(duì)色譜分離的影響(Xiang)

高表面積對(duì)于多組份樣品的分離具有較強(qiáng)的保留能力,柱容量和分離度.表面積低的填料通常能迅速達(dá)到平衡狀態(tài),對(duì)于梯度淋洗尤為重要C-18柱---性能影響因素孔徑---對(duì)色譜分離的影響

大孔的填料顆?？梢匝娱L(zhǎng)溶質(zhì)大分子在填料表面滯留的時(shí)間,達(dá)到充分分離,改善峰形樣品MW4,000,選擇80?的孔徑樣品MW>4,000,選擇300?的孔徑第十三頁，共六十七頁。大孔徑填料適用于大分子(Zi)分析大孔徑300?全多孔色譜柱可用于分離蛋白質(zhì)和多肽

分子量雖小但hydrodynamicvolume(水動(dòng)力學(xué)體積)較大的分子Poroshell色譜柱

高流速下,高柱效分析大分子的蛋白質(zhì)和多肽色譜柱填料孔徑必須適合待測(cè)物分子自由進(jìn)出填料孔,與孔內(nèi)表面的鍵合相進(jìn)行分離分配第十四頁，共六十七頁。300?孔徑可改善蛋白質(zhì)(Zhi)和多肽峰形0.2000.020.040.060.040.160.18300SB-C18(300?)SB-C18(80?)PW1/2LeuEnkephalinM.W.=556AngiotensinII(血管緊張素II)M.W.=1046InsulinBM.W.=3,496CytCM.W.=12,327Rnase(核糖核酸酶)M.W.=13,684Lysozyme(溶菌酶)M.W.=13,900孔徑,分子量對(duì)峰寬的影響(梯度分離)選擇合適的填料孔徑分析大分子可獲得最佳峰形第十五頁，共六十七頁。300?孔徑可改善大分子(Zi)的峰形色譜柱:4.6x150mm,5mm流動(dòng)相:60%MeOH:40%0.1%三氟乙酸流速:0.75mL/min溫度:RT 檢測(cè)器:UV282nm溶液中的分子尺寸決定適宜的色譜柱孔徑窄的峰寬表明待測(cè)分子進(jìn)入填料孔沒有受到阻礙SB-C3(80?)300SB-C3(300?)Pw1/2=0.442Pw1/2=0.125OONHOHOCHOHOOHOHOOOOOOOCH3CH3OCH3OCH3CH3CH2CH2CH2CH3CH3CH3H3CH3CH3C0510Time(min)0510Time(min)Tylosin(泰樂菌素)MW.926分子量雖小但hydrodynamicvolume(水動(dòng)力學(xué)體積)較大的分子第十六頁，共六十七頁。鍵合類型---對(duì)色譜分離的影響

單齒鍵合：提高傳質(zhì)速率,加快色譜柱(Zhu)平衡雙齒鍵合：增加色譜柱穩(wěn)定性,增加色譜柱的載樣量C-18柱---性能影響因素CHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333SiSiOOSiSiOO第十七頁，共六十七頁。碳覆蓋率---對(duì)色(Se)譜分離的影響

高碳覆蓋率：提高分辨率,分析時(shí)間長(zhǎng)低碳覆蓋率：縮短運(yùn)行時(shí)間封端---對(duì)色譜分離的影響

封端：減輕待測(cè)組份與硅膠表面殘留的酸性硅羥基反應(yīng)而引起的色譜峰拖尾現(xiàn)象對(duì)于極性樣品,未封端與經(jīng)過封端處理的色譜柱在選擇性上有明顯差異C-18柱---性能影響因素第十八頁，共六十七頁。固定相鍵合二甲基硅(Gui)烷

