基因工程第一章核酸的制備

（優(yōu)選）基因(Yin)工程第一章核酸的制備第一頁，共七十三頁。第一節(jié)天(Tian)然DNA的制備（PreparationofDNA）一、DNA的組成與結(jié)構(gòu)（CompositionandStructureofDNA）:Aphosphategrouplinkedbyaphosphodiesterbondtoapentose(afive-carbonsugarmolecule)thatinturnislinkedtoanitrogen-andcarbon-containingringstructurecommonlyreferredtoasa“base”.BasePentosePhosphateGroupNucleotide第二頁，共七十三頁。主要堿基的化(Hua)學(xué)結(jié)構(gòu)：第三頁，共七十三頁。結(jié)(Jie)構(gòu)：第四頁，共七十三頁。DNA第五頁，共七十三頁。DNA第六頁，共七十三頁。解鏈溫(Wen)度（Tm，meltingpoint）第七頁，共七十三頁。DNA分(Fen)子雜交(HybridizationofDNAstrandsfromdifferentsources)第八頁，共七十三頁。環(huán)(Huan)狀DNA（CircularDNA）超螺旋DNA（supercoiledDNA，SC-DNA）；共價閉合環(huán)狀DNA（CovalentlyclosedcircularDNA，cccDNA）；開環(huán)DNA（opencircleDNA，oc-DNA）；線形DNA（linearDNA，L-DNA）第九頁，共七十三頁。二、天然(Ran)DNA的提?。≒urificationofDNA）(一)生物材料的準備（PreparationofMaterial）：1.DNA的保存：1.1.70%的乙醇（Ethanol）溶液（Tris-Cl10mmol/LpH8.0，EDTA1mmol/L）1.3.低溫第十頁，共七十三頁。2.大腸桿菌（E.coli）常見抗生素（Antibiotics）的使用：2.1氨芐青霉素（ampicillin，Ap）：抑制細菌細胞壁肽聚糖的合成，50～150μg/mL（水溶液）；2.2鏈霉素（streptomycin，Sm）：與細菌核糖體30S亞單位結(jié)合，抑制細菌蛋白質(zhì)(酶)的合成,使細菌不能正常生長或者代謝而死亡，25～50μg/mL（水溶液）；2.3四環(huán)素（tetracycline，Tc）：與細菌核蛋白體的30S亞單位結(jié)合，干擾核糖體上密碼子(Zi)與反密碼子(Zi)的相互作用，從而阻止氨?；鵷RNA同核蛋白體結(jié)合，5mg/mL（乙醇溶液）；2.4氯霉素（chloramphenicol，Cm）：與細菌核蛋白體50S亞基結(jié)合，抑制肽?；D(zhuǎn)移酶，從而抑制蛋白質(zhì)合成，20μg/mL（乙醇溶液）；2.5卡那霉素（knamycin，Km）：與細菌核蛋白體蛋白基結(jié)合，并與較小的RNA亞基編譯區(qū)的特定堿基結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)合成，25～50μg/mL（水溶液）；第十一頁，共七十三頁。(二)裂解細胞（Celllysis）：1.化學(xué)方法：1.1CTAB裂解法：CTAB（cetyltriethyammoniumbromide，十六烷基三(San)甲基溴化銨），陽離子去污劑，與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液（＞0.7mol/LNaCl）中穩(wěn)定，在低鹽溶液（≤0.3mol/LNaCl）中沉淀。1.2SDS裂解法：SDS（sodiumdodecylsulfate，十二烷基磺酸鈉），陰離子去垢劑，蛋白質(zhì)變性劑，有效沉淀多糖，與K離子形成絮狀沉淀，廣泛用于質(zhì)粒（plasmid）DNA的提取，蛋白質(zhì)的分離純化。第十二頁，共七十三頁。2.酶裂解方法：2.2蛋白酶K（ProteinaseK）裂解法：用于水解蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合緊密的(De)組蛋白（Histone），廣泛用于動物組織基因組DNA的提取，通常與SDS，Tris-Cl及EDTA共同裂解細胞。2.3溶菌酶（lysozyme）裂解法：通常用于細菌裂解，提取質(zhì)粒DNA，其原理是破壞細菌細胞壁的肽聚糖支架，通過低滲透壓使細胞脹裂，引起細胞裂解。作用條件溫和，pH6.0～7.0，室溫25℃。第十三頁，共七十三頁。（三）DNA的分(Fen)離和抽提1.酚-氯仿抽提法：苯酚（phenol）-氯仿（chloroform）-異戊醇（isoamylalcohol）比例：25:24:1，苯酚：蛋白質(zhì)變性劑；氯仿：蛋白質(zhì)變性劑；并使變性的蛋白質(zhì)從水相層分離；異戊醇：防止產(chǎn)生泡沫。第十四頁，共七十三頁。2.氯化銫密度梯度離心法(CsCldensitygradientcentrifugation)；3.固(Gu)相萃取法(solidphaseextraction,SPE)；第十五頁，共七十三頁。離心技術(shù)在基因工程(Cheng)中的應(yīng)用（ApplicationofCentrifugationtechniques）第十六頁，共七十三頁。（四）DNA的純化（purification）和濃(Nong)縮（condense）1.DNA的純化：1.1Rnase處理，去除RNA；1.2離子交換層析法；1.3氯化銫密度梯度離心法；1.4瓊脂糖電泳洗脫法；第十七頁，共七十三頁。瓊(Qiong)脂糖電泳（Agarosegelelectrophoresis）1.安放好制膠模具（梳子和膠槽）第十八頁，共七十三頁。2.瓊脂糖(Tang)凝膠澆灌并冷凝第十九頁，共七十三頁。3.移(Yi)走梳子，暴露出上樣孔第二十頁，共七十三頁。4.瓊脂(Zhi)糖膠放置在電泳緩沖液中第二十一頁，共七十三頁。5.上樣，通(Tong)電流，直至DNA遷移到適當位置第二十二頁，共七十三頁。6.在紫外光（UV）下(Xia)觀察DNA電泳情況第二十三頁，共七十三頁。DNA電泳完畢后的瓊脂糖(Tang)凝膠第二十四頁，共七十三頁。在紫外光（UV）下(Xia)觀察DNA電泳情況第二十五頁，共七十三頁。不同凝膠的DNA電泳(Yong)情況瓊脂糖凝膠（agarose）聚丙烯酰胺凝膠凝膠（PAGE）第二十六頁，共七十三頁。電泳儀（電源(Yuan)和電泳槽）第二十七頁，共七十三頁。離子(Zi)交換柱層析純化DNA第二十八頁，共七十三頁。2.DNA的濃縮：2.1乙(Yi)醇（Ethanol）沉淀法；2.2正丁醇（butylalcohol）抽提法；2.3聚乙二醇（PEG6000）濃縮法；第二十九頁，共七十三頁。第(Di)三節(jié)人工合成核酸片段二、核酸的酶法合成PCR反應(yīng)（PolymeraseChainReaction,

