ELISA技術方法原理

酶聯免疫吸附法

（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）

ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第1頁!ELISA的發(fā)展50年代的免疫熒光（IFA）和60年代的放射性免疫（RIA）分析技術之后，70年代初又建立了用酶來標記抗原或抗體的分析技術1971年此項技術由瑞典學者Engvall和Perlmann，荷蘭學者VanWeeman和Schuurs分別報道，將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，稱為酶聯免疫吸附測定法（ELISA）ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第2頁!ELISA的應用ELISA法在生物醫(yī)學各領域的應用范圍概括為四個方面免疫酶染色各種細胞內成份的定位。研究抗酶抗體的合成。顯現微量的免疫沉淀反應。定量檢測體液中抗原或抗體成份。

ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第3頁!ELISA基本

原理使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第4頁!用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：

雙抗體夾心法測抗原（常用）夾心法雙抗原夾心法測抗體間接法測抗體（常用）競爭法測抗原競爭法競爭法測抗體捕獲包被法測抗體親和素-生物素ELISA法ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第5頁!ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第6頁!雙抗原夾心法測抗體反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定。乙肝標志物中HBsAb的檢測常采用本法。關鍵在于根據抗原結構的不同制備酶標抗原。ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第7頁!間接法測抗體☆

間接法是檢測抗體最常用的方法?！钤恚豪妹笜擞浀目贵w檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。

ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第8頁!間接法的特點本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗體檢測相應抗體。間接法成功的關鍵在于抗原的純度。特別應注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應的雜質。若抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。

ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第9頁!操作步驟如下：

（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應，孵育洗滌。（3）加底物顯色：參考管中由于結合的酶標抗原最多，故顏色最深。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第10頁!競爭法測抗體當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺于陰性反應。

ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第11頁!操作步驟如下：

（1）將抗IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗IgM，洗滌。（2）加入稀釋的待測標本：孵育后樣品中的IgM抗體被固相抗體捕獲，洗滌。（3）加入特異性抗原試劑：其僅與固相上的特異性IgM結合，洗滌。（4）加入針對抗原的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合，洗滌。（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示標本中存在特異性IgM抗體，是為陽性反應。ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第12頁!親和素-生物素-ELISA法親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。生物素（biotin）又稱維生素H，存在于蛋黃中?？膳c蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，形成一種極為穩(wěn)定的復合體。把親和素和生物素與ELISA偶聯起來，就可大大提高ELISA的敏感度。

ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第13頁!適用于優(yōu)點注意雙抗體夾心法測抗原是檢測抗原最常用的方法，適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原特異性高不能檢測小分子抗原及半抗原雙抗原夾心法測抗體乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。間接法測抗體是檢測抗體最常用的方法,本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體

1.關鍵抗原的純度2.另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體

競爭法測抗原小分子抗原如激素和藥物等ELISA測定多用此法?？?，只有一次保溫洗滌過程需要較多的酶標記抗原ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第14頁!在ELISA方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑”（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為“結合物”（conjugate）；（3）酶反應的底物。ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第15頁!包被特異性抗體加入待測樣品加酶標特異性抗體底物顯色洗滌洗滌孵育洗滌孵育雙抗體夾心法測抗原ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第16頁!待測抗原須有兩個可以與抗體結合的部位，其一端與包被于固相載體上的抗體結合，另一端與酶標記的特異性抗體結合。此法適用于檢驗各種二價或二價以上的大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子單價抗原的測定。ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第17頁!ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第18頁!☆操作步驟：（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原，洗滌。（2）加稀釋的受檢樣本，其中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物，孵育洗滌。（3）加酶標抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶，孵育洗滌。（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第19頁!競爭法測抗原ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第20頁!◆如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合?！羧缡軝z標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地占去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。◆參考管中只加酶標抗原，孵育后，酶標抗原與固相抗體的結合最充分。ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第21頁!捕獲包被法測抗體樣品中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法。先將所有樣品IgM（包括特異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第22頁!ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第23頁!ELISA技術方法原理共25頁，您現在瀏覽的是第24頁!方法適用于