封端四甲基硅烷SiOOHOOCH3SiRCH3CH3SiCH3CH3SiRCH3R=C8,

C18,

etc.OOHOHOCH3SiRCH3CH3SiRCH3++ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3ClRCH3(TMS)傳統(tǒng)鍵合及封端技術(shù)第十九頁，共六十七頁。取代基(Ji)：五個(gè)旁側(cè)基團(tuán):異丙基ZorbaxStableBond空間位阻保護(hù)---抗水解能力鍵合相流失,保留減弱另一個(gè)裸露的硅羥基,潛在的拖尾因素普通硅膠柱低pH<2不穩(wěn)定,發(fā)生水解安捷倫專利的空間位阻保護(hù)第二十頁，共六十七頁。液相柱---保留值與pH的(De)關(guān)系

pH變化值0.1RS變化值1.6色譜柱：ZorbaxStableBondC184.6X250mm,5um部件號(hào)：880975-906流動(dòng)相：27%甲醇：73%磷酸pH2.5&2.6溫度：500C流速：1.0mL/min.第二十一頁，共六十七頁。12346750123456Time(min)01234561234675Time(min)pH7.00pH7.25色譜柱:ZORBAXEclipseXDB-C84.6x75mm,3.5μm流動(dòng)相:44%25mM磷酸,pH7.00:56%甲醇流速:1.0mL/min溫度(Du):25°C檢測(cè):UV250nm可電離的組份的分離可能會(huì)隨pH變化發(fā)生顯著變化—甚至很小的0.05–0.25個(gè)pH變化單位.樣品:ketoprofenethylparabenHydrocortisonefenoprofenpropylparabenPropranololibuprofen液相柱---保留值與pH的關(guān)系0.25個(gè)pH第二十二頁，共六十七頁。液相(Xiang)柱---保留值與pH的關(guān)系pH變化：0.2個(gè)pH(7.0~7.2)保留時(shí)間改變：1.2分鐘(13.6~14.8分鐘)保留時(shí)間隨pH改變不明顯保留時(shí)間隨pH改變不明顯(酸性環(huán)境中)第二十三頁，共六十七頁。保留時(shí)間酸性組份中性組份堿性組份方法穩(wěn)定區(qū)方法波(Bo)動(dòng)區(qū)(pKa+1.5)

方法穩(wěn)定區(qū) 液相柱---保留值與pH的關(guān)系第二十四頁，共六十七頁。液(Ye)相柱---保留值與pH的關(guān)系StableBondC18pH1~8

Bonus-RPpH2~9

ExtendC18pH2~11.5

EclipseXDBC18pH2~9

第二十五頁，共六十七頁。復(fù)(Fu)雜組分的流動(dòng)相pH選擇技巧色譜柱:ZORBAXExtend-C184.6x150mm,5mm流動(dòng)相:30%緩沖液:70%MeOHpH7緩沖液20mMNa2HPO4pH11緩沖液20mMTEA流速:1.0mL/min

溫度:RT 檢測(cè)器:UV254nm0512,345Time(min)76Extend-C18pH71.Maleate馬來酸鹽2.Scopolamine東莨菪堿pKa7.63.PseudoEphedrine假麻黃堿pKa9.84.Doxylamine抗敏安(多西拉敏)pKa9.25.Chlorpheniramine氯苯吡胺pKa9.16.Triprol內(nèi)徑ine苯丙烯啶pKa6.57.Diphenhydramine苯海拉明pKa9.0Extend-C18pH1105101234Time(min)657高pH下,堿性成分的保留增加待測(cè)物pKa+1.5以外的流動(dòng)相pH可保證方法的穩(wěn)定性第二十六頁，共六十七頁。Zorbax色譜柱發(fā)展(Zhan)史

1973ZORBAXSIL 發(fā)明專用于HPLC分離的球狀、小顆粒硅膠(專利)1977ZORBAXODS 單官能團(tuán),單層鍵合相發(fā)明者之一1978ZORBAXcolumn 首先推出色譜柱的質(zhì)量信譽(yù)保證1982ZORBAXGF-250 改善了蛋白質(zhì)尺寸分離的穩(wěn)定性1987ZORBAXRx-SIL 推出適合堿性化合物的HPLC分離的全新硅溶膠技術(shù)(專利)1990ZORBAXStableBond

增強(qiáng)了低pH條件下鍵合相的穩(wěn)定性(專利)1996ZORBAXEclipseXDB

雙封端技術(shù)提高了中等pH條件下鍵合相的穩(wěn)定性(專利)1997ZorbaxLC/MScolumn 15和30mm(3.5um)快速,高分辨率,高通量LC/MS色譜柱1998ZORBAXBonus-RP