聚合酶鏈式反應(yīng)）：模仿細胞內(nèi)發(fā)生的DNA復(fù)制過程，在體外有酶催化合成特異性DNA片段。第三十頁，共七十三頁。PCR技(Ji)術(shù)簡史1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……第三十一頁，共七十三頁。PCR技(Ji)術(shù)簡史1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎第三十二頁，共七十三頁。1.PCR的(De)基本原理(MechanismofPCR)類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。其原理是通過高溫變性模板、引物與模板退火、引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以幾何級數(shù)倍增。第三十三頁，共七十三頁。5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555第三十四頁，共七十三頁。Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。第三十五頁，共七十三頁。（3）PCR的(De)基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第三十六頁，共七十三頁。PCR反(Fan)應(yīng)標準的PCR反應(yīng)條件：

10X緩沖液（Buffer）10μL4種dNTP混合物各200umol/L引物（Primer）各10～100pmol模板DNA（Template）0.1～2μgTaqDNA聚合酶0.5～

2.5UMg2+

1.5mmol/L第三十七頁，共七十三頁。PCR反(Fan)應(yīng)第三十八頁，共七十三頁。70-75℃90-94℃37-60℃PCR循(Xun)環(huán)第三十九頁，共七十三頁。1234522557294時間（min）溫度（℃）PCR反(Fan)應(yīng)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍37-60℃90-95℃70-75

℃第四十頁，共七十三頁。PCR擴(Kuo)增No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 220=1,048,57630 230=1.07X1071cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon第四十一頁，共七十三頁。PCR反應(yīng)(Ying)特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個RFU（空斑形成單位）

細菌檢測的最小檢出率為3個細菌簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時完成擴增擴增產(chǎn)物一般用電泳分析對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNA第四十二頁，共七十三頁。（1）TaqDNA聚合(He)酶（2）

PwoDNA聚合酶（3）TthDNA聚合酶（4）C.therm聚合酶4.2.1耐熱性DNA聚合酶第四十三頁，共七十三頁。（1）TaqDNA聚合酶1986年從一種75℃熱泉中的細菌(Thermusaquaricus)中分離純化出來的。95kDa，單分子酶，75℃活性最強。具有5’-3’合成活性和5’-3’外切(Qie)活性,無3’-5’外切活性。95℃時半衰期為40分鐘。啟動PCR反應(yīng)的能力很強，聚合速度快，在72℃的聚合速度為每秒30-100堿基。由于沒有3'-5'外切活性，在擴增過程中有8.9-11x10-5

的錯配率。第四十四頁，共七十三頁。（2）PwoDNA聚合酶來自古細菌Pyrococcuswoesei，由德國寶靈曼公司開發(fā)（BM），

90kDa，100℃的半衰期大于2小時(Shi)，具有3’-5’外切活性，出錯率低，使用較多的的且具有高保真度的PCR酶。第四十五頁，共七十三頁。（3）TthDNA聚合酶

