半夏pinellia ternata加倍體主要成分測定及其不同時期變化分析

DeterminationofMainConstituentsonPolyploidPinelliaternateandTheirVariationinGrowthPeriodsDissertationSubmittedtoinpartialfulfillmentofforthedegreeMasterof Prof.JishuangMay 三葉半夏inlliatrntahunb.)it)急（對照，P）加倍為十六倍體半夏（（W六0.97%，符合藥典所規(guī)倍體半夏中灰分含量為3.32%，低于藥典中的4.0%；加倍體半夏的水溶性浸出23.75%9.0%。表明半夏加倍后，沒有降低其藥比，十六倍體半夏藥材中多糖含量提高了18.69%，差異顯著，蛋白含量保持不變；與野生半夏相比，十六倍體半夏多糖含量提高了9.3%，蛋白含量無明顯變利用HPLC測定半夏中鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷和的含量，比較別提高了71.9%和22.9%，含量分別提高了42.6%和15.9%。三種成分相：三葉半夏Pinelliaternata(Thunb.)Brietisoneofthevariousperennialherbaceousntsratoon,onetraditionalmedicinalherbsthatisthemostcommonlyusedbyourcountry.Inrecentyears,withtheincreasingofecologicalenvironmentdeterioration,wildpinelliaresourcesaredecreasing,butthedemandofpinelliaforpeopleisrapidlygrowing.Tofindnewresourcesforsupplement,ourgroupsuccessfullyinducedsixteentimesbodyofP.ternata(polyploid)fromoctoploid(control)usingtheinductionofcolchicinesuspensioncultureofpinelliasingle-celled,accordingtotheprincipleofinducingpolyploidcanimprovetheyieldanditseffectiveingredientsofmedicinalnts.Thispolyploidhadsomemorphologicalchanges,suchaspetiolestout,leafthickening,tuberamplifyingandthecontentofchlorophyllincreasingandsoon.Tostudytheeffectivecomponentsofthispolyploidchangedornot,wedeterminedabsoluteandrelativecontentofprotein,polysaccharide,alkaloidsandnucleosideamongsixteentimesandoctoploid,andwildP.ternata.AndthendeterminingcontentvariationofeachpropertiesofsixteentimesbodyofP.ternataindifferentgrowthperiods.Thatprovidedabaseforsubsequentnewvarieties.Themainresultsweredisyedhere:Accordingtothe2010edition PHARMACOPOEIA(CP),timesbodyofP.ternatawasidentified.TheresultshowedthatsixteentimesbodyP.ternatacontainsarginine,alanine,leucine;onthesamepositioninsiliconsheetinsolublesubstancesthatrespectivelyfromsixteentimesbodyofP.ternataandwildP.ternateshowedcorrespondingspots;thesuccinicacidcontentofsixteentimesbodyofP.ternatais0.97%,muchhigherthanthe0.25%inCP;thewatercontentofsixteentimesbodyofP.ternatais6.6%,muchlowerthanthe14%inCP;thewaterextractcontentofsixteentimesbodyofP.ternatais23.75%,higherthanthe9.0%inCP.ThisshowedthatcharactersofsixteentimesbodyofP.ternatahadnotchanged.Polysaccharidesandproteinwerechoicedasindexes,comparingtheabsolutecontentsandtherelativeratiosofeffectivecomponentsinsixteentimesbodyofP.ternata,octoploidofP.ternataandwildP.ternata.Polysaccharideswereyzedbytheoptimizationofsulfuricacidphenolspectrometry.AndthecontentofproteinwasdeterminedbyUVspectrophotometry.ComparedwithoctoploidofP.ternata,polysaccharidesinsixteentimesbodyofP.ternatawerefoundtoincreaseby18.7%,andthecontentofproteinremainedunchanged.Furthermore,comparedwiththetotalcontentofthesetwocomponents,theratiosofpolysaccharidesandproteinwerefollowing:thoseforsixteentimesbodyofP.ternatawere75.29%and24.71%,thoseforoctoploidofP.ternatawere72.78%and27.22%,atthesametime,thoseforwildP.ternatawere73.73%and26.27%,andthosefor