極性鍵合技術(shù)使堿性化合物的分離得到改善(專利)1999ZORBAXCombiHT 專為小規(guī)模組合化學(xué)樣品制備設(shè)計(jì)的高通量色譜柱1999ZORBAXEclipsedsDNA用于分析雙鏈DNA的多孔硅膠柱1999ZORBAXCarbohydrate 分析單,雙,三糖和糖醇的專用柱1999ZorbaxExtendC18

獨(dú)特寬pH跨度,高pH下使用的硅膠基質(zhì)色譜柱(專利)2001ZorbaxSB-aq 可在低pH下(1~8)使用100%水相的填料(專利)2002ZorbaxPoroshell300SB 蛋白質(zhì)高速,高效反相分離新填料2002ZORBAX3.0mm內(nèi)徑. 3-mm柱徑溶劑節(jié)省柱2003ZORBAXsub2micron 1.8um粒徑的高通量,超高速色譜柱(5月1日上市)2003ZORBAXPrepHT 高通量全系列制備柱---分析柱向制備柱直接放大(6月1日上市)第二十七頁，共六十七頁。鍵合相-適(Shi)用pH范圍StableBond,pH1-81.使用空間位阻大的硅烷2.未-封端EclipseXDB,pH2-91.致密鍵合的二甲基烷基硅烷2.專利技術(shù)雙-封端Bonus-RP,pH2-91.極性烷基固定相2.使用空間位阻大的硅烷3.三封端Extend-C18,pH2-11.51.獨(dú)特的雙齒鍵合結(jié)構(gòu)2.雙封端SiOSiOSilicaSupportC18C18SiONHOSilica-based色譜柱PackingwithAlkyl/am內(nèi)徑eStationaryPhaseORRSiOHSiOSiRRROOHRCHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333ORSiSiOSiORR1CH3CH3CH3CH3RR1CH3R1R1R1CH3R111SiSiPGPGPGR1R1極性官能團(tuán)低pH下,分析酸性,堿性和中性組分,峰形優(yōu)異,柱壽命長(zhǎng)中等pH下,分析酸性,堿性和中性組分,尤其堿性組分峰形優(yōu)異,柱壽命長(zhǎng)中等pH下,分析酸性,堿性和中性組分,可用于100%全水相,尤其極性組分峰形優(yōu)異,柱壽命長(zhǎng)中~高pH下,分析酸性,堿性和中性組分,,尤其堿性組分峰形優(yōu)異,柱壽命長(zhǎng)第二十八頁，共六十七頁。SB-C1880A&300ApH:1~8SB-C880A&300ApH:1~8SB-苯(Ben)基80ApH:1~8反相色譜柱Bonus-RP空間位阻保護(hù)+三封端80ApH:2~9Extend-C1880A&300ApH:2~11.5EclipseXDB雙封端EclipseXDB-C1880ApH:2~9EclipseXDB-C880ApH:2~9EclipseXDB-苯基80ApH:2~9StableBond空間位阻保護(hù)Poroshell300SB-C18實(shí)心核多孔殼pH:1~8SB-CN80A&300ApH:1~8SB-C380A&300ApH:1~8Zorbax產(chǎn)品系列SB-AQ空間位阻保護(hù)80ApH:1~8可使用100%水相Extend雙齒鍵合+雙封端低pH中pH高pH第二十九頁，共六十七頁。安捷倫HPLC色譜(Pu)柱維護(hù)保養(yǎng)第三十頁，共六十七頁。Zorbax色譜柱=高柱效+長(zhǎng)壽(Shou)命min00.511.52Norm.01020304050

色譜柱: ZORBAXSB-C18 4.6x30mm,1.8um流動(dòng)相: 60%甲醇:40水流速: 1mL/min溫度: 室溫檢測(cè): UV254nm柱效進(jìn)樣次數(shù) #3 #41 6635 6138100 6857 6372200 6882 6381300 6895 6381400 6883 6294500 6815 6312600 6687 6236700 6653 6115800 6695 6221900 6781 63006810 63021300 6858 65282034 6823 63431234樣品尿嘧啶苯酚4-Cl-硝基苯甲苯第三十一頁，共六十七頁。色譜柱柱內(nèi)體積和平衡時(shí)(Shi)間單次樣品運(yùn)行時(shí)間=分析時(shí)間+色譜柱平衡時(shí)間色譜柱平衡時(shí)間=10倍柱內(nèi)體積÷流速

