乳腺癌her2檢測的學(xué)習(xí)資料

乳腺癌her2檢測的學(xué)習(xí)資料第1頁/共51頁信號傳導(dǎo)至細(xì)胞核細(xì)胞核接合部酪氨酸激酶活性部分細(xì)胞漿細(xì)胞膜生長因子（配體）癌基因活化細(xì)胞分裂

HER2受體跨膜二聚體的信號傳導(dǎo)途徑第2頁/共51頁1=-

基因拷貝數(shù)2=-

mRNA

轉(zhuǎn)錄3=-

細(xì)胞表面受體蛋白表達(dá)4=-

細(xì)胞外受體功能域釋放A=HER2DNAB=HER2mRNAC=HER2receptorprotein正常擴增/過度表達(dá)細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞膜1234CBAHER2過度表達(dá)：正常狀態(tài)的10-100倍第3頁/共51頁

HER2癌基因的致瘤機制：抑制凋亡，促進(jìn)增殖；增加腫瘤細(xì)胞的侵襲力；促進(jìn)腫瘤血管新生和淋巴管新生。研究表明：

30％以上的人類腫瘤中存在HER2基因的擴增/

過度表達(dá)（如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、輸卵管癌、胃癌和前列腺癌等;

20％－30％的原發(fā)性浸潤性乳腺癌有HER2基因的擴增/過度表達(dá)。第4頁/共51頁HER2陽性患者的生存期比陰性者縮短一半以上轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的中位生存期HER2陽性 8-10個月HER2陰性 17-22個月SlamonDJetal.Science1987;235:177–82第5頁/共51頁2004年發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)陰性患者預(yù)后與HER2狀態(tài)密切相關(guān)p=0.0001CumulativediseaserecurrencecurvesSunJM.Cancer2004;101:2516–220.30.20.10

0 20 40 60 80 100月HER2陽性患者平均風(fēng)險曲線HER2陰性患者平均風(fēng)險曲線基礎(chǔ)風(fēng)險曲線第6頁/共51頁HER2表達(dá)在原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶呈高度一致*Mainlydistantmetastases.**Liverandlungmetastases.Lymphnodemetastaseswereanalysedinallcases,exceptinthestudiesbyVincent-Salomonetal(2002)andGancbergetal(2002),wheredistantmetastaseswereanalysed.Study

Masood&Bui(2000)Shimizuetal(2000)Simonetal(2001)

Tanneretal(2001)Gancbergetal(2002)Vincent-Salomonetal(2002)Tsutsuietal(2002)

Carlssonetal(2004)Primarytumours32%38%25%

28%29%25%25%

55%Metastases32%38%22%

28%27%*20%**25%

55%PercentageIHCoverexpression第7頁/共51頁2005年St.Gallen國際治療指南

乳腺癌危險度分級低度中度高度淋巴結(jié)－－1+(1～3)2+(1～3)1+(﹥3)2pT（cm）≤2伴﹥21病理分級1或2～31瘤周脈管－或+1HER2－或+1

－

2+1年齡≥35或＜351第8頁/共51頁2005StGallen

指南乳腺癌初診時需明確HER2

HER2陽性即做為高風(fēng)險因子加以考慮Goldhirschetal2005CMF,cyclophosphamide,methotrexate,5-fluorouracil預(yù)后評估預(yù)后差療效預(yù)測從赫賽汀?的治療中最大獲益芳香化酶抑制劑的療效優(yōu)于三苯氧胺蒽環(huán)類和紫杉類的療效優(yōu)于CMF第9頁/共51頁隨著腫瘤的靶向性治療的發(fā)展，以單抗為主的分子靶點藥物的不斷研制應(yīng)用，已成為腫瘤靶向治療的新武器

Herceptin即為一種針對HER2受體的高純度重組DNA衍生物的人源化單克隆抗體，是乳腺癌治療領(lǐng)域的第一個分子靶向性藥物第10頁/共51頁刺激刺激HER2タンパクがん細(xì)胞増殖刺激刺激HER2タンパク癌細(xì)胞増殖抑制Heceptin的作用HeceptinHeceptin：一種針對Her-2/neu受體的高純度重組DNA衍生物的人源化單克隆抗體，是乳腺癌治療領(lǐng)域的第一個分子靶向性藥物，具有高效、低毒、選擇性強的特點●癌細(xì)胞表面存在著CerbB-2蛋白，受刺激后促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖●20～30％的癌細(xì)胞Her-2/neu基因的蛋白CerbB-2●與CerbB-2結(jié)合阻斷和抑制細(xì)胞的增殖●轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人的治療效果●檢測癌細(xì)胞表面cerbB-2存在程度決定使用第11頁/共51頁意義靶向藥物Heceptin僅對HER2擴增的乳腺癌有效→準(zhǔn)確的檢測HER2有無擴增是臨床應(yīng)用Heceptin的絕對必要條件，也是成功進(jìn)行靶向治療的前題和關(guān)鍵HER-2擴增的乳腺癌往往提示其惡性程度高，進(jìn)展迅速，化療緩解期短，對CMF方案化療反應(yīng)降低→乳腺癌化療藥物環(huán)磷酰胺、阿酶素、5－氟尿嘧啶等的主要參考指標(biāo)第12頁/共51頁

