分子生物學(xué)講座

分子生物學(xué)講座第1頁/共51頁個體提示器官、組織細(xì)胞動物細(xì)胞植物細(xì)胞第2頁/共51頁細(xì)胞核結(jié)構(gòu)第3頁/共51頁第一章核酸的結(jié)構(gòu)與功能

1868年，瑞士的內(nèi)科醫(yī)生FriedrichMiescher從外科醫(yī)院包扎傷口的繃帶上的膿細(xì)胞核中提取到一種富含磷元素的酸性化合物，將其稱為核質(zhì)(nuclein)；1872年他又從鮭魚精子中分離出類似的物質(zhì)，隨后有人在多種組織細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了這類物質(zhì)的存在。因為這類物質(zhì)都是從細(xì)胞核中提取出來的，而且都具有酸性，因此稱為核酸(nucleicacid)。第4頁/共51頁肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗第5頁/共51頁核酸是生物體內(nèi)的高分子化合物，包括DNA和RNA兩大類。一、元素組成組成核酸的元素有C、H、O、N、P等，與蛋白質(zhì)比較，其組成上有兩個特點：一是核酸一般不含元素S，二是核酸中P元素的含量較多并且恒定，約占9～10%。因此，核酸定量測定的經(jīng)典方法，是以測定P含量來代表核酸量。二、化學(xué)組成與基本單位核酸經(jīng)水解可得到很多核苷酸，因此核苷酸是核酸的基本單位。核酸就是由很多單核苷酸聚合形成的多聚核苷酸。核苷酸可被水解產(chǎn)生核苷和磷酸，核苷還可再進一步水解，產(chǎn)生戊糖和含氮堿基。第一節(jié)核酸的化學(xué)組成第6頁/共51頁核苷酸中的堿基均為含氮雜環(huán)化合物，它們分別屬于嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。核苷酸中的嘌呤堿(purine)主要是鳥嘌呤(guanine,G)和腺嘌呤(adenine,A)，嘧啶堿(pyrimidine)主要是胞嘧啶(cytosine,C)、尿嘧啶(uracil,U)和胸腺嘧啶(thymine,T)。DNA和RNA都含有鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)；胸腺嘧啶(T)一般而言只存在于DNA中，不存在于RNA中；而尿嘧啶(U)只存在于RNA中，不存在于DNA中。第7頁/共51頁第8頁/共51頁

嘌呤和嘧啶環(huán)中含有共軛雙鍵，對260nm左右波長的紫外光有較強的吸收。堿基的這一特性常被用來對堿基、核苷、核苷酸和核酸進行定性和定量分析。核酸中的戊糖有核糖(ribose)和脫氧核糖(deoxyribose)兩種，區(qū)別在于2`的C原子上。

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戊糖與嘧啶或嘌呤堿以糖苷鍵連接就稱為核苷，通常是戊糖的C1′與嘧啶堿的N1或嘌呤堿的N9相連接。

核苷中戊糖的羥基與磷酸以磷酸酯鍵連接而成為核苷酸。核苷酸大多數(shù)是核糖或脫氧核糖的C5′上羥基被磷酸酯化，形成5′核苷酸。核苷酸在5′進一步磷酸化即生成二磷酸核苷和三磷酸核苷。以核糖腺苷酸為例，除AMP外，還有二磷酸腺苷(ADP，adenosine5′－diphosphate)和三磷酸腺苷(ATP，adenosine5′-triphosphate)兩種形式第11頁/共51頁第12頁/共51頁第13頁/共51頁第二節(jié)DNA的一級結(jié)構(gòu)

概念是指DNA分子中核苷酸的排列順序。換句話說，即四種核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)按照一定的排列順序，通過磷酸二酯鍵連接形成的多核苷酸鏈。由于核苷酸之間的差異僅僅是堿基的不同，故又可稱為堿基順序。DNA順序（或序列）是這一概念的簡稱。第14頁/共51頁核苷酸之間的連接方式是：一個核苷酸的5′位磷酸與下一位核苷酸的3′-OH形成磷酸二酯鍵，構(gòu)成不分支的線性大分子，其中磷酸基和戊糖基構(gòu)成DNA鏈的骨架，可變部分是堿基排列順序。“寡核苷酸”的概念第15頁/共51頁第16頁/共51頁5`pTpCpAOH3`5`TCA3`TCA表示方法不斷簡化第17頁/共51頁第三節(jié)DNA的二級結(jié)構(gòu)