ofsixteentimesbodyofP.ternatawere76.01%,23.99%,respectively.PolysaccharidesinsixteentimesbodyofP.ternataweresignificantlyhigherthanoctoploidofP.ternata,andtherelativeratiosamongthemweresignificant,butclosetowildP.ternata.TheresultssuggestedthatsixteentimesbodyofP.ternatacanbeusedasagoodbreedingmaterial.Guaninenucleoside,adeninenucleosideandephedrinewereyzedbyHPLC,theabsolutecontentsoftheabovecomponentsinsixteentimesbodyofP.ternata,octoploidofP.ternataandwildP.ternatawereyzedandtherelativeratiosamongthemwerecompared.ComparedwithoctoploidP.ternataandwildP.ternata,guaninenucleosideinsixteentimesbodyofP.ternatawerefoundtoincreaseby82.3%and28.6%,andadeninenucleosideincreaseby71.9%and22.9%,whileephedrinewerefoundtoincreaseby42.6%and15.9%,respectively.Furthermore,comparedwiththetotalcontentofthesethreecomponents,theratiosofguaninenucleoside,adeninenucleosideandephedrinewerefollowing:thoseforsixteentimesbodyofP.ternatawere34.18%,12.7%and53.12%,thoseforoctoploidofP.ternatawere26.9%,10.2%and62.9%,atthesametime,thoseforwildP.Ternatawere30.89%,12%and57.12%,respectively.Guaninenucleoside,adeninenucleosideandephedrineinsixteentimesbodyofP.ternataweresignificantlyhigherthanthoseofP.ternataoctoploidandP.ternata,andtherelativeratiosamongthemwerestable.TheaboveresultssuggestedthatsixteentimesbodyofP.ternatacanbeusedasagoodproductionmaterial.Determiningcontentofprotein,polysaccharide,alkaloids,adeninenucleosideandguaninenucleosideofsixteentimesbodyandwildP.ternata,andcomparingthebothinthosefourgrowthstage,"outofseedlingstage","beadbudsperiod","spathesperiod"and"pourseedlingstage".Andthengettingthebestharvesttime,soastogetthebestmedicinalmaterialswhathasthemostpharmacodynamicactions.TheresultsshowedthatproteinandpolysaccharideofwildP.ternataandsixteentimesbodyofP.ternatapresentedfirstlyascendedandthendescended.Fromoutofseedlingstagetobeadbudsperiod,andspathesperiod,thosecompositionreduced.Fromspathesperiodtopourseedlingstage,thecontentofproteinandpolysaccharidegraduallyincreasedtotheseedlinglevel.EspeciallyeachcontentofpolyploidP.ternatawasthemost.ComparedwithwildP.ternata,thecontentofalkaloids,adeninenucleosideandguaninenucleosideofsixteentimesbodyofP.ternatawashigherineachperiod. Pinelliaternata;Polyploid;Octoploid;Constituentsdetermination;Differentgrowthperiods 摘 第一章文獻(xiàn)綜 半夏概 半夏生物學(xué)特 半夏繁殖方 