HER-2擴增的乳腺癌對蒽環(huán)類藥物和紫杉醇類藥物化療敏感性高→HER2和拓?fù)洚悩?gòu)酶II-a基因同時擴增的乳腺癌患者，可以從蒽環(huán)類藥物為基礎(chǔ)的方案中受益，故同時檢測HER2和拓?fù)洚悩?gòu)酶II-a可以篩選出以蒽環(huán)類化療藥為基礎(chǔ)的化療方案候選患者HER-2擴增的乳腺癌對三苯氧胺易產(chǎn)生耐藥性→制定內(nèi)分泌治療方案的有力依據(jù)

HER-2擴增的乳腺癌無病生存率和總生存率低，并且與淋巴結(jié)陽性、癌的高級別、陰性受體狀態(tài)及高增殖活性有關(guān)→預(yù)后判斷的參考指標(biāo)意義第13頁/共51頁ST.GALLEN2007HER2：乳腺癌危險因素的新定義低中高G1T≤2ER/PR+年齡<35歲G2-3T>2淋巴結(jié)1-3和HER2+,ER/PR-或淋巴結(jié)≥4淋巴結(jié)-,HER2+,ER/PR-或LVI侵潤淋巴結(jié)1-3且HER2-,

ER/PR+淋巴結(jié)-HER2-

LVI無RISKRISK第14頁/共51頁2007NCCN治療指南

－HER2檢測的原則

第15頁/共51頁ASCO/CAP:HER2檢測指南HER2陽性：

IHCHER23+(完整的，強的膜陽性>30%)或FISHHER2基因擴增(HER2/CEP17>2.2

或HER2

基因拷貝數(shù)>6

信號/核，無內(nèi)對照的探針)HER2陰性：

IHCHER20-1+或

FISHHER2基因擴增(HER2/CEP17<1.8

或HER2基因拷貝數(shù)<4信號/核，無內(nèi)對照的探針)不能確定：IHCHER22+或

FISHHER2基因擴增(HER2/CEP171.8-2.2

或HER2基因拷貝數(shù)4-6信號/核，無內(nèi)對照的探針)第16頁/共51頁HER2測定流程圖第17頁/共51頁HER2的檢測方法免疫組織化學(xué)（IHC）：HER2蛋白的表達(dá)熒光原位雜交（FISH）：HER2基因的擴增顯色原位雜交（CISH）：HER2基因的擴增酶聯(lián)免疫分析（EIA）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）第18頁/共51頁HER2陽性定義IHC3+CISH+FISH+或或蛋白過度表達(dá)基因擴增==第19頁/共51頁一抗結(jié)合于Her-2受體二抗結(jié)合并激活底物反應(yīng)顯色免疫組織化學(xué)法原理Immunohistochemistry(IHC)第20頁/共51頁IHC檢測HER2表達(dá)初篩最常使用的方法。判斷HER2蛋白過表達(dá)最重要的是染色方法的標(biāo)準(zhǔn)化和結(jié)果的判斷。建議使用美國食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的試劑盒。應(yīng)使用EnVision法和高質(zhì)量的DAB顯色液以避免內(nèi)源性生物素的影響。應(yīng)有嚴(yán)格的、包括內(nèi)部和外部的質(zhì)量控制，須設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照。第21頁/共51頁IHC結(jié)果判斷先在10×物鏡下進(jìn)行判讀注意細(xì)胞膜完全著色的癌細(xì)胞比例及著色強度胞質(zhì)著色應(yīng)忽略不計導(dǎo)管內(nèi)癌(DCIS)的著色應(yīng)忽略不計，只評定浸潤癌的著色情況正常乳腺上皮不應(yīng)著色應(yīng)使用美國FDA批準(zhǔn)的HercepTest評分系統(tǒng)第22頁/共51頁第23頁/共51頁第24頁/共51頁ASCO/CAP

