基于基因拆分技術(shù)從生物學(xué)方面控制轉(zhuǎn)基因飄流,基因工程論文

基于基因拆分技術(shù)從生物學(xué)方面控制轉(zhuǎn)基因飄流,基因工程論文轉(zhuǎn)基因技術(shù)的問(wèn)世給世界帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、生態(tài)等多方面的效益，成為新一代綠色革命的利器，是農(nóng)業(yè)近代史上發(fā)展最快的新技術(shù)。國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(InternationalServicefortheAcquisitionofAgri-biotechApplications，ISAAA)2020年報(bào)告指出，全球有27個(gè)國(guó)家種植了轉(zhuǎn)基因作物，種植面積比2020年增加了500萬(wàn)hm2。自1996年種植以來(lái)的18年間，從最初的170萬(wàn)hm2增加到1．75億hm2，增長(zhǎng)速度驚人?？梢姡D(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展呈現(xiàn)不可阻擋的趨勢(shì)。但隨著該技術(shù)的發(fā)展，其安全性問(wèn)題備受矚目，華而不實(shí)花粉介導(dǎo)的基因飄流及其可能引起的環(huán)境后果是人們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。研究者們?yōu)榻档娃D(zhuǎn)基因向其他物種的飄流做過(guò)很多嘗試，包括物理隔離和諸多生物學(xué)措施，各種措施因物種和基因本身等性質(zhì)有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，當(dāng)前尚未明確哪種措施最簡(jiǎn)單有效，且具有通用性?；虿鸱旨夹g(shù)是建立在內(nèi)含肽intein及其介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，將目的基因拆分成兩個(gè)片段，分別與intein兩個(gè)剪接域的基因序列結(jié)合，構(gòu)成融合基因，翻譯后構(gòu)成的兩個(gè)融合蛋白通過(guò)intein介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接功能，將intein從前體蛋白中切除，同時(shí)將兩個(gè)基因片段編碼的蛋白質(zhì)序列連接起來(lái)，構(gòu)成一個(gè)完好的、有功能的蛋白質(zhì)。基因拆分技術(shù)的提出為通過(guò)生物學(xué)措施控制轉(zhuǎn)基因飄流提供了新的思路和途徑。1基因拆分技術(shù)的理論基礎(chǔ)1．1Intein的概念及分類內(nèi)含肽intein是存在于蛋白質(zhì)前體中的一段氨基酸序列，與兩側(cè)的外顯肽(extein)存在于同一個(gè)表示出框中，同時(shí)表示出成前體蛋白，在前體蛋白成熟的經(jīng)過(guò)中，intein通過(guò)自剪接的方式將本身從中切除出去，同時(shí)將兩端的外顯肽以肽鍵的形式連接起來(lái)，該經(jīng)過(guò)也被稱為蛋白質(zhì)的自我剪接。與ＲNA內(nèi)含子(intron)類似，蛋白質(zhì)內(nèi)含肽屬于能夠移動(dòng)的遺傳元件，內(nèi)含肽的剪接反響發(fā)生于蛋白質(zhì)水平，而且反響經(jīng)過(guò)不需要任何輔助因子的介入(圖1)。1990年，intein初次在研究釀酒酵母液泡H+-ATPase基因TGPl時(shí)被發(fā)現(xiàn)。其后的20幾年里，intein的研究和應(yīng)用發(fā)展非常迅速。截至2018年，在Inbase數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)的內(nèi)含肽達(dá)585個(gè)，華而不實(shí)112個(gè)在真核生物中，290個(gè)在細(xì)菌中，另外183個(gè)屬于古細(xì)菌。當(dāng)前僅在單細(xì)胞真核生物中發(fā)現(xiàn)intein，而在高等動(dòng)、植物，甚至低等多細(xì)胞真核生物中都沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)含肽的存在。關(guān)于內(nèi)含肽的分類有很多講法，常見的是根據(jù)內(nèi)含肽中間構(gòu)造域的類型將內(nèi)含肽分為經(jīng)典內(nèi)含肽、微小內(nèi)含肽和斷裂內(nèi)含肽。