半夏生長習(xí) 半夏組織培養(yǎng)研 藥用植物多倍體研究進(jìn) 多倍體育種優(yōu) 營養(yǎng)的巨大 成分含量增 抗性增 三葉半夏多倍體研 半夏化學(xué)成分研究進(jìn) 半夏蛋白概 半夏多糖概 半夏多糖測定方 半夏生物堿類研究進(jìn) 半夏核苷類物質(zhì)研究進(jìn) 半夏刺激性成分研究進(jìn) 半夏揮發(fā)性油研究進(jìn) 半夏氨基酸類研究進(jìn) 半夏不飽和脂肪酸研究進(jìn) 本研究的目的、意義和主要內(nèi) 目前半夏生產(chǎn)及研究中存在的突出問 本研究的目的、意義及主要內(nèi) 第二章加倍體半夏組分的鑒 材料與方 材料與試 實(shí)驗(yàn)方 半夏氨基酸鑒 供試品溶液的............................................................................對照品溶液的...........................................................................點(diǎn)樣、展 顯 樣品醇溶物測 供試品溶液................................................................................對照品溶液................................................................................點(diǎn)樣、展 顯 有機(jī)酸含量的測 樣品溶液的................................................................................水分測 灰分測 浸出物的測 結(jié)果與討 加倍體半夏氨基酸鑒別結(jié) 醇溶性物質(zhì)的鑒別結(jié) 有機(jī)酸含量測定結(jié) 水分測定結(jié) 灰分含量測定結(jié) 浸出物含量測定結(jié) 本章小 第三章半夏蛋白及半夏多糖測定及方法優(yōu) 概 3.2.1材料與試 實(shí)驗(yàn)方 供試品..........................................................................................對照品..........................................................................................測定波長選 多糖提取條件優(yōu) 多糖測定條件優(yōu) 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪 方法學(xué)實(shí) 精密度實(shí) 穩(wěn)定性實(shí) 重復(fù)性實(shí) 結(jié)果與討 測定波長選 乙醇濃度對提取效果影 乙醇用量對提取效果影 水浴溫度對測定效果影 水浴時間對測定效果影 標(biāo)準(zhǔn)曲 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié) 精密度實(shí) 穩(wěn)定性實(shí) 重復(fù)性實(shí) 不同樣品中多糖含量測 不同樣品中蛋白含量測 本章小 第四章半夏生物堿及核苷類物質(zhì)的測 概 原料與試 儀器與設(shè) 實(shí)驗(yàn)方 色譜條 對照品溶液..................................................................................供試品溶液..................................................................................標(biāo)準(zhǔn)曲線繪 性關(guān) 方法學(xué)實(shí) 穩(wěn)定性實(shí) 方法重復(fù)性實(shí) 加樣回收實(shí) 結(jié)果與討 4.4.1與鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷標(biāo)準(zhǔn)曲 4.4.4不同樣品中、鳥嘌呤核苷與腺嘌呤核苷測定結(jié) 本章小 第五章半夏不同生長時期各成分的變 概 實(shí)驗(yàn)材 原料與試 儀器與設(shè) 實(shí)驗(yàn)方 結(jié)果與討 半夏不同生長時期總蛋白含量變 半夏不同生長時期多糖含量變 4.4.3半夏不同生長時期生物堿含量變 5.4.4半夏不同生長時期核苷類含量變 本章小 第六章全文總結(jié)與展 成 第一章105屬，3700多種[1]。主要分布在熱帶和帶地區(qū)。中國有26屬200余種,種屬數(shù)量都不多,但不少屬如PinelliaArisaemaRemasatiaColocasia等都是以唯一的東亞分布型，為該科中較進(jìn)化的屬。其中P.terfnateBreit.產(chǎn)，P.tripatitaSchott產(chǎn)，該屬植物中國目前發(fā)現(xiàn)的有10種，分別為滴水珠（P.cordataiiapdatistapeltataternatapolyghyllaensis裂葉半夏（P.trpartita）姊歸半夏（P.ziguiensis）及五葉半夏（P.ternate）[3]。三葉半夏主、、、、[4]，在海拔2500m以下的的塊莖為，其中75％左右為淀粉，還含有許多有用的藥理學(xué)成分，如子的大小發(fā)育均屬正常，但是成熟時，還沒有分化的胚，只是形成一個原球明：以生物學(xué)產(chǎn)量(塊莖)為目的的栽培條件則以土層深厚、肥沃，pH5.6~7的育與溫度的關(guān)系則是在地溫15℃左右始苗，20~25℃左右生長最快，26℃以上則出現(xiàn)倒苗現(xiàn)象，入秋13℃以下則枯苗越冬。此入生長旺盛期后，適度3000lx[20]。