黃瓜雌核離體培養(yǎng)加倍技術(shù)

1/6頁材料與方法

黃瓜雌核離體培育加倍技術(shù)黃瓜未受精子房離體培育體系的建立材料滑型雌性系(長、短)與中國刺瘤類型的Fl代。方法雌花采集：取未開放的黃瓜雌花，去掉花冠和花柄。75%酒精處理子房30秒，然后用10%次氯酸鈣液滅菌15分鐘。用無菌水沖洗3次。導培育基的三角瓶內(nèi)。1963)培育基根本成分(詳見附表2)為根底，依據(jù)試驗設(shè)計做相應(yīng)調(diào)襤。培育基中的大鼉SIGMANaOH或HCI調(diào)PH至5.8，加熱溶化后分裝至三角瓶，25ml／瓶，在SANYO高壓滅菌器120℃，1.06Kg/cm2的壓力下，滅菌15min。25℃黑暗條件下培育7天，然后移至同等溫度、14hr光／l0hr黑暗條件下培育。3~4周后即可繼代。繼代培育基：1/2MS+BA0.5mg/L+30g/L再生植株的擴繁：自未受精子房產(chǎn)生的幼小胚芽，繼代至1／2MS培育基15天后，形成正常小植株(根莖葉完整)，為保護其種質(zhì)資源，提高種苗基數(shù)，使5cm左右的正常小植株，剪成2-3cm小段，每段含1或2節(jié)，插接于快繁培育基上?？旆迸嘤鵎：MS大量、微量、有機，F(xiàn)eKT/NAA(0.1/0.1mg/L)3-4個。再生植株馴化與移栽：“一步移栽法”：3-4cm深的蛭石，用除糖和瓊脂的MS根本培育基澆濕，然后封口、高壓滅菌；2片開放葉部位下，用剪刀剪下，將枝條直接扦插在廣口玻璃瓶內(nèi)的蛭石上，用薄膜封口，置于組培室架上培育：7天后松開瓶口的薄膜。再過3天去掉薄膜，再過7天左右即可將苗和瓶移至室內(nèi)5天左右視苗子大小即可移栽到溫室。該方法的優(yōu)點是，成活率根本到達l00%，而且馴化過程格外簡潔。再生植株的倍性鑒定染色體制片法R5(F1)為供體材料，通過來受精子房進展離體培育，獲得約200株再生植株，定植于玻璃日光溫室中，取5-6cm長的幼嫩卷須為試材，供倍性鑒定爭論。方法：染色體制片方法以陳瑞陽等(1981)的去壁低滲法為根本方法，針對黃瓜的具體狀況對采樣時間預處理酶解去壁等環(huán)節(jié)進展優(yōu)化最終確定染色體制片步驟如下：i 預處理取再生植株幼嫩卷須用0.1%秋水仙堿+0.002M8-羥基喹啉溶液處理2小時。ii 前低滲：將卷須轉(zhuǎn)入0.075mo1/LKCL低滲液中，在20~25℃條件下處理30min。iii 前固定：倒去KCL溶液，用甲醇-冰乙酸(3:1)于0~5℃條件下固定40min。1%混合酶液(纖維酶和果膠酶各占1%)在25℃溫箱內(nèi)處理50min。后低滲：倒去酶液，用蒸餾水沖洗2-3次，轉(zhuǎn)入蒸餾水中后低滲10-15min。后固定：再用配制甲醇-冰乙酸(3:1)固定30min以上?？菰?。Giemsa染色。鏡檢：①染色體計數(shù)：用OPTON911型顯微鏡觀看。②染色中心直徑和異染色質(zhì)數(shù)目：在OlympusIX70顯微鏡下(400X)觀看并測量染20個，求其平均值。染色中心直徑的觀測值乘以1.667調(diào)整為實際值。進展統(tǒng)計分析。葉片氣孔直徑和保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目測定法條件下，測量氣孔直徑大小。每基因型植株取l0片葉進展計數(shù)和測量并求其平均植。氣孔直徑的觀測值乘以1.667調(diào)整為實際值。進展統(tǒng)計分析。細胞按DNA熒光染色法肉細胞游離，然后參加DN特異性熒光染料DAPI二鹽酸-，6二脒基-2苯基吲哚，5μg/m1)1滴并與葉肉細胞混勻，然后在紫外光(λ=490nm)下，用Univer掃描顯微分光光樣品測量20個細胞核，計算平均值。植株形態(tài)觀看工程包括葉片外形，花的外形，花粉發(fā)育，果實形態(tài)，種子育性等。黃瓜染色體加倍爭論HM6、HM36、HM45、HM82、H-71等，雙單倍體植株H4-1進展染色體加倍試驗。