4.6x50 0.5mL 5min 4.6x30 0.3mL 3min 4.6x15 0.15mL 1.5min 4.6x150 1.54mL 15min

2.1x50 0.10mL 5min 60sec 2.1x30 0.06mL 3min 36sec 2.1x15 0.03mL 1.5min 18sec

色譜柱 柱內(nèi)平衡時(shí)間 尺寸 體積流速

(mm) (Vm)1.0mL/min

色譜柱 柱內(nèi)平衡時(shí)間 尺寸 體積流速

(mm) (Vm)0.2mL/min1.0mL/min第三十二頁，共六十七頁。清(Qing)洗液相色譜柱沖洗色譜柱---用比流動(dòng)相更強(qiáng)的溶劑反相色譜柱用以下溶劑至少各25mL沖洗色譜柱(分析柱)不含緩沖鹽的流動(dòng)相100%甲醇100%乙腈75%乙腈+25%異丙醇100%異丙醇100%二氯甲烷*100%己烷**若使用己烷或二氯甲烷沖洗色譜柱,則在重新使用反相流動(dòng)相以前,必須用異丙醇沖洗色譜柱!!!正相色譜柱用以下溶劑至少各50mL沖洗色譜柱(分析柱)50%甲醇+50%三氯甲烷100%乙酸乙酯第三十三頁，共六十七頁。<0.12mm內(nèi)(Nei)徑管線用于毛細(xì)管HPLC中<2.1內(nèi)徑色譜柱0.17mm內(nèi)徑管線用于分析型HPLC中2.1~4.6內(nèi)徑色譜柱0.25mm內(nèi)徑管線用于半制備型HPLC中9.4內(nèi)徑色譜柱0.5mm內(nèi)徑管線用于制備型HPLC中21.2內(nèi)徑色譜柱連接管線與接頭色譜柱:StableBondSB-C18,4.6x30mm,3.5mm流動(dòng)相:85%H2Owith0.1%三氟乙酸:15%ACN流速:1.0mL/min溫度:35°C50

mL柱外體積（管線）4321Time(min)0.00.51.01.52.010mL柱外體積Time(min)0.00.51.01.52.04321樣品:1.苯丙胺酸2.5-苯基-3,6-二氧-2-哌嗪乙酸3.Asp-Phe4.天冬甜素第三十四頁，共六十七頁。HPLC常用的色(Se)譜柱接頭TroubleshootingLCFittings,PartII.J.W.DolanandP.Upchurch.LC/GCMagazine6:788(1988)0.09in.=2.33mmSwagelok安捷倫1100液相ParkerValcoUptight0.09in.=2.33mm0.08in.=2.07mm0.09in.=2.33mm0.13in.=3.37mm0.17in.=4.40mmWatersRheodyne第三十五頁，共六十七頁。如果伸出的管線長(zhǎng)度過長(zhǎng)，可能漏液

螺母坡度不匹配，密封性差

死體積區(qū)如果伸出的管線長(zhǎng)度不夠，可能產(chǎn)生死體積HPLC常用的色譜(Pu)柱接頭第三十六頁，共六十七頁?；钊?Sai)桿與密封圈藍(lán)寶石活塞桿 1/包裝 部件號(hào)：5063-6586活塞桿密封圈（Vespel聚酰亞胺用于反相） 2/包裝 部件號(hào)：5063-6589*己烷對(duì)Vespel聚酰亞胺有溶漲作用活塞桿密封圈（聚乙烯用于正相） 2/包裝 部件號(hào)：0905-1420

第三十七頁，共六十七頁。樣品:尿嘧啶苯酚N,N-二甲基(Ji)苯胺更換前 更換后色譜柱:Bonus-RP4.6x75mm,3.5mm流動(dòng)相:30%H2O