經(jīng)典內(nèi)含肽的中間構(gòu)造域?yàn)闅w巢核酸內(nèi)切酶構(gòu)造域，微小內(nèi)含肽的中間構(gòu)造域僅為一個(gè)連接構(gòu)造域，而斷裂內(nèi)含肽在中間構(gòu)造域的特定位點(diǎn)斷開，在基因組中不同的位置獨(dú)立表示出。經(jīng)典內(nèi)含肽與微小內(nèi)含肽的中間構(gòu)造域有共價(jià)連接，因而也叫做順式剪接內(nèi)含肽(cis-splicingintein);斷裂內(nèi)含肽的中間構(gòu)造域無(wú)共價(jià)鍵連接，也叫做反式剪接內(nèi)含肽(trans-splicingintein)。SspDnaE內(nèi)含肽(Syne-chocystissp．PCC6803DnaEintein)是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)天然存在的斷裂內(nèi)含肽，存在于編碼DNA聚合酶Ⅲ的催化亞基的DnaE基因中，包括123個(gè)氨基酸殘基的In(InteinN端)和36個(gè)氨基酸殘基的Ic(InteinC端)兩個(gè)構(gòu)造域，In和Ic在基因組上相距745kb。與人工合成的intein相比，DnaEintein催化的蛋白質(zhì)剪接具有反響效率高和反響條件溫和等特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證明SspDnaEintein在離體、活體條件下均能進(jìn)行蛋白質(zhì)的剪接反響，使分開的兩個(gè)基因片段表示出后的蛋白質(zhì)片段重新組裝成有功能的完好蛋白質(zhì)。諸多研究證明，內(nèi)含肽的自我剪接并不依靠于其兩側(cè)外顯肽的種類，也就是講，當(dāng)外顯肽被外源蛋白質(zhì)替換掉時(shí)，該剪接作用仍然能夠發(fā)生。同時(shí)，內(nèi)含肽自剪接反響是自發(fā)進(jìn)行的，甚至能夠在體外進(jìn)行。這給利用intein進(jìn)行更多的蛋白質(zhì)工程和植物基因工程研究提供了嶄新的思路。1．2Intein的剪接機(jī)制根據(jù)內(nèi)含肽的保守性及其特點(diǎn)，多數(shù)內(nèi)含肽被分為10個(gè)模塊，從N端到C端依次是存在于N端的A、N2、B和N4，位于核酸內(nèi)切酶構(gòu)造域的C、D、E和H，以及位于C端的F和G。經(jīng)研究，普遍以為A、B、F和G是intein維持構(gòu)造或進(jìn)行剪接反響所必需的。在對(duì)諸多intein的保守性氨基酸的研究中發(fā)現(xiàn)，有4個(gè)高度保守的位點(diǎn)對(duì)intein剪接功能有重要作用，包括:A∶1位置的Ser、Thr或Cys;G末端的Asn;C-extein的第一氨基酸Ser、Thr或Cys，以及intein的倒數(shù)第二個(gè)氨基酸His。后來(lái)的研究也以為B∶10位的His對(duì)剪接經(jīng)過(guò)也有很重要的影響。當(dāng)前對(duì)內(nèi)含肽的剪接機(jī)制已經(jīng)研究的非常透徹，普遍以為內(nèi)含肽的自我剪接分為四個(gè)階段，分別是:①N-X?；D(zhuǎn)移反響(X代表O原子或S原子，后同):這是第一個(gè)酰基轉(zhuǎn)移反響，A∶1位的S或O原子攻擊其上游肽鍵的C原子，使N端的外顯肽轉(zhuǎn)移到N端剪接域的Ser氧原子或Cys硫原子上，構(gòu)成帶有酯鍵或硫酯鍵的中間產(chǎn)物。大多數(shù)inteinN端的第一個(gè)氨基酸殘基為Cys或Ser。②轉(zhuǎn)酯反響:C端剪接域的親核殘基攻擊N端在第一步構(gòu)成的酯鍵或硫酯鍵，進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反響，至此，N-extein轉(zhuǎn)移到C端剪接域的Ser(Thr)的O原子或Cys的S原子上，C端剪接域的第一個(gè)氨基酸殘基能夠是Cys、Ser或Thr。③Asn環(huán)化反響:C端剪接域的Asn環(huán)化使內(nèi)含肽與C-extein之間發(fā)生斷裂，將內(nèi)含肽剪切下來(lái)。④X-N酰基轉(zhuǎn)移反響:這是第二個(gè)?；D(zhuǎn)移反響，通過(guò)酯鍵或硫酯鍵連接的兩個(gè)extein經(jīng)過(guò)重排構(gòu)成肽鍵，內(nèi)含肽脫離，構(gòu)成成熟蛋白質(zhì)。1．3Intein衍生的新技術(shù)內(nèi)含肽的發(fā)現(xiàn)和研究給蛋白質(zhì)工程研究提供了諸多便利條件。利用內(nèi)含肽的剪接作用，能夠進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化、表達(dá)蛋白的連接(EPL)、蛋白質(zhì)的環(huán)化、毒蛋白的大量合成，以及多聚體蛋白合成等。在人們廣泛關(guān)注的轉(zhuǎn)基因安全問(wèn)題中更是具有宏大的潛力。