濕度是半夏最重要的生態(tài)條件之一，半的地區(qū)的半夏生長曲線峰值期則分別在6月和8月MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織，通過小塊莖途徑形成完整的植株，移栽可達(dá)100%[22]。白雨、范美華等用不同激素成功誘導(dǎo)了愈傷組織的分化[23,24]。等對組織培養(yǎng)的三葉半夏含量還略高[25]。何奕昆了三葉半夏組培小塊莖的形成條件，并用包埋法將形成的小塊莖制作工，獲得了90%以上的萌發(fā)率[26]。研究了蔗糖、多中添加0.2mg/L2，4-D和1.0mg/LKT可以使試管三葉半夏成苗[28]。丁N6培養(yǎng)基中都誘導(dǎo)出可以提高1.6~3倍[32]。植物細(xì)胞組增加而產(chǎn)生多倍體是高等植物進(jìn)化的顯著特征。在理方法、化學(xué)方法和生物學(xué)方法。物理方法是利用溫度激變、機(jī)械、電離輻射、非電離輻射、離心力等物理因素誘導(dǎo)加倍[55]；化學(xué)方法化學(xué)誘導(dǎo)多倍體是指利用秋水仙素、富民隆、生物堿、除草劑等化學(xué)藥劑處理正在的細(xì)胞以誘導(dǎo)加倍的方法，這種方法具有經(jīng)濟(jì)方便、誘變作用專一性強(qiáng)、誘變突植株，并用根尖，葉表皮氣孔等對多倍體植株進(jìn)行鑒定。變[62]，屬于葉植物中甘露糖凝集素。由于半夏蛋白在抗腫瘤、抗及抗進(jìn)行抑制的研究，才發(fā)現(xiàn)半夏蛋白為半夏抗的主要有效成分[68]。半夏的 物稻、煙草等，也同樣具有抗蟲的效果[69,70]。G-250Bradford蛋白濃度測定方法。對半夏蛋白含量的測定已多有，等[71]對半夏種內(nèi)不同居群間半夏蛋白含量進(jìn)定，發(fā)現(xiàn)其含量變化較大；溫海霞等[72]對不同葉形間的半夏蛋白含量進(jìn)定并（S180平均含量2.533mg/g。楊等[81]采用苯酚-硫酸法于491nm處測定半夏生品及不同制品中半夏多糖含量，結(jié)果顯示半夏生品中半夏多糖含量為11.4%，法半夏準(zhǔn)品，采用酸性比色法[82]、高效液相色譜法[83]和薄層色譜法[84]測定半夏中生酸性比色法的原理是利用生物堿在一定的pH條件下與溴麝香酚藍(lán)定量氏等[85]采用這種方法測得半夏中總生物堿的含量，分別了波長、PH值、以及用量，最終確定波長在420nm，pH值6.4，用量4ml，為最佳測定條夏5種制品中的含量。目前對于不同粒徑[88]、不同生長時期[89]以及栽培半夏中提取得到一種生物堿，100mg/kg的劑量能使貓?zhí)幱跔顟B(tài)。大鹽春治等發(fā)現(xiàn)0.5~1.0mg/kg的左旋可以抑制阿撲所致小，認(rèn)為該成半夏能顯著升高貓的阿樸最小催吐量，若將半夏投與犬時，能抑制硫谷千鶴[96]分離出具刺激性的2,5-二羥基苯乙酸苷。久保川彥[97]尿黑酸皓等[98]采用X-衍射、電鏡掃描及氧還原滴定等多種，結(jié)果均表明半夏中含王銳等[99]采用的“同時蒸餾-萃取”裝置提取中藥半夏揮發(fā)油，運(yùn)用毛-3-甲基-二十烷(3-Methyleicosa)、棕櫚酸(Ethylpalmitate)、1-辛烯(1-Octene李先端等[76]利用835-50型氨基酸分析儀進(jìn)定,發(fā)現(xiàn)半夏中含有蘇氨酸、析,質(zhì)譜圖用NBS譜庫檢索,從而鑒定出亞油酸(Linoleicacid)、十六烷酸(Hexade-canoicacid)8-十八碳烯酸(8-Octadecenoicacid)、油酸(Oleicacid)、9氧代壬酸(Nonanoicacid,9-oxo)、十五烷酸(Pentadecanoicacid)、9-十六碳烯酸)11-二十碳烯酸(11-Eicosenoicacid)、花生酸(Eicosanoicacid)、10,13-二十碳二烯酸(10,13Eicosadienoicacid)、山酸(Docosanoicacid)等脂肪酸。吳皓[53]等在多年來由于對野生半夏資源的掠奪式，使其分布逐漸萎縮，加上各種漲，常以一些外表非常相似的偽品如虎掌(P.pedatisectaSchott)、水半夏(TyphoniumflagelliformeBlume)等替代半夏入藥，造成半夏藥材及其制成品的混有2個主要來源：野生和野生半夏塊莖集中種植。半夏的生產(chǎn)正如許多80~100kg。從少量10年以上甚至更三是品質(zhì)，病害發(fā)生嚴(yán)重，半夏栽培風(fēng)險增加：生產(chǎn)上半夏主要以塊莖進(jìn)行無性繁殖，在連續(xù)種植后出現(xiàn)的種質(zhì)已成為半夏生產(chǎn)中最突出的問黃瓜花葉CMV和多種未確定或RNA致病因子的侵染。我們近織培養(yǎng)技術(shù)對八倍體半夏(octoploidofPinelliaternata,OP)進(jìn)行了脫毒加倍誘導(dǎo)研比率比較；UVildinlliatrnat,W種成分的含量比率及不同時期的變化測定可以為十六倍體半夏的成分含量及藥用價值做一個總體評價，為后續(xù)新品種的開發(fā)提供依據(jù)。第二章苗后采收塊莖，洗凈，除去外皮和須根，曬干。mg的混合溶液，作為對照品溶液。l.0g10ml1h以石油醚（60~90℃)-乙酸乙酯--甲酸（30:6:4:0.5)為展開劑，展開，取50ml25ml樣品溶液，照電位滴定法測定，用鹽酸（0.lmol/L）滴定液3.0g作為供試品，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，精密過5mg為止。取適量的加倍體半夏樣品，使能通過二號篩，精密稱取2.0g，作為供溫度至550℃，使完全灰化至恒重。取適量的加倍體半夏，，過二號篩，精密稱定2.0g作為供試品，F(xiàn)ig.2-1TheacidspectraofP.ternata2-21號為野生半夏樣品，2號為加倍體半2-2Fig.2-2ThealcoholsolubleextractivespectraofP.ternata0.1mol/L8.2ml1ml氫氧化鈉中和反應(yīng)需lml20101ml氫氧化鈉(0.1mol/L)量為0.967%，而藥典中規(guī)定不少于0.25%即可。