:70%MeOH流速:1.0mL/min 溫度：室溫檢測(cè)器:UV254nm0.00.51.01.5Time(min)2130.00.51.01.52.0Time(min)213塔板數(shù) USP拖尾因子(5%)1.2235 1.722.3491 1.483.5432 1.15塔板數(shù) USP拖尾因子(5%)1. 3670 1.452. 10457 1.093. 10085 1.00活塞桿與密封圈第三十八頁，共六十七頁。檢(Jian)測(cè)器用燈第三十九頁，共六十七頁。檢測(cè)器(Qi)用燈第四十頁，共六十七頁。檢(Jian)測(cè)器用燈第四十一頁，共六十七頁。1.DAD的氘燈替代VWD的氘燈關(guān)閉燈電源,冷卻5min以上將lamp設(shè)定的VWDconfiguration的燈類型改為2140-05902.燈能量測(cè)試以水為流動(dòng)相燈預(yù)熱10min以上在化學(xué)工作站Diagnosis狀(Zhuang)態(tài)下進(jìn)行波長(zhǎng)校準(zhǔn),將紫外燈的使用時(shí)間歸零

DAD的氘燈替代VWD的氘燈第四十二頁，共六十七頁。DAD故障診(Zhen)斷與維護(hù)要進(jìn)行DAD故障診斷,單擊DAD圖標(biāo),然后選擇ShowModuleTest選項(xiàng),進(jìn)入DAD測(cè)試選項(xiàng)畫面DAD故障診斷測(cè)試共有8項(xiàng)內(nèi)容：DADSelf-TestDADIntensityTestDADCellTest常做的DAD維護(hù)：更換燈清洗或更換流動(dòng)池窗第四十三頁，共六十七頁。Diagnosis界面故(Gu)障原因分析故障選擇框可能原因框

診斷過程故障分析樣品分析過程中故障分析在Diagnosis畫面中為用戶提供了在診斷過程或樣品分析過程中出現(xiàn)的問題以及可能的原因第四十四頁，共六十七頁。樣(Yang)品溶劑溶解強(qiáng)度樣品溶劑溶解能力強(qiáng)于流動(dòng)相導(dǎo)致色譜峰峰形問題：裂分峰或?qū)挿迳V柱:ZORBAXStableBondSB-C8,4.6x150mm,5mm流動(dòng)相:82%H2O:18%ACN進(jìn)樣體積:30mLA. 樣品溶劑 100%乙腈010Time(min)12B. 樣品溶劑 流動(dòng)相010Time(min)12樣品:1.Caffeine(咖啡因)2.Salicylamide(水楊酰胺)第四十五頁，共六十七頁。中性分析時(shí)為何(He)要使用緩沖液？色譜柱:ZORBAXEclipseXDB-C8,4.6x75mm,3.5μm流動(dòng)相:44%A:56%甲醇流速:1.0mL/min 溫度:25°C 檢測(cè):UV250nm含緩沖液的流動(dòng)相可改善保留,分離和色譜峰峰形.樣品:1.pranolol7.ibuprofenA=pH7.0水A=pH7.0水+25mM磷酸緩沖液012345Time(min)1234675012341,4,6,7235Time(min)第四十六頁，共六十七頁。