實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的分離和培養(yǎng)

第一部分微生物的利用微生物：是指結(jié)構(gòu)簡單、形體微小的單細(xì)胞、多細(xì)胞或沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物，如酵母菌、細(xì)菌、放線菌、霉菌、藍(lán)細(xì)菌和病毒等。絕大多數(shù)微生物與傳染病無關(guān)，90%以上的微生物是對人類有益的。微生物有多種用途，許多抗生素來源于放線菌和霉菌；有些食品由微生物發(fā)酵制成，如酒由酵母發(fā)酵產(chǎn)生，腐乳由紅曲霉和毛霉發(fā)酵制成。當(dāng)前1頁，總共34頁。實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離基本要求1.進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作。2.進(jìn)行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)。當(dāng)前2頁，總共34頁。一、大腸桿菌

革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌在腸道中一般對人無害但也有一些菌株對人體是有害的，可侵襲腸粘膜并產(chǎn)生毒素任何大腸桿菌如果進(jìn)入人的泌尿系統(tǒng)，都會對人體產(chǎn)生危害。當(dāng)前3頁，總共34頁。結(jié)晶紫碘液95%乙醇革蘭氏染色法1min革蘭陽性

革蘭陰性1min脫色復(fù)染當(dāng)前4頁，總共34頁。菌落（colony）：一個細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基上發(fā)展成一個肉眼可見，具一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群。光滑型菌落粗糙型菌落當(dāng)前5頁，總共34頁。當(dāng)前6頁，總共34頁。二、細(xì)菌的培養(yǎng)和分離1、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：移液槍當(dāng)前7頁，總共34頁。接種環(huán)玻璃刮刀當(dāng)前8頁，總共34頁。超凈工作臺（保證無菌環(huán)境）當(dāng)前9頁，總共34頁。高壓蒸汽滅菌鍋當(dāng)前10頁，總共34頁。恒溫培養(yǎng)箱當(dāng)前11頁，總共34頁。搖床當(dāng)前12頁，總共34頁。2、培養(yǎng)基：平板斜面固體培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：蛋白胨：0.5g酵母提取物：0.25gNaCl:0.5gH2O:50mL瓊脂：1g液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基調(diào)pH值當(dāng)前13頁，總共34頁。菌膜菌沉淀均勻渾濁對照液體培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）當(dāng)前14頁，總共34頁。3、實(shí)驗(yàn)步驟：（1）培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿滅菌

——高壓蒸汽滅菌法

將配制好的50mlLB液體和固體培養(yǎng)基分別裝入250ml三角瓶中，加上封口膜；

將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好；置于滅菌鍋內(nèi)1kg壓力滅菌15min

（121℃）當(dāng)前15頁，總共34頁。無菌技術(shù)

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞（不能用脫脂棉：易吸水引起后引起污染），也可采用各種金屬、塑料、封口膜及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。（160℃2h或170℃1h）當(dāng)前16頁，總共34頁。高壓蒸汽滅菌法：玻璃器皿、金屬、移液槍頭等（火焰）灼燒：接種環(huán)、試管口、三角燒瓶口紫外燈+過濾風(fēng)：超凈臺滅菌消毒：70%酒精棉球（消毒：利用化學(xué)或物理方法，殺死大部份致病微生物的過程。）當(dāng)前17頁，總共34頁。（2）倒平板

滅菌后，待滅菌鍋壓力與大氣壓力相同時打開鍋蓋將有培養(yǎng)基的三角瓶和培養(yǎng)皿放到超凈臺上打開超凈臺的紫外燈和過濾風(fēng)，待固體培養(yǎng)基冷卻到60℃時，關(guān)閉紫外燈用酒精棉球消毒桌面和手。當(dāng)前18頁，總共34頁。倒平板：10-12ml培養(yǎng)基/培養(yǎng)皿

每倒入一個后立即置于水平位置上，輕輕晃動，使培養(yǎng)基鋪滿平皿底部，待凝，并形成平面。酒精燈旁：左手？右手？當(dāng)前19頁，總共34頁。制作試管斜面：

將配制好的呈熔化狀態(tài)的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到試管中時必須用三角漏斗

滅菌試管冷卻到50℃左右，把試管棉塞一端擱在玻棒上，待冷凝后即成試管斜面

將分裝好的含培養(yǎng)基的試管滅菌P21小字部分當(dāng)前20頁，總共34頁。1/3在試管外，2/3在試管內(nèi)正確不正確棉塞制作當(dāng)前21頁，總共34頁。（3）接種培養(yǎng)

左手：將大腸桿菌斜面和有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶，靠近酒精燈火焰；

右手：拿接種環(huán)，并用無名指和小指夾住斜面的棉塞和三角瓶的封口膜；

接種環(huán)在火焰上燒紅，再深入到斜面，使環(huán)接觸培養(yǎng)基，再取菌體；

將菌體放入三角瓶的液體培養(yǎng)基中，瓶口封口膜和管口棉塞復(fù)原；

將三角瓶置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h。當(dāng)前22頁，總共34頁。當(dāng)前23頁，總共34頁。（4）劃線分離

在酒精燈火焰上灼燒接種環(huán)；

將搖床上培養(yǎng)了12h的菌液打開，接種環(huán)部分深入到菌液中；

在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線，接種環(huán)只在菌液中蘸菌液一次，劃線后蓋好培養(yǎng)皿；

將培養(yǎng)皿倒置（蓋在下面），放到恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24h后，可看到在劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個菌落，表明菌已被分離。當(dāng)前24頁，總共34頁。劃線分離法劃線的起點(diǎn)要有菌，且每一次新的起點(diǎn)應(yīng)比前一次的起點(diǎn)菌含量（濃度）低劃線的最終點(diǎn)不能與前面的劃線點(diǎn)重疊除第1次外，其余幾次劃線前，都要將接種環(huán)火焰灼燒當(dāng)前25頁，總共34頁。恒溫培養(yǎng)箱平板倒置防止培養(yǎng)皿蓋上的冷凝水滴落入培養(yǎng)基表面，使菌落中的菌隨水?dāng)U散，造成污染。當(dāng)前26頁，總共34頁。劃線分離法當(dāng)前27頁，總共34頁。（5）斜面接種保存

在無菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面上。

37℃培養(yǎng)24h后，4℃冰箱保存。當(dāng)前28頁，總共34頁。涂布分離法當(dāng)前29頁，總共34頁。首先，涂布分離法的操作比劃線分離法更復(fù)雜。因?yàn)橥坎挤蛛x法包括先將菌液稀釋的步驟，而且通常要稀釋多個濃度，常稀釋到10-5-10-7倍。（稀釋實(shí)驗(yàn)過程見P26圖）在涂布時，從不同稀釋度的稀釋菌液中各取0.1ml放在平板固體培養(yǎng)基上，再用玻璃刮刀涂布后培養(yǎng)。其次，涂布分離法更易分開單菌落。通常培養(yǎng)皿中有20個以內(nèi)的單菌落為最合適。當(dāng)前30頁，總共34頁。土樣稀釋當(dāng)前31頁，