商品藥材中通常含有一定量的灰分，報(bào)過植物本身的生理灰分和外來泥沙響3.3220104.0，符合要求。以對半夏浸出物進(jìn)定。以干燥品計(jì)算供試品中浸出物的含量為23.75%，遠(yuǎn)高于2010版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)9.0%，符合要求。（S180有抑制作用，即半夏多糖成份具有抗腫瘤作用。當(dāng)前腫瘤高，主要的治療化療和放療可導(dǎo)致、。因此對具有止嘔和抗腫瘤雙重作用的酮下降，從而導(dǎo)致。因此，半夏蛋白在抗腫瘤和抗方面有較大的應(yīng)用潛410月中旬，植株倒苗后采收塊莖。經(jīng)鑒定為：1號樣品為十六倍體三葉半夏（PP）塊莖；2號樣品為八倍體三葉半夏（OP）塊莖；3號樣品為十六倍體三葉半夏離體（CP）塊莖；4號樣品為野生半夏（WP）塊莖。Biomate3S紫外分光光度計(jì)（Thermo公司、離心機(jī)（Sigma公1.5h，冷卻，稱定重量，加蒸餾水補(bǔ)足損失的重量。用紗布過濾，吸取2ml濾min沉淀加30ml蒸餾水溶解即得。1.0g0.02g30min4ml上清液離心（4000rpm、15min。吸取上清液進(jìn)行比色，在作分別取葡萄糖（對照品）2ml1ml5%苯酚溶nm進(jìn)行全波長掃描，根據(jù)最大吸收峰，選擇測定波長。 、℃；水浴時間選取 、 、min0.3、0.15、0.075mg/ml2ml于試管中，按照優(yōu)化后條件，測2ml5份于試管中，按照優(yōu)化后的硫酸苯酚法進(jìn)行顯色，以相應(yīng)試劑為空白，在490nm處測定其吸光度，實(shí)驗(yàn)的精密度。51.0g，精密稱取，按照優(yōu)化后的硫酸苯酚490nm處測定其吸光度，對重復(fù)性進(jìn)行。利用紫外分光光度計(jì)在400~800nm進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果見圖3-1，由圖543210 3-1Fig.3-1TheUVabsorptionspectraofreferencesubstanceand為乙醇濃度對提取效果的影響，本研究固定乙醇用量為10倍體積，水4020min3-2。隨著乙醇濃度增加，吸光度增大，因此選取濃度為100%的乙醇作為較佳的沉淀溶劑。 乙醇濃度3-2Fig.3-2Theinfluenceofethanolconcentrationonthe為乙醇用量對提取效果影響，本研究固定乙醇濃度為100%，水浴溫度20ml作為較佳的用量。 3-3Fig.3-3Theinfluenceofethanolcontentonthe100%20ml20min，考5443322 3-4Fig.3-4Theinfluenceofwaterbathtemperatureonthe增加，吸光度增加，20~50min20min。5443322 3-5Fig.3-5Theinfluenceofwaterbathtimeto圖可知葡萄糖在0.075~0.75mg/ml之間具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Fig.3-6ThestandardcurveofRSD為0.12%，表明儀器精密度良好。Table3-1Theresultsofprecision123450,1,2,4,8h時分別測定吸光度，結(jié)2-2。結(jié)果表明，待測液在8hRSD0.6%。表3-2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)Table3-2TheresultsofStabilitytest01248取同一批次半夏粗粉5份，每份1g，精密稱取，按照3.3方法進(jìn)行，表明RSD為0.42%，重復(fù)性良好。表3-3重復(fù)性結(jié)Table3-3Theresultsofrepeatability12345精密稱取半夏粗粉5份，每份1.0g，按照供試品方法中多糖測定方采用紫外分光光度計(jì)在490nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算半夏202.15mg/g239.93含量含量0 3-7*:p<0.05vsFig.3-7Thedeterminationresultsofpolysaccharideinsamplesofpinellia*:p<0.05vs精密稱取半夏粗粉1.0g，按照供試品方法中蛋白測定方法供試品溶液，分別在280nm和260nm下分別測定其吸光度，依據(jù)：蛋白質(zhì)(mg/ml)=(1.45A280-0.74A260)X稀釋倍數(shù)。式中:A280為蛋白質(zhì)溶液在280nm0 3-8Fig.3-8Thedeterminationresultsofproteininsamplesof量的百分比，具體結(jié)果見表2-4。3-4Table3-4Therelativeratiobetweenpolysaccharideandproteininsamplesof實(shí)驗(yàn)結(jié)果（3-73-8）表明十六倍體半夏多糖含量高于八倍體半夏和六倍體半夏多糖含量提高了9.3%，蛋白含量無明顯變化。表明，八倍體半夏染致相對于八倍體半夏，十六倍體半夏中的多糖表達(dá)增加。十六倍體離體塊莖第四章管哮喘有積極作用，白權(quán)等[32]比較了、云南等19個產(chǎn)地的野生和栽培半夏加劑等[37]。吳皓等[34]（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）半夏塊莖：將離體塊莖用珍珠巖混勻保濕，2510天后種植，待其生長至10月中旬，植株倒苗后采收塊莖。