(一)DNA的二級結(jié)構(gòu)：雙螺旋結(jié)構(gòu)模型

1868年，Miescher已經(jīng)從膿細(xì)胞提取到核酸與蛋白質(zhì)的復(fù)合物，當(dāng)時稱為核質(zhì)(nuclein)。20世紀(jì)20年代，Levene研究了核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)并提出四核苷酸假說。40年代末，Avery,Hershey和Chase的實驗嚴(yán)密地證實了DNA就是遺傳物質(zhì)。50年代初，Chargaff應(yīng)用紫外分光光度法結(jié)合紙層析等簡單技術(shù)，對多種生物DNA作堿基定量分析，發(fā)現(xiàn)DNA堿基組成有如下規(guī)律。第18頁/共51頁(1)同一生物的不同組織的DNA堿基組成相同；(2)一種生物DNA堿基組成不隨生物體的年齡、營養(yǎng)狀態(tài)或者環(huán)境變化而改變(3)幾乎所有的DNA，其腺嘌呤摩爾含量與胸腺嘧啶摩爾含量相同A=T；鳥嘌呤摩爾含量與胞嘧啶摩爾含量相同G=C(4)不同生物來源的DNA堿基組成不同，表現(xiàn)在A＋T/G＋C比值的不同第19頁/共51頁1953年，Watson和Crick以立體化學(xué)原理為準(zhǔn)則，對Wilkins和Franklin的DNAX射線衍射分析結(jié)果加以研究，提出了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模式。主要內(nèi)容包括以下四點。第20頁/共51頁DNAX射線衍射結(jié)果第21頁/共51頁(1)兩股DNA鏈圍繞一假想的共同軸心形成一右手螺旋結(jié)構(gòu)，雙螺旋的螺距為3.4nm，直徑為2.0nm。(2)鏈的骨架由親水的脫氧核糖基團和磷酸基團構(gòu)成，位于雙螺旋的外側(cè)。(3)堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，嘌呤和嘧啶堿基彼此密切相近。一股鏈中的嘌呤與另一股鏈中嘧啶之間以氫鏈相連，稱為堿基互補配對或堿基配對；堿基對層間距離為0.34nm。堿基互補配對總是腺嘌呤與胸腺嘧啶之間(A=T)，形成兩個氫鍵；或者鳥嘌呤與胞嘧啶之間(G=C)，形成三個氫鍵。

(4)DNA雙螺旋中的兩股鏈走向是反向平行的，一股鏈?zhǔn)?′→3′走向，另一股鏈?zhǔn)?′→5′走向。兩股鏈之間在空間上形成一條大溝和一條小溝，這是蛋白質(zhì)識別DNA的堿基序列，與其發(fā)生相互作用的基礎(chǔ)。

第22頁/共51頁氫鍵第23頁/共51頁影響雙螺旋結(jié)構(gòu)的因素有四個1、氫鍵。例如，DNA溶液中加入了尿素和甲酰胺后，由于它們很容易和堿基之間形成氫鍵，從而減少堿基之間的形成氫鍵的機會。2、堿基堆積力，指同一條鏈中相鄰堿基之間非特異性的作用力，又叫疏水力，愛德華力。3、帶負(fù)電荷的磷酸集團的靜電排斥力。當(dāng)磷酸集團的負(fù)電荷被帶正電的離子中和后（加入鹽類），磷酸集團之間的排斥力被屏蔽。結(jié)構(gòu)就穩(wěn)定，否則，二個鏈會因為排斥而分開（在純凈的蒸餾水中DNA會變性）。4、堿基分子內(nèi)能。某些因素如加熱等使得分子內(nèi)能改變時，結(jié)構(gòu)會遭到破壞。第24頁/共51頁Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)屬于B型雙螺旋，它是以在生理鹽溶液中抽出的DNA纖維在92%相對濕度下進行X－射線衍射圖譜為依據(jù)進行推測的，這是DNA分子在水性環(huán)境和生理條件下最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

