多酚化合物對多肽淀粉樣纖維化的抑制作用,有機(jī)化學(xué)論文

多酚化合物對多肽淀粉樣纖維化的抑制作用,有機(jī)化學(xué)論文很多蛋白質(zhì)或多肽在一定條件下能夠構(gòu)成淀粉樣纖維，至少20多種人類疾病如阿爾茨海默病、帕金森氏病、家族性淀粉樣神經(jīng)病變以及Ⅱ型糖尿病等與此類淀粉樣纖維沉積有關(guān)[1~4].胰島素是一種由51個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，極易構(gòu)成淀粉樣纖維，通常將其作為研究多肽淀粉樣纖維化、挑選抗纖維化藥物以及纖維細(xì)胞毒性分子機(jī)制的模型分子[5].固然當(dāng)前尚無證據(jù)表示清楚任何疾病與胰島素纖維化有關(guān)，但在臨床應(yīng)用中，胰島素在生產(chǎn)、儲(chǔ)存經(jīng)過中以及在注射部位構(gòu)成的纖維可能對病人產(chǎn)生免疫原性[6].為抑制蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化，溶解或者毀壞淀粉樣纖維構(gòu)造被以為是治療相關(guān)疾病的有效途徑。多酚化合物，十分是一些天然多酚類物質(zhì)能夠抑制蛋白質(zhì)的纖維化[7~9],并能夠毀壞成熟的纖維構(gòu)造，將其轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形聚集體，降低纖維的細(xì)胞毒性作用[10].這些多酚的抗多肽纖維化作用被以為既與其多環(huán)和多羥基構(gòu)造有關(guān)，可以能與其抗氧化作用或促氧化作用有關(guān)[11,12],但詳細(xì)作用機(jī)制尚無定論。本文采用牛胰島素作為模型分子，探尋求索了幾種構(gòu)造相近的簡單多酚化合物對多肽淀粉樣纖維化的抑制作用，以期從這些化合物的構(gòu)效關(guān)系來揭示多酚類化合物抗多肽淀粉樣纖維化的分子機(jī)制。1試驗(yàn)部分1.1試劑與儀器牛胰島素〔分子量5733〕、硫黃素〔ThT〕、氯化硝基四氮唑藍(lán)〔NitroblueNBT〕、酚化合物及對苯醌購自Sigma-Aldrich公司；電泳相關(guān)試劑購自Bio-Rad公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。LS-55型熒光分光光度計(jì)〔美國Perkin-Elmer公司〕;JEM-1400型透射電子顯微鏡〔日本JEOL公司〕.1.2實(shí)驗(yàn)經(jīng)過1.2.1胰島素淀粉樣纖維的制備用20mmol/L鹽酸溶液〔pH=1.7〕配制100mol/L牛胰島素水溶液，參加不同濃度的酚化合物，于50℃水浴中孵育5d,按一定的時(shí)間間隔取樣并在4℃保存?zhèn)溆谩?.2.2ThT熒光檢測用10mmol/L磷酸鹽緩沖液〔pH=7.0〕配制1mmol/LThT溶液，于4℃避光保存?zhèn)溆?。?0L孵育的胰島素樣品，加至10mmol/LTris-HCl溶液〔pH=8.0〕中，再參加30LThT溶液使其終濃度為10mol/L,振蕩10s左右，用熒光分光光度計(jì)記錄熒光強(qiáng)度〔激發(fā)波長為440nm,發(fā)射波長為484nm〕.1.2.3透射電子顯微鏡〔TEM〕觀察聚集體形態(tài)將制備的胰島素纖維或者聚集體用二次蒸餾水稀釋5倍，取15L滴于鍍膜銅網(wǎng)上，靜置10min后用濾紙沿邊緣吸干，滴加15L醋酸鈾〔質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%〕染色10min.用透射電子顯微鏡觀察纖維形態(tài)并拍照〔電壓80kV〕.1.2.4SDS-凝膠電泳及電轉(zhuǎn)分析SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳〔SDS〕采用分離膠〔質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%〕在Tricine緩沖體系〔pH=8.2〕中進(jìn)行，胰島素加樣量為10g,用考馬斯亮藍(lán)染色。