02.55.07.5Time(min)12345602.55.0Time(min)123456增加緩沖液濃(Nong)度減少拖尾色譜柱: ZORBAXEclipseXDB-C8 4.6x150mm,5mm流動(dòng)相: 40%磷酸鹽緩沖液 60%ACN流速: 1.5mL/min.溫度: 40°CUSPTf1.621.651.631.771.831.1210mM磷酸鹽pH7.0USPTf1.411.501.331.391.361.0025mM磷酸鹽pH7.0在中等pH下,離子強(qiáng)度較高,能有效掩蔽硅羥基的二次作用減少拖尾樣品: TricyclicAntidepressants（三環(huán)抗抑郁劑）1.Desipramine（脫甲丙咪嗪）2.Nortriptyline（去甲替林）3.Doxepin（多塞平）4.Imipramine（丙咪嗪）5.Amitriptyline（阿米替林）6.TrImipramine（三甲丙咪嗪）第四十七頁，共六十七頁。TEA對(duì)堿性成分(Fen)峰形的影響02.55.0Time(min)12345色譜柱:ZORBAXEclipseXDB-C8,4.6x150mm,5mm流動(dòng)相:85%25mMNa2HPO4:15%ACN流速:1.0mL/min.溫度:35°CUSPTF5%1.1.29 2.1.333.1.634.2.355.1.57NoTEA10mMTEAUSPTF5%..265.1.14Time(min)0.02.55.035421pH7樣品:1.Phenylpropanolamine（去甲麻黃堿）2.Ephedrine（麻黃素）3.Amphetamine（苯丙胺）4.MethAmphetamine（脫氧麻黃堿）5.Phenteramine（苯丁胺）第四十八頁，共六十七頁。競(jìng)爭(zhēng)酸對(duì)(Dui)酸性組分的峰形的影響色譜柱: ZORBAXStableBondSB-C18 4.6x150mm,5mm流動(dòng)相: 40%A:60%ACN流速: 1.0mL/min.溫度: 室溫樣品: Ibuprofen（異丁苯丙酸）pKa4.4pH35mMNaH2PO4Tf=1.8pH35mMNaH2PO41%乙酸pH2.50.1%三氟乙酸Tf=1.0Tf=1.09A:乙酸和三氟乙酸均能作為競(jìng)爭(zhēng)酸填加至流動(dòng)相中三氟乙酸由于所需濃度較低,可作為首選第四十九頁，共六十七頁。色譜柱技術(shù)–5988-6467EN流動(dòng)相對(duì)色譜的影(Ying)響(TE40)液相色譜柱:ZORBAXEclipseXDB-C8色譜柱尺寸:4.6x50mm3.5μm部件號(hào):935967-906UV:254nm流速:1mL/min.室溫UracilButylparabenNaphthaleneDipropylphthalateAcenaphthene尿嘧啶尼帕爾金丁酯萘二丙基鄰苯二甲酸酯苊刻度混合:Dial-a-MixA:水B:甲醇,用泵抽取50%B體積比混合:Vol/Vol250mL水+250mL甲醇,用泵抽取100%混合液定容混合:Mix-to-Mark