利用基因拆分技術(shù)將外源基因在植物體內(nèi)拆分表示出后再組裝成有功能的蛋白，在很大程度上限制了該基因向近緣物種的飄流，基因拆分技術(shù)的研究很可能為安全轉(zhuǎn)基因提供強(qiáng)大的技術(shù)支撐。2基因拆分技術(shù)在限控轉(zhuǎn)基因飄流中的應(yīng)用斷裂內(nèi)含肽的發(fā)現(xiàn)為利用基因拆分技術(shù)限控轉(zhuǎn)基因飄流提供了有用的工具。但基因拆分技術(shù)能否作為一項(xiàng)有效措施用于限控轉(zhuǎn)基因飄流，這取決于基因拆分后在植物體內(nèi)重新組裝成有功能蛋白質(zhì)的效率及限控轉(zhuǎn)基因飄流的效果。2．1基因拆分后在植物體內(nèi)的重新組裝效率Chin等把耐除草劑基因epsps分成N端和C端兩部分，N端與葉綠體定位信號(hào)和SspDnaEintein的In融合構(gòu)成EPSPSn-In，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將EPSPSn-In整合到煙草核基因組中;C端與SspDnaEintein的Ic融合構(gòu)成Ic-EPSPSc，利用基因槍法將Ic-EPSPSc整合到含有EPSPSn-In煙草的葉綠體基因組中。結(jié)果同時(shí)含有EP-SPSn-In和Ic-EPSPSc的轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出了抗草甘膦的特性，證明了intein介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)剪接能夠在植物葉綠體中發(fā)生。Yang等將-葡糖醛酸苷酶基因gus的N端和C端分別與SspDnaEIntein的In和Ic連接構(gòu)成融合基因GUSn/In和Ic/GUSc，利用共轉(zhuǎn)化或有性雜交的方式方法將GUSn/In和Ic/GUSc導(dǎo)入到擬南芥基因組中，同時(shí)含有兩個(gè)基因片段的轉(zhuǎn)基因擬南芥成功表示出了GUS活性。Gils等利用intein介導(dǎo)的Barnase蛋白重新組裝系統(tǒng)創(chuàng)立了一種全新的制備小麥雄性不育系的方式方法，初次通過(guò)雜交使雜交種中同時(shí)含有N、C兩個(gè)片段，并得到產(chǎn)生不可育花粉的植株。2018年，Kempe等也在小麥中證實(shí)intein可在小麥中恢復(fù)拆分后的Barnase基因的功能，講明intein介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)剪接不僅在形式植物中，在單子葉植物中同樣也能發(fā)揮功能。抗草甘膦的G2-aroA在F295/S296位點(diǎn)拆分后，能夠在intein介導(dǎo)的轉(zhuǎn)剪接作用下組裝成有活性的功能蛋白。靳茜等根據(jù)G2-aroA基因的可拆分位點(diǎn)F295/T296，利用PCＲ方式方法將G2-aroA基因分成N端和C端兩部分，并分別與SspDnaEintein的N端和C端連接，構(gòu)成融合基因片段EnIn和IcEc，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別導(dǎo)入煙草核基因組中，通過(guò)雜交獲得同時(shí)含有2個(gè)片段的轉(zhuǎn)基因煙草，證明G2-aroA基因拆分后在煙草葉綠體中重新組裝成完好有功能的蛋白的效率可到達(dá)100%。2．2基因拆分技術(shù)限控轉(zhuǎn)基因飄流的效果基因拆分技術(shù)用于限控基因飄流的優(yōu)勢(shì)是它降低了目的基因從轉(zhuǎn)基因植株向近緣野生種飄移的概率(圖2)。理論上，基因拆分技術(shù)限控轉(zhuǎn)基因飄流的效果與兩個(gè)基因片段的插入位點(diǎn)密切相關(guān)。根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律，假設(shè)拆分后的兩個(gè)基因片段插入到轉(zhuǎn)基因植物的非同源染色體上，雜交后代產(chǎn)生的花粉中有25%同時(shí)含有兩個(gè)基因片段;當(dāng)兩個(gè)基因片段插入到同源染色體上時(shí)，假如不考慮染色體交換，雜交后代的花粉中同時(shí)含有兩個(gè)基因片段的概率為0。靳茜等通過(guò)有性雜交的方式方法獲得同時(shí)含有EPSPSn-In或Ic-EPSPSc的轉(zhuǎn)基因煙草，自交試驗(yàn)證明了兩個(gè)基因片段插入在非同源染色體上，回交試驗(yàn)結(jié)果表示清楚后代中有23．61%的植株具有草甘膦抗性，與兩個(gè)基因片段插入非同源染色體上時(shí)25%為抗性苗的假設(shè)相符，證明了利用基因拆分技術(shù)培育的轉(zhuǎn)基因植物中，其外源基因向有性雜交種的基因飄流頻率至少能夠降低75%。