：C-erbB2IHC的評分0(陰性):無染色,或<10%的膜染色1+(陰性):>10%的細(xì)胞膜微弱的或不完整的膜染色2+(弱陽性):>10%細(xì)胞弱到中等膜染色3+(強陽性):>10%中等到強的完整的膜染色>30%第25頁/共51頁01+第26頁/共51頁2+3+第27頁/共51頁C-erbB2第28頁/共51頁2008/12/12第29頁/共51頁HER-2檢測:IHC抗原修復(fù)有/無組織固定方法抗體選擇評分標(biāo)準(zhǔn)變異性第30頁/共51頁福爾馬林固定/石蠟包埋組織

HER基因擴增2－5倍（SouthernHybridization）Slamonetal,Science244:712,1989HER2“陰性”是由于組織固定后抗原被遮蔽需要行抗原修復(fù)來糾正CourtesyMichaelPress第31頁/共51頁第32頁/共51頁FISH是一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交。在熒光顯微鏡下，于細(xì)胞和(或)組織原位觀察并分析細(xì)胞核內(nèi)雜交于DNA靶序列的多種彩色探針信號，以獲得細(xì)胞內(nèi)多條染色體(或染色體片段)或多種基因狀態(tài)的信息?！敖饦?biāo)準(zhǔn)”第33頁/共51頁HER2geneHER2geneHER2gene雙鏈靶基因變性的單鏈DNA與熒光標(biāo)記探針復(fù)性\產(chǎn)生熒光信號熒光原位雜交法原理

FluorescenceinsituHybridisation(FISH)第34頁/共51頁HER2探針絕大部分是同時含有HER2基因(標(biāo)記為橘紅色熒光)和該基因所在的17號染色體著絲粒(標(biāo)記為綠色熒光)序列的混合探針經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)的進(jìn)口探針

VS國產(chǎn)探針第35頁/共51頁第36頁/共51頁評價17號染色體數(shù)目和意義HER2基因位于17號染色體上，大約有47%的乳腺癌存在17號染色體非整體性，即17號染色體不是正常的二體，而是單體或多體。綠色探針可以將17號染色體的非整體性和單純的HER2基因擴增，尤其是低水平的擴增區(qū)分開。當(dāng)HER2基因與17號染色體數(shù)目比值大于2時，即為HER2基因擴增。加入了這個內(nèi)對照，就排除了單色探針(探針中僅有HER2基因)可能造成的假陰性(17號染色體單體)或假陽性(17號染色體多體)。臨床研究顯示，具有這類遺傳學(xué)特征的患者對治療的反應(yīng)和預(yù)后與單純的基因擴增明顯不同。第37頁/共51頁質(zhì)量控制內(nèi)對照：雜交的組織、細(xì)胞中有75%的細(xì)胞核顯示出雙色信號時，視為實驗成功，并且紅、綠信號互為對照，癌與非癌細(xì)胞互為對照。外對照：應(yīng)選擇FISH陽性和陰性的標(biāo)本片。第38頁/共51頁結(jié)果判讀雜交信號計數(shù)應(yīng)選擇細(xì)胞核大小一致、核的邊界完整、二脒基苯基吲哚(DAPI)染色均一、細(xì)胞核孤立無重疊、綠色著絲粒信號清晰的細(xì)胞。隨機計數(shù)20～30個癌細(xì)胞核中的雙色信號。判讀標(biāo)準(zhǔn)紅色信號的總數(shù)與綠色信號的總數(shù)比值>2.2時，即為HER2基因擴增若紅、綠兩信號的比值>20或眾多信號連接成簇時可不計算，即視為基因擴增；若比值介于1.8～2.2之間，則需要再計數(shù)20個細(xì)胞核中的信號或由另外一個分析者重新計數(shù)。如仍為臨界值，則應(yīng)在FISH檢測報告中注明。若HER2基因擴增在不同癌細(xì)胞中存在異質(zhì)性時，應(yīng)在另一癌區(qū)域再計算20～30個癌細(xì)胞核中的紅、綠信號值，報告其最大值，并加以注釋。注意避免G2期細(xì)胞內(nèi)的基因拷貝數(shù)目特征(4個拷貝)可能導(dǎo)致的計數(shù)誤差。第39頁/共51頁HER2probeCEP17probeHER2/CEP17ratio=1HER2/CEP17ratio=1HER2/CEP17ratio=7NoamplificationNoamplification;tetraploidyHER2geneamplification(ratio>2.2)第40頁/共51頁HE