經(jīng)中國藥學(xué)教授鑒塊莖，如圖4-1所示。Fig.4-1Octoploidand16timesbodyofP.ternatatuber.A-OctoploidofP.ternatatuber;B-16timesbodyofP.ternatatuber.對照品：腺嘌呤核苷（純度>99.%）與鳥嘌呤核苷（純度>99.9%）購自阿純度>99.7Agilent1100液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器（Agilent公司、離色譜柱：AgilentZORBAXExtendC18柱（250X4.6mm，5μm填充顆粒（2:98；核苷：260nm，鳥嘌呤核苷：254nm。（5：95；檢測波長：鹽酸：207nm。mg/mg的溶液，作為對照品；根據(jù)鹽酸對照品的商品使用說明，將其于干燥12h。75%乙醇（含1%鹽酸30min。合并兩次上清液，60℃水浴蒸干。10μl990μl雙蒸1μg/ml的溶液。精密吸取100μl上述各濃度溶液注入高效液相色譜儀，測定吸收峰，以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。10μl990μl雙蒸1μg/ml的溶液。精密吸取100μl上述各濃度溶液注入高效液相色譜儀，測定吸收峰，以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。鹽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：精確稱量10mg鹽酸對照品，加入10ml甲醇10mg/ml的溶液，依次稀釋，配制成8mg/ml、4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml橫坐標(biāo)（X），得到腺嘌呤核苷峰面積與進(jìn)樣濃度的線性關(guān)系。20mg/ml16mg/ml、8mg/ml、4mg/ml、2mg/ml的取十六倍體半夏按照上述4.2.3供試品溶液，于0,2,8,12,24,48h分別測試品溶液5份，按照4.2.1色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。ACACB4-2HPLCFig.4-2HPLCchromatographyofstandardTable4-1Linearregressionequationsofguaninenucleoside,adeninenucleosideand 線性范圍Tab4-2 線性范圍由表4-2可知鳥嘌呤核苷與腺嘌呤核苷在半夏水溶性成分提取物樣品濃度為1時，濃度與HPLC峰面積值呈良好的線性關(guān)系。在進(jìn)樣濃度為10mg/ml品進(jìn)樣濃度為10mg/ml。1.9%，表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。1.9%；腺嘌呤核苷加樣回收率為103.2%，RSD為1.6%；加樣回收率95.6%，RSD2.3%（PP（CK * μg.g-μg.g-0

4-3**p<0.01、*p<0.05Fig4-3Thecontentsofguanosine,adenosineandephedrineinthe16timesbodyofP.ternata,octoploidofP.ternateandwildP.ternate.**p<0.01,*p<0.0538.31μg/g、μg/g；含量分別為160.30μg/g、138.36μg/g、148.36μg/g。Table4-3.Therelativeratiosofguanosine,adenosineephedrineinthe16研究對十六倍體半夏中鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷和采用HPLC法進(jìn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（4-3）十六倍體半夏塊莖中鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷與麻激素較原植物高出達(dá)10倍之多。伍曉麗等[38]丹參同源四倍體中隱丹參酮、IAIIA203.26%、70.48%16%。推論是由于3表明八倍體半夏加倍后的劑量倍增效應(yīng)增加了其所含藥用次生代謝同時也為后續(xù)以HPLC方法評價不同品種半夏的品質(zhì)提供了可參考的進(jìn)樣濃度呤核苷、腺嘌呤核苷及一樣，峰面積（即其濃度）也隨著進(jìn)樣濃度呈線性有助于優(yōu)化半夏藥材品質(zhì)及緩解藥用半夏供求。第五章以確定半夏關(guān)鍵的生長期及采收期，指導(dǎo)半夏GAP生產(chǎn)，同時可以為半夏建立丁試劑公司、鹽酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99.7%）購自中國藥品生物制品檢定所、甲醇（色譜純，Tedia公司、乙腈（色譜純，Tedia公司、磷（分析純，江蘇化工公司、98%濃硫酸、5%苯酚溶液、葡萄糖、30%NaOH60%儀器：Agilent1100液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器（Agilent公司、離心機(jī)（德國Sigma公司、超聲儀（康科瑞公司、真空干燥儀（沈3S紫外分光光度計(jì)（德國Thermo公司）等。3.3.1和4.3.3的方法供試品出苗 珠芽 佛焰苞 倒苗5-1Fig5-1Thecontentsofproteininpinelliaatdifferentgrowth出苗 珠芽 佛焰苞 倒苗5-2Fig5-2Thecontentsofpolysaccharideinpinelliaatdifferentgrowth4.4.3 佛焰苞 5-3Fig5-3Thecontentsofephedrineinpinelliaatdifferentgrowth生物堿含量持續(xù)增加。