3問(wèn)題與瞻望糧食發(fā)展的目的不僅要讓人們吃得飽，還要吃得好、吃的安全，這為轉(zhuǎn)基因技術(shù)在糧食作物上的應(yīng)用提供了良好的契機(jī)，同時(shí)也讓轉(zhuǎn)基因技術(shù)承受了宏大的挑戰(zhàn)，怎樣趨利避害，提供安全的、環(huán)境友好的轉(zhuǎn)基因方案是當(dāng)今生物科學(xué)界不得不面對(duì)的問(wèn)題。為了從根本上杜絕基因飄流，保障轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的環(huán)境和食品安全，研究者們提出了一系列生物學(xué)措施來(lái)控制轉(zhuǎn)基因飄流，包括葉綠體轉(zhuǎn)化、可控轉(zhuǎn)基因技術(shù)、閉花受精、基因刪除、轉(zhuǎn)基因削弱和雄性不育等。但每種措施都有其本身的特點(diǎn)和使用范圍。如葉綠體為母系遺傳，利用葉綠體轉(zhuǎn)化培育的轉(zhuǎn)基因植物，其基因飄流的風(fēng)險(xiǎn)大大降低，但有些植物的葉綠體不是母系遺傳，而且葉綠體轉(zhuǎn)化時(shí)同質(zhì)化很困難，這都制約了葉綠體轉(zhuǎn)化的應(yīng)用。雄性不育能有效地控制父本的轉(zhuǎn)基因飄流，但仍能作為母本與其有性可交配種雜交而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雜交種。轉(zhuǎn)基因弱化技術(shù)能控制基因向雜草的飄流，但不能限制轉(zhuǎn)基因向同物種的飄流。2018年，Hsken等對(duì)這些措施各自的優(yōu)缺點(diǎn)和當(dāng)下的研究進(jìn)展進(jìn)行了具體的綜述，并指出沒有哪種措施能夠百分百地控制轉(zhuǎn)基因飄流，只要多種措施結(jié)合使用才能獲得理想的限控轉(zhuǎn)基因飄流的效果?；虿鸱旨夹g(shù)為限控轉(zhuǎn)基因飄流上提供了新的思路。如上所述，已有包括gus、G2-aroA、和ALSⅡ等基因在內(nèi)的多個(gè)基因拆分后利用此技術(shù)在擬南芥、煙草和小麥等植物中恢復(fù)目的蛋白功能，而且在煙草中也明確了基因拆分后在植株水平上的重新組裝效率可高達(dá)100%，能降低至少75%的轉(zhuǎn)基因飄流頻率，因而，基因拆分技術(shù)可能具有很好的通用性。而且通過(guò)挑選，獲得拆分后的基因片段位于同源染色體的轉(zhuǎn)化體，就有可能完全控制轉(zhuǎn)基因植株的基因飄流。但基因拆分技術(shù)的普遍應(yīng)用，還需要解決下面兩個(gè)問(wèn)題:一是基因有效可拆分位點(diǎn)的挑選，二是建立從分子水平上明確基因拆分后的重新組裝效率的技術(shù)。相信隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，相關(guān)新方式方法、新技術(shù)的涌現(xiàn)，基因拆分技術(shù)在防控轉(zhuǎn)基因飄流中會(huì)擁有廣闊的應(yīng)用前景，并將進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的商業(yè)化進(jìn)程。參考文獻(xiàn)［1］李陽(yáng)生，朱英國(guó)．轉(zhuǎn)基因技術(shù)新的綠色革命的利器［J］．植物生理學(xué)報(bào)，2020，(7):603－607．［2］JamesC．2020年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)［J］．中國(guó)生物工程雜志，2020，34(1):1－8．［3］馬三梅，王永飛．降低轉(zhuǎn)基因植物外源基因擴(kuò)散的分子策略［J］．遺傳，2004，(4):556－559．［4］孔寧，王旭靜，唐巧玲，等．生物學(xué)措施限控基因漂流的研究進(jìn)展［J］．中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2008，10(3):24－30．［5］PerlerFB，DavisEO，DeanGE，etal．．Proteinsplicingelements:inteinsandexteinsadefinitionoftermsandrecommendednomenclature［J］．NucleicAcidsＲes．，1994，22(7):1125－1127．［6］魏新元．內(nèi)含肽的研究及應(yīng)用進(jìn)展［J］．西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008，(05):171－178．［7］KanePM，YamashiroCT，WolczykDF，etal．．