傳統(tǒng)與改良影印培養(yǎng)法在生物實驗中的應(yīng)用綜述,分子生物學論文

傳統(tǒng)與改良影印培養(yǎng)法在生物實驗中的應(yīng)用綜述,分子生物學論文自1992年發(fā)明以來，作為一種重要的挑選方式方法被用在微生物及遺傳學中的各個領(lǐng)域，這種挑選方式方法對微生物突變菌株，基因突變體等的挑選起到了很重要的作用，然而傳統(tǒng)影印培養(yǎng)法在使用經(jīng)過中表現(xiàn)出使用的絲絨材料價格較貴、需反復(fù)滅菌和使用不便等缺點，為了使該方式方法操作簡便快速可靠，不斷的出現(xiàn)改進的影印培養(yǎng)法。本文從傳統(tǒng)影印培養(yǎng)法到改進影印培養(yǎng)法在生物實驗中的應(yīng)用予以綜述。1傳統(tǒng)影印培養(yǎng)法1952年Lederberg發(fā)明了影印培養(yǎng)法，該方式方法是將原始菌落影印在一系列選擇性平板的一樣位置上，用這種方式方法能夠挑選得到一樣遺傳型的菌落，其經(jīng)過是：把長有菌落的原始培養(yǎng)皿倒置于包有絨布〔已滅菌〕的木質(zhì)圓柱〔直徑略小于培養(yǎng)皿直徑〕上，使平板上的菌落影印在絨布上，然后把這一印章上的菌落逐一接種到不同的選擇性培養(yǎng)基平板上，待這些平板培養(yǎng)后，對各平板一樣位置上的菌落作比照，就可挑選出所需的突變型菌株。圖1就是利用影印培養(yǎng)法證明E.coliK12自發(fā)地產(chǎn)生抗鏈霉素突變株的實驗示意圖。其方式方法是：首先把大量對鏈霉素敏感的E.coliK12細胞涂布在不含鏈霉素的平板上，待其長出很多小菌落后，用影印法接種到不含鏈霉素的培養(yǎng)基平板上，然后再影印到含有鏈霉素的選擇性培養(yǎng)基平板上。影印的作用主要是保證三個平板上培養(yǎng)的菌落具有親緣性和菌落在平板上生長的位置保持嚴格的對應(yīng)性。經(jīng)培養(yǎng)后，在平板上有個別抗鏈霉素的菌落生長，對培養(yǎng)皿和進行比擬，就能在平板的相應(yīng)位置找出平板上生長的那幾個抗性菌落的孿生兄弟。然后把平板中對應(yīng)位置上的菌落挑至不含鏈霉素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，然后再涂布在平板上，然后重復(fù)上述步驟。反復(fù)重復(fù)上述同一經(jīng)過后，就只要在培養(yǎng)皿和中涂上越來越少的原菌液后，便可在平板上長出越來越多的抗性菌落，這樣便可得到完全純的抗性菌株群體。由此可知，在這個經(jīng)過中，原始的鏈霉素敏感菌株只通過移種和選擇序列，也就是講在根本未接觸過任何一點鏈霉素的情況下，便能夠挑選到抗鏈霉素的突變株。影印培養(yǎng)法實驗最初的設(shè)計是為證明微生物的抗藥性突變是自發(fā)的，與相應(yīng)的環(huán)境因素無關(guān)，當前已被廣泛的應(yīng)用在營養(yǎng)缺陷型的挑選及抗藥性菌株的挑選等研究工作中。但是傳統(tǒng)影印培養(yǎng)法在實驗經(jīng)過中有一定的缺陷，主要表如今下面四個方面：①不合適菌落密度大的平板。在影印經(jīng)過中，原始菌落轉(zhuǎn)移至絲絨上時需要摁壓，菌落被壓平，菌落面積擴大，進而在子板上構(gòu)成接近扁平樣的菌落。細菌密度高或者分布不均勻，就會造成菌落間的污染；②生長節(jié)拍不同，體積大小不同的菌落，影印效果不同。會出現(xiàn)污染或者挑選不到所需要的菌落等缺點；③平板上的邊緣和影印效果不同。邊緣部分比部分容易受力，所以邊緣部分比部分易于影印，因而為了照顧平板菌落的影印效果，容易造成邊緣菌落受壓過大，菌落變形的情況，尤其在第二次影印時表現(xiàn)明顯；④影印要求高質(zhì)量的絲絨。