來自嗜熱熱細菌（Thermusthermophilus），由Promega公司(Si)開發(fā)成商品。94kDa，95℃的半衰期為20分鐘。在Mg2+存在條件下以DNA為模板合成DNA，而在Mn2+存在下可以RNA為模板合成cDNA。因此可在高溫下做RT-PCR（反轉(zhuǎn)錄PCR）反應(yīng)，避免RNA反轉(zhuǎn)錄過程中形成的二級結(jié)構(gòu)。

第四十六頁，共七十三頁。（4）C.therm聚合酶來自Carboxydothermushudrogenoformans，以Mg2+為(Wei)輔助因子的逆轉(zhuǎn)錄酶，最適溫度適60-70℃，同時也具有3’-5’外切酶校對活性，用于RT-PCR

反應(yīng)。第四十七頁，共七十三頁。4.2.2靶(Ba)DNA/模板單、雙鏈DNA均可。純度：不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。使用濃度：一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。其兩端20-30bp序列用以一對引物的設(shè)計。第四十八頁，共七十三頁。①引物長度18～30bp，過短則降低特異性，過長則會引起引物間的退火而影響有效擴增，同時也增加(Jia)引物合成的成本。②避免引物內(nèi)部或引物之間存在互補序列（3個堿基），避免序列內(nèi)有較長的回文結(jié)構(gòu)，減少引物二聚體的形成以及引物內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的形成。③G/C和A/T堿基均勻分布，G+C含量在40～60%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。4.2.3PCR引物第四十九頁，共七十三頁。④引物3’末(Mo)端堿基應(yīng)與模板DNA嚴格配對，并且3’末端為G、C時引發(fā)效率較高。⑤引物5’末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無關(guān)的序列(如限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列、ATG起始密碼子或啟動子序列等)，便于克隆和表達。⑥引物用核酸序列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性，引物的堿基順序不能與非擴增區(qū)有同源性。第五十頁，共七十三頁。4.2.4PCR原材(Cai)料dNTP脫氧核苷三磷酸四種dNTP濃度應(yīng)相等要求：濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量第五十一頁，共七十三頁。4.2.5PCR緩(Huan)沖液成分：10mmol/LTris-HCl(pH8.8室溫下)，50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2。Mg2+：是DNA聚合酶的激活劑，0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性第五十二頁，共七十三頁。4.2.6PCR循環(huán)的(De)溫度和時間溫度:90-95℃模板變性，復(fù)性（37-60℃），溫度由引物長度和GC含量決定；70-75℃引物在模板上延伸反應(yīng)時間變性30s，如果模板G+C含量高，變性時間可適當延長。復(fù)性30s。延伸1kb1min充足，由擴增產(chǎn)物的大小決定。循環(huán)次數(shù)

25～35

次。第五十三頁，共七十三頁。25μLPCR反應(yīng)體系：模板DNA1μL（10－100ng）引物11μL（10μmol/L）引物21μL（10μmol/L）dNTP（10mmol/L）1μL（20mmol/L）10×PCR反應(yīng)的緩沖液2.5μLTaq酶0.5μL（1U/μl）ddH2O補(Bu)至25μL4.3PCR擴增DNA片段的方法常規(guī)程序第五十四頁，共七十三頁。PCR反應(yīng)的程序：溫(Wen)度（℃）時間（分鐘）(1)953-5(2)950.5(3)600.5(4)721(5)721025－30個循環(huán)第五十五頁，共七十三頁。PCR反應(yīng)的操作注意事項：1）加樣操作必須在冰上進行；2）加樣的順序：（1）從大到??；（2）先加藥品再酶：PCR反應(yīng)結(jié)果異常及解(Jie)決辦法：1）無帶；2）雜帶多；3）DNA降解。第五十六頁，共七十三頁。PCR中(Zhong)應(yīng)注意的事項

防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作設(shè)立對照：陽性對照：陽性模板陰性對照：陰性模板試劑對照：除模板外的所有組分第五十七頁，共七十三頁。4.4PCR技術(shù)應(yīng)(Ying)用

4.4.1PCR技術(shù)的主要類型反向PCR錨定PCR不對稱PCR原位PCRRT-PCR重組PCR差異顯示PCR免疫PCR實時定量PCR多重PCR第五十八頁，共七十三頁。1)反(Fan)向PCR(reversePCR)方法：對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。用途：探索鄰接已知DNA片段的未知序列；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列第五十九頁，共七十三頁。已知序列未知序列未知序列連(Lian)接酶第六十頁，共七十三頁。2）不對稱PCR(asymmetricPCR)

目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物，最佳比例一般是0.01∶0.5μM。

用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能(Neng)的研究第六十一頁，共七十三