十六倍體半夏各個時期的生物堿含量均比野生半夏含量5.4.4變化見圖5-4,5-5：ug/g 佛焰苞 5-4Fig5-4Thecontentsofguanosineinpinelliaatdifferentgrowth 佛焰苞 5-5Fig5-5Thecontentsofadenosineinpinelliaatdifferentgrowth5-4,5-5可知，半夏中鳥嘌呤核苷與腺嘌呤核苷含量從出苗期到倒苗期第六章2010版《中國藥典》對加倍體半夏組分從化學(xué)層面（氨基酸、醇溶用C測定半夏中鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷和的含量，比較三種半夏中這三類成分的絕對含量以及它們之間相對比率的差異。以鳥嘌呤核比率穩(wěn)定,說明十六倍體半夏在數(shù)目倍增后，所含有效藥用成分的增加是[1].觀葉植物養(yǎng)護(hù)與欣賞[M].:江蘇科學(xué)技術(shù)[2].從生態(tài)地理探索天南星科的[J].云南植物研究[3],趙南先.中國天南星科花粉形態(tài)的研究[J].植物分類學(xué)報(bào).2002,[4]伊廷雙,,李德銖.天南星科分類系統(tǒng)的沿革[J].武漢植物學(xué)研究.2002,20(1):48~61.[5],,徐麗珍.半夏屬藥用植物的研究進(jìn)展[J].國外?中醫(yī)中藥分冊.2004.26(1):17~25.吳皓,,等.半夏藥材鑒別成分的研究[J].中國中藥.2003.28(9):KarenKP,PerH,KellK.ColchicineandoryzalinmediatedchromosomedoublingindifferentgenotypesofMiscanthussinensis[J].ntCell,TissueandOrganCultur.2003.73(2):137~146.JaneFiuzaRodriguesPoradeCarvalho,CarlosRobertodePoradeCarvalho,andW.C.Otoni.,Invitroinductionofpolyploidyinannatto(Bixaorellana)[J].ntCell,TissueandOrganCulture,2005.80(1):69~75.程.2008,28(6):丁蘭,.藥用植株半夏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和植株再生體系建立研究[J].北方園藝.2007.(9):187~190.[J].作物學(xué)報(bào)1996..三葉半夏花藥培養(yǎng)及其多倍體誘導(dǎo)研究[D].浙江理工大學(xué)畢業(yè).2007.,李德葆.我國13種天南星科作物上的芋花葉[J].微生物學(xué)報(bào).1996.36(2):126~131.ChenJS,ZhengL,LinMetal.ArelatedtoSoybeanmosaicPinelliaternatainanditscomparisonwithlocalsoybeanSMVisolates[J].ArchivesofVirology,2003(15):12~16..天南星科植物的分子診斷和半夏研究[M]. 浙江大學(xué).,.半夏種內(nèi)居群形態(tài)變異的模糊聚類分析[J].植物資源與環(huán)境.1997.6(3):29~34.AlisdairRF,LotharW,andRichardNT.Sucrosetostarch:atransitioninmolecularntphysiology.TrendsinntScience,2002,7(1):35~41.何奕昆,,等.半夏莖尖培養(yǎng)及塊莖品質(zhì)改良[J].植物學(xué)報(bào).1994.36(1):39~44.白雨,高山林.半夏組織培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體的正交試驗(yàn)[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào).2003.12(4):16~20.范美華,周吉源,等.半夏愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖效應(yīng)[J].山東中.2005.何奕昆,,何孟元等. 作物學(xué)報(bào).1997.23:482~285.楊凱,,楊艷瓊等.不同激素濃度配比對半夏組培成苗的影響[J].云南學(xué)報(bào).2005.(5):615~619.丁蘭,.藥用植株半夏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和植株再生體系建立研究[J].方園藝.2007.(9):187~190.胡.培養(yǎng)下的體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生[J].西北植物學(xué)報(bào).2006.劉慶昌.甘薯細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及有效植株再生[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)1996.張立瑩,,等.東北紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).1997,28(3):180~185.ZhengGuangzhi.ntCellCultureanditsSeeondaryMetabolism.Yunnanuniversitypress[M〕.:科學(xué)技術(shù).1990素形成的影響[J].生物工程學(xué)報(bào)1995.元英進(jìn),葛志強(qiáng),等.南方紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞凋亡的組織學(xué)定位及與細(xì)胞分化的關(guān)系初探[J].