價格比擬昂貴，其次每次需要將絨布固定于圓柱面上，所以操作步驟復(fù)雜也增加了污染的可能性。2改進的平板影印工具徐民俊等在對生產(chǎn)用釀酒酵母進行遺傳改進的實驗中，對傳統(tǒng)影印平板工具進行了改進，改進后的影印平板工具是將長度一樣的大量竹簽捆扎成與平皿內(nèi)蓋直徑相近的捆，整平接觸菌落的面，然后將反面用膠粘于平皿內(nèi)蓋，60℃烘干，滅菌待用〔圖2〕。影印時將該工具與細菌接觸的面朝上平放在超凈臺上，打開上蓋即可,假如需要反復(fù)使用該工具，可在第一次影印后，將影印的一面在75%乙醇中浸泡2min，輕輕甩去太多的無水乙醇，在超凈臺上吹干5min即可重復(fù)使用。可以以制備多套，統(tǒng)一滅菌。徐民俊等使用改進的影印平板工具進行3輪影印傳代后，順利地挑選出大規(guī)模的轉(zhuǎn)化子。該改進的平板影印工具與傳統(tǒng)平板影印方式方法有很大的區(qū)別，使影印操作更為簡便，減少了污染的可能性,并且影印效果清楚明晰，能夠到達與母板一樣的生長狀況。改進的影印平板工具具有三方面的優(yōu)點：①材料經(jīng)濟，工藝簡單，操作簡便，無需其他介質(zhì)，降低了污染；②邊緣菌落和菌落影印效果幾乎一樣，大菌落和小菌落影印效果也一樣；③影印效果良好。影印時不會將菌落壓平，無論影印幾版，皆不會使菌落擴散，因而避免了菌落間的穿插污染。該工具也存在兩方面的缺點：①直徑大于2mm的菌落，將會導(dǎo)致一個母板菌落構(gòu)成2個子板菌落。②由于材料是用竹簽制作的，滅菌屢次之后竹簽會變的脆弱，所以使用時間不長，假如要批量生產(chǎn)，材料換成鋼鐵類則可長期使用。3低熔點瓊脂糖影印培養(yǎng)法ShobhanaNatarajan等將傳統(tǒng)的影印培養(yǎng)法進行改進，用改進的低熔點瓊脂糖影印培養(yǎng)法簡單快速的轉(zhuǎn)移了哺乳動物細胞，然后用接種環(huán)挑取陽性克隆，挑選得到需要表型的細胞，這種轉(zhuǎn)移速度較快，大大地減少了培養(yǎng)和分離稀有表型所花費的時間。詳細經(jīng)過如此圖3所示，細胞培養(yǎng)在直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，長到肉眼可見1000個細胞時影印，每個平板的培養(yǎng)基是20ml3%的低熔點瓊脂糖冷卻到37℃后，和2.5ml10濃縮生長培養(yǎng)基以及2.5ml的血清混合〔終濃度為1培養(yǎng)基和10%血清〕，培養(yǎng)后用PBS洗掉平板中的血清，并在室溫下向每個平板的細胞中添加1mL的Trypsin-EDTA，在顯微鏡下觀察平板，待每個克隆中均有一些細胞變圓時棄去胰蛋白酶，并用含有瓊脂糖的新鮮培養(yǎng)基〔包含添加血清的生長培養(yǎng)基〕培養(yǎng)10~15分鐘，使其在平板中繼續(xù)生長。一個無菌的V型小竹板插在瓊脂糖中作為參考標記，這個參考標記插入的位置在原始平板的底部，然后將這個平板反向影印在直徑為15cm的培養(yǎng)皿中，同時在第一個平板中參加生長培養(yǎng)基讓每個克隆〔包含大多數(shù)的細胞〕剩余的細胞繼續(xù)生長，接著將第二個直徑為10cm的平板中的瓊脂糖倒入10cm的培養(yǎng)皿中，克隆也隨著轉(zhuǎn)移，插入的參考標記隨后放在第二個平板中，用巴斯德吸管在瓊脂糖上戳眼來趕走培養(yǎng)基中的氣泡，為了使轉(zhuǎn)移的細胞粘附在培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在37℃下孵育16~24小時。