DNA結(jié)構(gòu)的多態(tài)性表現(xiàn)在除了穩(wěn)定的B型結(jié)構(gòu)外，還有A型、C型、D型、E型等不同的形式。總之，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)永遠(yuǎn)處于動態(tài)平衡中，DNA分子構(gòu)象的變化與糖基和堿基之間空間相對位置有關(guān)。(二)DNA結(jié)構(gòu)的多態(tài)性第25頁/共51頁1979年，Wang和Rich等人在研究人工合成的CGCGCG單晶的X-射線衍射圖譜時出人意料地發(fā)現(xiàn)這種六聚體的構(gòu)象與上面講到的完全不同。它是左手雙螺旋，與右手螺旋的不同是螺距延長(4.5nm左右)，直徑變窄(1.8nm)，每個螺旋含12個堿基對，分子長鏈中磷原子不是平滑延伸而是鋸齒形排列，有如“之”字形一樣，因此叫它Z構(gòu)象(英文字Zigzag的第一個字母)。第26頁/共51頁

人們相信，并用實驗證明了細(xì)胞DNA分子中確實存在有Z－DNA區(qū)。而且，細(xì)胞內(nèi)有一些因素可以促使B－DNA轉(zhuǎn)變?yōu)閆－DNA。有研究認(rèn)為這種構(gòu)像和甲基化現(xiàn)象有關(guān)系。第27頁/共51頁隨著科學(xué)的發(fā)展，人們認(rèn)識DNA的水平不斷提高。多年來，DNA結(jié)構(gòu)的研究手段主要是X射線衍射技術(shù)，其結(jié)果是通過間接觀測多個DNA分子有關(guān)結(jié)構(gòu)參數(shù)的平均值而獲得的。同時，這項技術(shù)的樣品分析條件使被測DNA分子與天然狀態(tài)相差甚遠(yuǎn)。因此，在反映DNA結(jié)構(gòu)真實性方面這種方法存在著缺陷。

1989年，應(yīng)用掃描隧道顯微鏡(scanningtummelingmicroscopy,STM)研究DNA結(jié)構(gòu)克服了上述技術(shù)的缺陷。這種先進的顯微技術(shù)，不僅可將被測物放大500萬倍，且能直接觀測接近天然條件下單個DNA分子的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。中國科學(xué)院的白春禮等就是利用這種技術(shù)發(fā)現(xiàn)了DNA的三辯式結(jié)構(gòu)。

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在DNA的一級結(jié)構(gòu)中，四種堿基遠(yuǎn)非均勻分布，盡管雙螺旋的構(gòu)型大體相同，但沿著DNA鏈各處的物理結(jié)構(gòu)不完全相同，各處雙螺旋的穩(wěn)定性也就顯示出差別，充分體現(xiàn)了DNA一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)的原理。其不均一性主要有1.反向重復(fù)序列(invertedrepeats)

又稱回文序列(palindrome)，通常是作為一種特別信號，如限制性內(nèi)切酶及調(diào)節(jié)蛋白的識別位點，轉(zhuǎn)錄終止信號等2.富含A/T的序列在很多有重要調(diào)節(jié)功能的DNA區(qū)段都富含AT，特別是在復(fù)制起點和啟動子的序列中，其對于復(fù)制和起始十分重要。因為A－T對只有二條氫鍵，易于解開，利于起始復(fù)合物的形成。(三)DNA結(jié)構(gòu)的不均一性(heterogeneity)第29頁/共51頁3.嘌呤和嘧啶的排列順序?qū)﹄p螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。前者的穩(wěn)定性遠(yuǎn)大于后者。氫鍵數(shù)目是相同的，差別在于相鄰堿基之間堆集力不同。即從嘌呤到嘧啶的方向的堿基堆集作用顯著大于同樣組成的嘧啶到嘌呤方向的堿基堆集作用。5`GC3`5`CG3`3`CG5`3`GC5`