生長點浸泡、扦插法選用不同基因型的單倍體植株，用0.5%、1%的秋水仙堿分別浸泡其生長點2h、4h后，扦插于含有養(yǎng)分液的蛭石中，成活后定植于溫室，鑒定其倍性變化。生長點涂抹處理和浸泡處理0.2%和0.5%秋水仙素掛瓶浸泡法對剝?nèi)∩L點后的單倍體植株進展浸泡處理，從9:00~16:00浸生長點7h。雙單倍體幼苗加倍試驗倍處理：0.2%秋水仙素；0.2%秋水仙素+1.5%DMSO；0.05%、0.1%、0.2%氟樂靈在每天8:00和18:00滴于生長點，連續(xù)處理5天。一次。株數(shù)、變異株數(shù)、加倍株數(shù)，計算成株率、變異率(變異株占處理株數(shù)的百分比)、加倍率(加倍株占處理株數(shù)的百分比)。黃瓜離體雌核發(fā)育的過程及其早期生化變化爭論材料、培育基和培育方法選用31-2d2-3mm厚的下。石蠟切片觀看0d、3d、6d、12d、24d、36d取培育的子房切片，承受連續(xù)石蠟切片法，愛氏蘇木精染色，用Olympus相差顯微鏡觀看并照相。方法步驟：后保存于70%的乙醇(4℃)中備用；采集春三、雜二、P66、4、1、3、A16黃瓜品種距開花前一天的未受粉子房，無菌條件下，將子房分割成5mm長的小圓塊，進展接種，分別培育在Mo67、W5、M99、M100培育基中，取培育不同天數(shù)的未受粉子房，分別固定于FAA液中，固定時間>2h，后保存于70%的乙醇(4℃)中備用。70%→85%→95%→100%濃度梯度的乙醇及→60min，其中二甲苯中脫水時間視透亮程度而定。1/2的60℃石蠟、二甲苯混合后，于60℃烤箱中化蠟，將材料進展浸蠟，然后進展橫、縱兩種方向包埋。切片：將包埋好蠟塊依據(jù)橫、縱兩種方向進展切片厚度為9~11μm。切片脫蠟、染色：將切片分別轉(zhuǎn)入二甲苯→1/2無水乙醇、二甲苯的混合液及100%→95%→85%→70%→50%濃度梯度的乙醇中脫蠟，其中在二甲苯、1/2無水乙醇、二甲苯的混合液中放置30min，其余濃度梯度乙醇中放置3~5min，然后轉(zhuǎn)入蒸餾水中后用愛60min50→70→85→95→100%1/2二甲苯、無水乙醇的混合液→二甲苯中，放置時間同下行時間。封片：最終用加拿大膠封片，供觀看照相。酶活性測定0d、3d、6d、取培育在M99和W5培育基上的子房外植體，先用蒸餾水洗凈，吸干外表水，再用塑料膜小袋包裝后快速置于-80℃保存?zhèn)溆?。過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)酶活性的測定：酶液的提取按《現(xiàn)代植試驗指南》(中國科學院上海植物生理爭論所，1999)的方法。POD活性承受張志良(1990)的方法測定，以1min △0D470表示1個酶活性單位。SOD活性承受《現(xiàn)代植(中國科學院上海植物生理爭論所，1999)的方法測定，以NBT的光SOD抑制50%時參加的酶量(ml)為1個酶活性單位。酶和Ca2+-ATP酶活性測定：依照李楊瑞(1987)的方法。Q酶活性測定：依照李太貴、沈波等(1997)的方法。激素含量測定-80IAA，iPA，Zr，ABA，GA3及GA4的測定按何鐘佩編(1993)方法進展?？筛⑿缘鞍资沉考癙OD、EST同工酶可溶性蛋白含量的提取和測定2.4.5.2中POD同工酶的材料預備與提取一樣，可溶性蛋白含量測定方法參考《生物化學試驗原理和方法》(李建武等編，2023)。POD、EST同工酶材料預備與提?。喝12黃瓜植株子房在M99、W5培育基上離體培育，分別取0d、3d、6d…的黃瓜子房材料各1g，加2g樣品提取液，冰浴研成勻槳，然后4℃下離心10min(10000r／min)，上清夜即酶液。其中POD同工酶樣品提取液為pH=7.0磷酸緩沖液硫基乙醇；EST同工酶的樣品提取液為pH=6.4的磷酸緩沖液+0.1%硫基乙醇(陳啟林，1999)。Bio-RADMiniTrans-Blotcell穩(wěn)壓電泳儀和雙面垂直泳槽在室溫中進展電泳時分別膠濃度為120V穩(wěn)壓電泳3~4h。過氧化物酶同工酶承受聯(lián)苯胺染色法；酯酶同工酶染色承受堅牢藍RR鹽法。