采用GEHealthcare電轉(zhuǎn)盒將凝膠上的條帶轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯〔PVDF〕膜上，在堿性〔pH=10〕條件下由NBT染色。2結(jié)果與討論實(shí)驗(yàn)條件下，胰島素可在約4~5d構(gòu)成成熟的淀粉樣纖維，纖維的生長經(jīng)過采用ThT熒光法監(jiān)測。ThT是一種能夠與淀粉樣纖維的片層構(gòu)造特異性結(jié)合的熒光探針，當(dāng)與淀粉樣纖維結(jié)合時(shí)，其在440nm波長光激發(fā)下產(chǎn)生484nm的特征熒光發(fā)射峰。與大多數(shù)蛋白質(zhì)纖維化經(jīng)過類似，胰島素的纖維生長經(jīng)過也具有成核-聚合的動(dòng)力學(xué)特征[13],即纖維化主要包括成核、生長和成熟3個(gè)階段，ThT熒光曲線表現(xiàn)為S型特征[見圖1〔A〕].由圖1〔A〕可見，各種酚化合物對胰島素的淀粉樣纖維化作用不同。200mol/L的苯酚和間苯二酚對胰島素纖維化有一定的促進(jìn)作用，相應(yīng)的ThT熒光在1.5d后開場加強(qiáng)，表示清楚其具有較短的成核期；與之相比，一樣濃度的鄰苯二酚和對苯二酚則對胰島素纖維化表現(xiàn)出明顯的抑制作用，相應(yīng)的ThT熒光在孵育3d后開場略有上升，第5d的熒光強(qiáng)度僅為胰島素對照樣品的27%和19%.由于鄰苯二酚和對苯二酚的纖維化抑制作用可能與其氧化產(chǎn)物醌中間體相關(guān)，故采用對苯醌同時(shí)進(jìn)行對照分析。如此圖1〔A〕所示，在200mol/L對苯醌存在下，胰島素纖維化幾乎被完全抑制，整個(gè)孵育經(jīng)過中ThT熒光強(qiáng)度無明顯增加。鄰苯二酚、對苯二酚和對苯醌對胰島素淀粉樣纖維化的抑制作用與濃度呈正相關(guān)。對苯二酚的濃度效應(yīng)如此圖1〔B〕所示，可見較低濃度的對苯二酚可延緩胰島素的纖維化，包括增加延遲期時(shí)間和降低纖維的生長速度。鄰苯二酚和對苯醌的濃度效應(yīng)與此類似，但對苯醌的抑制作用比2種苯酚強(qiáng)，100mol/L對苯醌即可完全抑制胰島素纖維的生長[圖1〔C〕].酚類化合物對胰島素淀粉樣纖維化的作用可進(jìn)一步由TEM表征結(jié)果〔圖2〕證實(shí)。作為對照的成熟胰島素纖維的直徑為5~35nm,長度分布為600~3000nm[圖2〔A〕],能與剛果紅結(jié)合并在偏振光下顯現(xiàn)出特征的黃綠色，具有淀粉樣聚集體的特性。當(dāng)胰島素與200mol/L的苯酚[圖2〔B〕]或間二苯酚[圖2〔C〕]共孵育5d后，纖維密度比對照樣品有所增加，與ThT熒光結(jié)果一致；而一樣濃度的鄰苯二酚[圖2〔D〕]和對苯二酚[圖2〔E〕]則明顯抑制纖維的生成，只能觀察到少量的細(xì)短纖維；100mol/L對苯醌即可完全抑制纖維的生成，故僅能觀察到一些小的無定形聚集體[圖2〔F〕].研究表示清楚，天然多酚化合物的抗多肽纖維化作用與其氧化復(fù)原性質(zhì)有關(guān)[9,10],Hirohata等[14]也報(bào)道天然多酚的氧化產(chǎn)物通常具有更強(qiáng)的抑制纖維化作用。在本文選用的4種酚化合物中，鄰苯二酚和對苯二酚可抑制胰島素纖維化，而苯酚和間苯二酚則無此作用，這可能與前2種化合物具有更低的氧化復(fù)原電位，并且在氧化經(jīng)過中易于構(gòu)成醌類產(chǎn)物有關(guān)。多酚經(jīng)氧化后的醌類產(chǎn)物具有較高的反響活性，可修飾多肽鏈中的一些殘基，如氨基、巰基和一些雜環(huán)殘基等[15,16].電轉(zhuǎn)-NBT染色實(shí)驗(yàn)是一種特異性檢測醌修飾多肽的方式方法[17].