植物生理學(xué)報(bào).2000.26(6):515~517.,,張輝.銀杏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及其銀杳內(nèi)酷產(chǎn)生的研究[J].生物工程學(xué)報(bào).1999.15(2):207~210.D.J.Carrier,N.Chauret,M.Maneinietal.ntCellRep,1991.李干雄,黃巧明.紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中不同添加物對細(xì)胞生長和紫杉醇合成的影響[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào).2000.9(3):11~14.,,等.藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].河北林業(yè)科技.2003.7(4):22~23.王素芳,,趙樹進(jìn)等.植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)[J].中國生物制品學(xué).2002.15(6):381~383.,韓烈保,曾會明.植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)影響因子研究[J].生物技術(shù)通報(bào).2005.(9)5:11~15.,常莉,薛建平.藥用植物多倍體誘導(dǎo)研究進(jìn)展[J].中國中藥,2005.30(9):645~649.艾建國,高山林 藥物生物術(shù).2003.陳紹潘,陳紹裘,等.秋水仙堿誘變甜菊多倍體的研究[J].植物學(xué)研究.1995,13(l):1~7.吳玉香,高建平,趙曉明.黃芩多倍體的誘導(dǎo)與鑒定[J].中藥材.羅躍龍,彭菲,劉軍.杭白芷的多倍體誘導(dǎo)與培育[J].中國中藥.2004.29(2):183~189.[40],蘭利瓊,傅華龍.秋水仙堿誘導(dǎo)川貝愈傷組織多倍體的研究[J].武漢植物學(xué)研究.2002.20(6):449~452.高山林,舒.桔梗同源四倍體的誘導(dǎo)與鑒定[J].中藥材.2002,棣,蔣甲福,房偉民等.秋水仙堿誘導(dǎo)菊花腦多倍體的研究[J].農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào).2002.ComptonME,GrayDJ,EtromGW.Identificationoftetraploidregenerantsfromcotyledonsofdiploidwatermelonculturedinvitro[J].Euphytica,1996(87):陳紹潘.秋水仙堿誘變甜菊多倍體的研究[J].武漢植物學(xué)研究.1995.13(1):l~7.呂世民,,葛傳吉等.懷牛膝多倍體育種的研究[J].中藥通報(bào).1988.顏.藥用植物多倍體育種應(yīng)用研究概況[J].中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2006.伍曉麗,劉飛,李隆云等.多倍體育種技術(shù)在藥用植物上的應(yīng)用[J].重慶中草藥研究.2005.52(2):50~53.吳清,向素瓊,嚴(yán)勇等.金蕎麥的離體繁殖及同源四倍體的誘導(dǎo)[J].西南學(xué)報(bào).2001.23(2):108~111.GmitterFG,LingXB,DengXX.InductionoftriploidcitrusntsfromendospermcalliinVitro[J].TheorAppleGenet.1990.(80):785~788.TamaraM,TaoR,SugiaraA.ProductionofdodecaploidntsofJapanesepersimmonbycolchicinestreatmentofprotosts[J].ntCellReports.1996.連雪斌.蘭州百合多倍體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)報(bào)[J].農(nóng)業(yè)科技.ChenCH,GoedenKallemeynYC.Invitroinductionoftetraploidntsfromcolchicinestreateddiploiddaylilycallus[J].Euphytics,1979,(28):705~709.張興翠,周昌華,殷家明等.藥用百合的多倍體誘導(dǎo)及快速繁殖[J].西南學(xué)報(bào)2003.25(1):14~18...陶宗晉，等.半夏蛋白的分離、結(jié)晶、生物和一些化學(xué)性質(zhì)[J].生熊素芳，，等.幾種不同制半夏對妊娠小白鼠致畸作用的研究[J].中醫(yī)，1987，(6):51~53.陳蕙玲，，陶宗晉.半夏蛋白的抗兔胚泡著床作用[J].生理學(xué)報(bào)鄭國燦.半取液的抗腫瘤性研究[J].中醫(yī)，2004，22(9):9~13.[60]黃必勝.Bel-7402的誘導(dǎo)凋亡作用[J].時珍國醫(yī)國付蕓，黃必勝，李娟，等.半夏蛋白抗腫瘤活性組分的提取分離[J].中國中信息，2007，14(1):45~47.S180細(xì)胞的影響[J].大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版，2009，30(1):10~15.潘映紅掌葉半夏凝集素的分離純化及抗蚜活性研究[J].1998LinJ，etal.ExpressionandPurificationofaNovelMannose-BindingLectinFromPinelliaternata.MolBiotechnol，2003，25(3):215~222，陶宗晉，等.