同工酶電泳均重復3次。總蛋白樣品的制備以分裂率較高的3號品系為供體材料，取開花前l(fā)天未受精子房，經(jīng)外表滅菌后接種至M99培育基上培育，與培育的第0d、3d、6d和l0d分別取外植體2g，先用蒸餾水洗凈，吸干外表水，再用塑料膜小袋包裝后快速置于-80℃保存?zhèn)溆?。參照Damerval(1986)等的方法制備總蛋白樣品。/提取液(w/v)1:4的比例懸浮于-20℃的丙酮提取液中(含10%TCA，0.07%(—ME)，-20℃沉淀2h；15,000rpm，4℃條件下離心20min，棄上清液；沉淀重懸浮-20℃的丙酮中(含0.07%(—ME)，-20℃沉淀1h；15,000rpm，4℃條件下離心20min4℃下真空枯燥，然后保存于-20℃冰箱中待丙酮完全揮發(fā)后即可使用。上樣前，樣品按lmg.20μ1樣品溶解緩沖液(1ysisbuffer)溶解，Eppendorf離心機最高速離心20min，取上清液上樣。和蛋白質(zhì)分子量標記均購自Phamarcia公司，聚丙烯酰胺、尿素等購自上海生工公司。雙向聚丙烯藏胺凝膠電泳(IEF/SDS-PAGB)(ZEF/SDS-)技術(shù)分別特異蛋白質(zhì)。電泳參照等的方法進展并加以改進。第一向等電聚焦電泳(IEF)：灌制IEF柱膠，上面注少許重蒸水隔離空氣并壓平膠面。柱高11.5cm，直徑2mm。每管上樣量100μ1(濃度5.5mg/ml，共約550mg蛋白質(zhì))。全蛋白質(zhì)濃度測定承受紫外吸取差值閱歷公式：蛋白質(zhì)濃度(mg/m1)=1.55×0.D.2800.76×O.D.260(李立人和王維光，1991)。電極液正極為0.01MH3PO4，負極為0.02MNaOH。室溫下按以下程序進展電泳：①預電泳，200V15min；300V30min；400V30min。②正式電泳，500V6h以上；600V10h：800V1.5h。電泳后，膠條用12.5%三氯乙酸(TCA)固定5min，再轉(zhuǎn)移到雙蒸水中漂洗兩次直至膠條背景透亮為止(約5min左右)15min-20℃以下保存?zhèn)溆?。的分別膠，再灌濃度為4%的濃縮膠。垂直平板規(guī)格20×17×0.1cm.IEF膠條用1%瓊脂糖(用凝膠平衡液配酚藍前沿距凝膠底邊0.1cm時，停頓電泳并取膠。承受銀染或CBBR-250染色。主要試劑配方如下：①lysisbuffer(參照Damervaleta1.，1986的方法配置)：100mlUrea(9.5M)β-Mercaptoethanol(5%)NP-40(2%)40%Ampholine(pH6.0~8.0)40%Ampholine(pH3.5~10.0)ddH2O4℃保存。②IEF膠的配方:10mlUreaArc(28.38%)-Bis(1.62%)10%NP-40ddH2O40%Ampholine(PH5.0-7.0)40%Ampholine(PH6.O-8.0)40%Ampholine(PH3.5-10.0)10%APTEMED③分別膠配方：100mlArc(29.1%)-Bis(0.9%)Tris～HCl(PH8.8，1.5M)ddH2O10%SDS10%APTEMED④濃縮膠配方：100mlArc(29.1%)-Bis(0.9%)Tris+HCl(PH6.8.0.5M)ddH2O10%SDS10%APTEMED⑤凝膠平衡液：100mlGlycerin(10%)SDS(4%)Tris—HCl(pH6.8，0.1M)

57.06g5ml2ml1.6ml0.4ml→100m15.5g1.33ml2.0ml1.97ml200μml200μml100μml10μml3.5μl100ml25.0ml33.23ml100μml100μml40μml16.5ml26.3ml55.62ml1ml1ml80μml10ml4g1.21gβ—ME(2%) 2mlddH2O →100m1⑥SDS-電極緩沖液(10×)：100mlSDS(1%) 1gTris(3.22%) 3.22gGlycine(14.1%) 14.1gddH2O →100m1銀染(19