250mL甲醇,用水定容至500mL,用泵抽取100%混合液預(yù)混合（重量比混合）:Premixed(w/w)200g甲醇+200g水,用泵抽取100%混合液改變流動(dòng)相配比方式,可增加柱效（提高靈敏度）第五十頁，共六十七頁。液(Ye)相分析-小訣竅提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）減小柱內(nèi)徑，可增加柱效（提高靈敏度）縮短檢測(cè)器響應(yīng)時(shí)間，可增加柱效（提高靈敏度）減小柱外體積，可增加柱效（提高靈敏度）使用超純硅膠，可增加柱效（提高靈敏度）使用高能量氘燈，可增加柱效（提高靈敏度）使用中孔透光氘燈，可增加柱效（提高靈敏度）改變流動(dòng)相pH，可增加柱效（提高靈敏度）改變有機(jī)相%

，可增加柱效（提高靈敏度）改變鍵合相

，可增加柱效（提高靈敏度）改變有機(jī)添加劑

，可增加柱效（提高靈敏度）改變流動(dòng)相配比方式

，可增加柱效（提高靈敏度）第五十一頁，共六十七頁。生化–多肽-5988-6316EN升溫對(duì)于反相HPLC分(Fen)離強(qiáng)疏水肽的影響(B27)Polypeptide流動(dòng)相:A:含0.05%三氟乙酸的水B:含0.05%三氟乙酸的乙腈2%B/min進(jìn)樣量:100μL(50μg的6M脲/5%乙酸)UV:210nm流速:1mL/min室溫液相色譜柱:ZORBAXStableBond-C18色譜柱尺寸:4.6x250mm5μm部件號(hào):880975-902 室溫300C400C500C600C700C提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）第五十二頁，共六十七頁。環(huán)(Huan)保樣品: 除草劑 流動(dòng)相: 52/480.1M乙酸鈉/甲醇,pH6 流速: 0.45mL/min 溫度: 40℃,90℃ 檢測(cè): UV 除草劑:柱溫的影響Herbicides:EffectofColumnTemperature1.西瑪津2.敵草隆3.撲滅津4.撲滅凈5.異丙甲草胺1.Simazine2.Diuron3.Propazine4.Prometryn5.Metolachlor液相色譜柱:ZorbaxStableBond-C18色譜柱尺寸:4.6x150mm,5μm部件號(hào):883975-902目錄P62540℃90℃ 提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）第五十三頁，共六十七頁。生物制(Zhi)藥液相色譜柱:Zorbax300StableBond-C3色譜柱尺寸:4.6x150mm,5μm部件號(hào):883995-909 肽類/蛋白質(zhì):升溫對(duì)分離的影響Peptides/Proteins:EffectofElevatedTemperature樣品: 多肽 流動(dòng)相: A=5:95,乙腈:水,0.10%三氟乙酸(V/V%) B=95:5,乙腈:水,0.085%三氟乙酸(V/V%)梯度: 在20min內(nèi)15-53%,后運(yùn)行時(shí)間12min 流速: l.0mL/min 溫度: 室溫-60℃ 檢測(cè): UV215nm 1.亮氨酸腦啡呔2.血管緊張素II3.核糖核酸酶A4.牛胰島素5.細(xì)胞色素C6.溶菌酶7.肌紅蛋白8.碳酸酐酶1.LeucineEnkephalin2.AngiotensinII3.RnaseA4.Insulin(BOV)5.CytochromeC6.Lysozyme7.Myoglobin8.Carbonicanhydrase目錄P611提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）第五十四頁，共六十七頁。生(Sheng)物制藥液相色譜柱:ZorbaxStableBond-C8色譜柱尺寸:150mm,5μm減小毛細(xì)管內(nèi)徑來提高低濃度樣品的檢測(cè)靈敏度ReducingCapillaryIDtoImproveSensitivityforConcentration-LimitedSamples流動(dòng)相: 60%乙腈/40%水 流速: 內(nèi)徑0.3mm-4uL/min

內(nèi)徑0.5mm-10uL/min

內(nèi)徑1.0mm-50uL/min

內(nèi)徑4.6mm-1.0uL/min 溫度: 室溫 檢測(cè)器: UV254nm 樣品: 200ng聯(lián)二苯(100nl) 目錄P611減小柱徑，可增加柱效（提高靈敏度）第五十五頁，共六十七頁。色譜柱技術(shù)–5988-6454EN使用小體積色譜柱對(duì)于檢測(cè)器響應(yīng)時(shí)間的重要(Yao)性(TE32)液相色譜柱:ZORBAXStableBond-C18色譜柱尺寸:4.6x15mm3.5μm部件號(hào):831975-902流動(dòng)相:乙腈:1%甲酸=32:68UV:254nm流速:1.0mL/min.30°C進(jìn)樣量:5μL響應(yīng)時(shí)間:4.0秒響應(yīng)時(shí)間:2.0秒響應(yīng)時(shí)間:1.0秒響應(yīng)時(shí)間:0.5秒響應(yīng)時(shí)間:0.1秒尿嘧啶乙酰水楊酸N-乙酰苯胺UracilAcetylsalicylicacidAcetanilide縮短檢測(cè)器響應(yīng)時(shí)間，可增加柱效（提高靈敏度）第五十六頁，共六十七頁。色譜柱技術(shù)–5988-6428EN不同(Tong)硅膠類型比較(TE1)流動(dòng)相:含0.05%甲醇的二氯甲烷