凝膠電泳分離的多肽經(jīng)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在堿性條件下，NBT與醌修飾多肽反響轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色不溶物。該反響具有較高的特異性和靈敏度，常用于生物樣品中醌修飾多肽的分析鑒定。圖3示出了在酚化合物和苯醌存在下，孵育5d的胰島素聚集體的SDS電泳[圖3〔A〕]和相應(yīng)的電轉(zhuǎn)-NBT檢測結(jié)果[圖3〔B〕].圖3〔A〕泳道1和2分別是未經(jīng)孵育的胰島素單體和孵育5d的胰島素成熟纖維，可見在SDS的作用下，纖維被解聚為胰島素單體，不同的是，在泳道2胰島素單體上方可觀察到少量呈拖尾狀的聚集體；苯酚〔泳道3〕和間苯二酚〔泳道5〕可促進(jìn)這種SDS不溶聚集體的構(gòu)成。該多聚體的構(gòu)成能否與淀粉樣纖維化有關(guān)，當(dāng)前尚不清楚。與之相比，參加鄰苯二酚〔泳道4〕、對苯二酚〔泳道6〕和苯醌〔泳道7〕的樣品除了少量二聚體外，在考馬斯亮藍(lán)染色條件下觀察不到拖尾狀的多聚體。NBT檢測結(jié)果表示清楚，與鄰苯二酚、對苯二酚和苯醌共孵育5d的胰島素可與NBT反響生成紫紅色產(chǎn)物，表示清楚胰島素分子被醌所修飾；而與苯酚和間苯二酚共孵育的胰島素則無此特征的紫紅色。結(jié)合ThT熒光和TEM結(jié)果能夠推斷，鄰苯二酚和對苯二酚對胰島素纖維化的抑制作用與其轉(zhuǎn)變?yōu)轷虚g體，進(jìn)而與多肽鏈結(jié)合有關(guān)。在SDS電泳和充分透析的條件下，醌仍然能夠與胰島素分子嚴(yán)密結(jié)合，這種結(jié)合能否與共價(jià)作用有關(guān)，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。為了進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)論，在制備胰島素聚集體之前，在樣品中充分通入氮?dú)?，以除去溶液中的氧，然后在密閉條件下，根據(jù)前述條件孵育5d.ThT熒光結(jié)果[圖4〔A〕]顯示，在無氧條件下，鄰苯二酚和對苯二酚對胰島素纖維化的抑制作用顯著降低，表現(xiàn)為最終孵育產(chǎn)物具有較強(qiáng)的ThT熒光；而苯酚和間苯二酚與有氧條件下一樣，對胰島素纖維化無抑制作用。TEM表征結(jié)果表示清楚，在無氧條件下，與200mol/L鄰苯二酚[圖4〔B〕]和對苯二酚[圖4〔C〕]共孵育5d的胰島素具有通常情況下的纖維形態(tài)和密度，即鄰苯二酚和對苯二酚在這里條件下無抑制胰島素纖維化的作用，這與ThT熒光結(jié)果相符。另外，對上述孵育5d的樣品進(jìn)行電轉(zhuǎn)-NBT檢測發(fā)現(xiàn)，在無氧條件下參加所有酚化合物的樣品均不能被NBT染色〔數(shù)據(jù)未給出〕,即未生成醌修飾胰島素。上述結(jié)果充分講明，酚化合物經(jīng)氧化構(gòu)成醌中間體并對多肽鏈修飾是其抗多肽纖維化的主要途徑。表沒食子兒茶素沒食子酸酯〔Epigallocatechingallate,EGCG〕為綠茶的主要成分，是最有希望成為多肽纖維化相關(guān)疾病治療藥物的天然多酚化合物。在抑制-淀粉樣肽及突觸核蛋白等纖維化經(jīng)過的研究中，可觀察到EGCG構(gòu)成醌中間體并對多肽修飾后的產(chǎn)物[18~20].但這種修飾在纖維化抑制經(jīng)過中能否具有重要作用，仍然難以確定。當(dāng)前，對天然多酚的抗多肽纖維化的分子機(jī)制多采用完好的多酚分子與多肽鏈的作用模型[18].事實(shí)上，無論是在體實(shí)驗(yàn)還是體外實(shí)驗(yàn)，多酚化合物在介質(zhì)中的穩(wěn)定性特別有限，充分考慮其氧化產(chǎn)物醌中間體的作用是特別必要的。3結(jié)論研究了幾種具有單環(huán)構(gòu)造的簡單酚化合物對胰島素纖維化