此種改進方式方法應(yīng)用在細胞轉(zhuǎn)移實驗中，比擬新穎，在這種方式方法中用低熔點瓊脂糖來作為影印工具，這種工具能夠隨培養(yǎng)基一起配置，減少了外面介質(zhì)，因而減少了污染的可能性。其次，在這里方式方法中能夠利用瓊脂糖的低熔點性來控制影印，在溫度高的時候瓊脂糖溶解在培養(yǎng)基中，起到培養(yǎng)細胞的作用，溫度低時瓊脂糖凝固，作為固體介質(zhì)進行影印。再次細胞培養(yǎng)時細胞都貼壁，用胰蛋白酶消化能夠使細胞脫落，消化的程度能夠控制脫落的濃度，到合適濃度時進行影印，最合適的細胞濃度為每個培養(yǎng)皿20~50個克隆時，能夠減少克隆之間的穿插感染。4結(jié)束語自從1952年Lederberg發(fā)明了影印培養(yǎng)法以來，已經(jīng)被廣泛的用在細菌和酵母遺傳學來挑選需要的表型，在細胞轉(zhuǎn)移和挑選方面用的較少，也能夠用抗體染色的方式方法來鑒定目的基因不同表示出程度的克隆，挑選抗菌素，挑選抗菌活性強的肽，從環(huán)境中分離有益的微生物，在限制性溫度下來鑒定易感的克隆，或者根據(jù)應(yīng)用和特殊表型的需要進行其它挑選，因而在生物實驗中具有重要的指導(dǎo)意義。本文從傳統(tǒng)的影印培養(yǎng)法技術(shù)到改進的影印培養(yǎng)技術(shù)，從應(yīng)用此技術(shù)來挑選突變菌株到挑選需要表型的細胞進行討論，傳統(tǒng)影印培養(yǎng)技術(shù)的影印工具是絨布，徐民俊等改進的影印工具是扎成捆的牙簽，ShobhanaNatarajan等改進的影印工具是低熔點的瓊脂糖，并用滅菌的小竹板插入培養(yǎng)基中做標記，這幾種技術(shù)各有利弊，詳細能夠根據(jù)實驗需要來選用，可以以根據(jù)實驗自行進行改進。根據(jù)前面所述，發(fā)如今影印培養(yǎng)技術(shù)中克隆之間的污染是一個很重要的問題，解決此問題，實驗操作中注意事項是一方面，主要的方面還有克隆密度的大小，假如克隆密度太大，可能不合適用這種技術(shù)來挑選，由于影印之后克隆之間不能很好地分開，達不到挑選的作用，可以能會造成污染。影印培養(yǎng)中的參考標記確實定也很重要，假如標記不準確則會被誤選。原始平板和影印平板的直徑大小有一定的要求，要事先設(shè)計好，原始平板的直徑要比影印平板的直徑小，假如原始平板的直徑大于等于影印平板的直徑則不能進行影印。以下為參考文獻［1］LederbergJ，LederbergEM.Replicaplatingandindirectselectionofbacterialmutants［J].Bacteriol.1952，63:399~406.［2］徐禎，徐慶妍，胡志鈺，等.平板影印與AHBA合成酶基因挑選用于安莎類抗生素產(chǎn)生菌的分離［J].廈門大學學報〔自然科學版〕，2020，51〔1〕：107－111.［3］GrunsteinM，HognessDS.Colonyhybridization：amethodfortheisolationofclonedDNAsthatcontainaspecificgene［J].ProcNatlAcadSciUSA，1975，72〔10〕:3961－3965.［4］EskoJD，RaetzCR.Replicaplatingandinsituenzymaticassayofanimalcellcoloniesestablishedonfilterpaper［J］.ProcNatlAcadSciUSA，1978，75〔3〕:1190－1193.［5］鄭幼霞，趙人俊，張益菜.慶豐鏈霉菌中SQPI質(zhì)?？刂浦掠缘倪z傳證明［J］.遺傳學報，1982，9〔1〕:8-13.［6］徐民俊，田小群，周世寧.一