液相色譜柱toluenebenzanilidephenolbenzylalcoholZorbaxSilSpherisorbZorbaxRx-Sil甲苯N-苯甲酰苯胺苯酚苯甲醇使用高純硅膠，可增加柱效（提高靈敏度）第五十七頁，共六十七頁。有機(jī)化(Hua)學(xué)–5988-6366ENpH對(duì)苯胺取代物分析的影響(ORCH1)流動(dòng)相25mM磷酸:甲醇=58:42流速:1mL/min22°C液相色譜柱:ZORBAXStableBond-C18色譜柱尺寸:4.6x150mm5μm部件號(hào):883975-902對(duì)位甲氧基苯胺間位苯甲胺3-氨基-苯甲腈對(duì)位氯苯胺間位氯苯胺鄰位氯苯胺p-anisidinem-toluidine3-amino-benzonitrilep-chloroanilinem-chloroanilineo-chloroanilinepH:2.5pH:7.0 改變流動(dòng)相pH，可增加柱效（提高靈敏度）第五十八頁，共六十七頁。生化–肽–5988-6293EN三氟乙酸濃度對(duì)于反相肽的分離(Li)的影響(B10) Peptide流動(dòng)相:A:水和三氟乙酸B:乙腈和三氟乙酸0-30%B（30min.內(nèi)）流速:1mL/minUV:254nm進(jìn)樣量:6uL十肽菌素標(biāo)樣S1-S5（疏水性有略微差異）40°C液相色譜柱:ZORBAX300SB-C8色譜柱尺寸:4.6x150mm5μm部件號(hào):883995-906

1.0%三氟乙酸0.05%三氟乙酸0.25%三氟乙酸改變流動(dòng)相pH，可增加柱效（提高靈敏度）第五十九頁，共六十七頁。食品分析–5988-6360EN流動(dòng)相強(qiáng)度對(duì)單糖和二糖分離(Li)的影響(FD4)流動(dòng)相:乙腈/水如圖流速:1mL/min示差折光檢測(cè)器液相色譜柱:ZORBAXNH2色譜柱尺寸:4.6x250mm5μm部件號(hào):880952-708果糖葡糖蔗糖Palatinose海藻糖異麥芽糖FructoseGlucoseSaccharosePalatinoseTrehaluloseIsomaltose乙腈/水70/30

乙腈/水75/25 改變有機(jī)相%，可增加柱效（提高靈敏度）第六十頁，共六十七頁。色譜柱技術(shù)–5988-6468EN有機(jī)改性劑(Ji)和pH對(duì)于選擇性的影響(TE5)流動(dòng)相:25mM磷酸緩沖液流速:1.0mL/min.22°C液相色譜柱:ZORBAXStableBond-CN色譜柱尺寸:4.6x150mm5μm部件號(hào):883975-905anisidinem-toluidine4-cl-aniline3-aminobenzonitrile3-cl-aniline2-cl-aniline甲氧基苯胺間位苯甲胺4-氯-苯胺3-氨基苯甲腈3-氯-苯胺2-氯-苯胺42%甲醇：58%緩沖液 30%甲醇：70%緩沖液pH2.6pH3.0改變有機(jī)相%，可增加柱效（提高靈敏度）第六十一頁，共六十七頁。色譜柱技術(shù)–5988-6453ENZORBAXEclipse系列色譜柱的選(Xuan)擇性(TE31)液相色譜柱:ZORBAXEclipseXDB-Phenyl色譜柱尺寸:4.6x150mm5μm部件號(hào):993967-912流動(dòng)相:甲醇:水=70:30UV:254nm流速:1.0mL/min.室溫ZorbaxEclipseXDB-苯基ZorbaxEclipseXDB-C8ZorbaxEclipseXDB-C18尿嘧啶苯酚4-氯-硝基苯甲苯萘UracilPhenol4-Cl-nitrobenzeneTolueneNaphthalene改變鍵合相，可增加柱效（提高靈敏度）第六十二頁，共六十七頁。生物制(Zhi)藥液相色譜柱:ZorbaxExtend-C18色譜柱尺寸:2.1x150mm,5um部件號(hào):773700-902三氟乙酸和氫氧化銨用于肽類RP-HPLC\ESI-MS分離的選擇性比較SelectivityComparisonofTFAandNH4OHforPeptideRP-HPLC\ESI-MSAnalysis流速: 0.25mL/min. 溫度: 25℃ 梯度: 5-60%Bin20min. LC/MS: 正離子,ESI-Vf70V,Vcap4.5kV, N2-35psi,12L/min.,300℃ 樣品: 4μL(各50ng) 三氟乙酸條件:A-0.1%三氟乙酸水溶液B-0.085%三氟乙酸80%的乙腈溶液NH4OH條件:A-20mMNH4OH水溶液B-20mMNH4OH80%的乙腈溶液