ProteinsplicingconvertstheyeastTFP1geneproducttothe69-kDsubunitofthevacuolarH(+)-adenosinetriphosphatase［J］．Science，1990，250(4981):651－657．［8］HirataＲ，OhsumkY，NakanoA，etal．．Molecularstructureofagene，VMA1，encodingthecatalyticsubunitofH(+)-translocatingadenosinetriphosphatasefromvacuolarmembranesofSaccharomycescerevisiae［J］．J．Biol．Chem．，1990，265(12):6726－6733．［9］EvansTJ，XuMQ，PradhanS．Proteinsplicingelementsandplants:fromtransgenecontainmenttoproteinpurification［J］．Annu．Ｒev．PlantBiol．，2005，56::375－392．［10］WuH，HuZ，LiuXQ．Proteintrans-splicingbyasplitinteinencodedinasplitDnaEgeneofSynechocystissp．PCC6803［J］．Proc．Natl．AcadSci．USA，1998，95(16):9226－9231．［11］EvansTJ，MartinD，KollyＲ，etal．．Proteintrans-splicingandcyclizationbyanaturallysplitinteinfromthednaEgeneofSynechocystisspeciesPCC6803［J］．J．Biol．Chem．，2000，275(13):9091－9094．［12］VolkmannG，MootzHD．Ｒecentprogressininteinresearch:frommechanismtodirectedevolutionandapplications［J］．CellMol．LifeSci．，2020，70(7):1185－1206．。［13］CooperAA，ChenYJ，LindorferMA，etal．．ProteinsplicingoftheyeastTFP1interveningproteinsequence:amodelforself-excision［J］．EMBOJ．，1993，12(6):2575－2583．［14］MillsKV，LewBM，JiangS，etal．．ProteinsplicingintransbypurifiedN-andC-terminalfragmentsoftheMycobacteriumtuberculosisＲecAintein［J］．Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1998，95(7):3543－3548．［15］SunL，GhoshI，PaulusH，etal．．Proteintrans-splicingtoproduceherbicide-resistantacetolactatesynthase［J］．Appl．Environ．Microbiol．，2001，67(3):1025－1029．［16］XuMQ，SouthworthMW，MershaFB，etal．．Invitroproteinsplicingofpurifiedprecursorandtheidentificationofabranchedintermediate［J］．Cell，1993，75(7):1371－1377．。［17］PerlerFB，OlsenGJ，AdamE．Compilationandanalysisofinteinsequences［J］．NucleicAcidsＲes．，1997，25(6):1087－1093．［18］DuZ，ShemellaPT，LiuY，etal．．Highlyconservedhistidineplaysadualcatalyticroleinproteinsplicing:apKashiftmechanism［J］．J．Am．Chem．Soc．，2018，131(32):11581－11589．［19］ElleucheS，PoggelerS．Inteins，valuablegeneticelementsinmolecularbiologyandbiotechnology［J］．Appl．Microbiol．Biotechnol．，2018，87(2):479－489．［20］Vila-PerelloM，LiuZ，ShahNH，etal．．Streamlinedexpressedproteinligationusingsplitinteins［J］．J．Am．Chem．Soc．，2020，135(1):286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