和第30頁/共51頁1.DNA變性(denaturation)

指DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。變性時維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結(jié)構(gòu)的改變。凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子變性。(四)DNA的變性、復(fù)性與分子雜交

第31頁/共51頁溶液粘度降低。超螺旋結(jié)構(gòu)解旋，氫鍵斷裂。溶液旋光性發(fā)生改變增色效應(yīng)，指變性后DNA溶液對紫外吸收作用增強的效應(yīng)。DNA分子中堿基間電子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波長紫外光的特性。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基藏入內(nèi)側(cè)，變性時DNA雙螺旋解開，于是堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產(chǎn)生增色效應(yīng)。如濃度均為50ug/ml時，雙螺旋的A260=1.00；完全變性的A260=1.37；單核苷酸等比例混合物的A260=1.60變性DNA常發(fā)生一些理化及生物學(xué)性質(zhì)的改變第32頁/共51頁

對雙鏈DNA進行加熱變性，當(dāng)溫度升高到一定高度時，DNA溶液在260nm處的吸光度突然明顯上升至最高值，隨后即使溫度繼續(xù)升高，吸光度也不再明顯變化。若以溫度對DNA溶液的紫外吸光率作圖，得到的典型DNA變性曲線呈S型?？梢奃NA變性是在一個很窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的。通常將核酸加熱變性過程中，紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時的溫度稱為核酸的解鏈溫度，由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的融解相類似，又稱融（熔）解溫度(Tm,meltingtemperature)解鏈溫度（Tm值）的概念第33頁/共51頁第34頁/共51頁

在Tm時，核酸分子內(nèi)50%的雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞。特定核酸分子的Tm值與其G＋C所占總堿基數(shù)的百分比成正相關(guān)，兩者的關(guān)系可表示為：Tm=69.3＋0.41(%G+C)

此關(guān)系式成立的條件是：GC含量在30%-70%之間，溶液為0.15M的NaCl+0.015M的檸檬酸鈉。

一定條件下(相對較短的核酸分子)，Tm值大小還與核酸分子的長度有關(guān)，核酸分子越長，Tm值越大；另外，溶液的離子強度較低時，Tm值較低，融點范圍也較寬，反之亦然，因此DNA制劑不應(yīng)保存在離子強度過低的溶液中。第35頁/共51頁第36頁/共51頁

指變性DNA在適當(dāng)條件下，二條互補鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱之為退火(annealing)。復(fù)性的條件1、有足夠的鹽濃度來消除磷酸集團的靜電排斥力。2、足夠高的溫度來破壞氫鍵，但又不能太高。復(fù)性的機制隨機碰撞，成核作用，拉鏈作用。2.DNA復(fù)性(renaturation)第37頁/共51頁

（1）溫度和時間一般認(rèn)為比Tm低25℃左右的溫度是復(fù)性的最佳條件，越遠(yuǎn)離此溫度，復(fù)性速度就越慢。復(fù)性時溫度下降必須是一緩慢過程，若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下)，復(fù)性幾乎是不可能的(實驗室經(jīng)常用此方法使DNA保持單鏈或者叫變性狀態(tài))。（2）DNA濃度濃度高，碰撞的機會多，復(fù)性快。（3）DNA堿基順序的復(fù)雜性順序簡單，復(fù)性容易；反之亦反。注意：復(fù)性后大部分不是原配鏈。影響DNA復(fù)性的因素第38頁/共51頁3、應(yīng)用

分子雜交

PCR技術(shù)第39頁/共51頁分子雜交示意圖第40頁/共51頁PCR反應(yīng)示意圖第41頁/共51頁第四節(jié)DNA的三級結(jié)構(gòu)

(一)DNA超螺旋

雙螺旋DNA進一步扭曲盤繞則形成其三級結(jié)構(gòu)，超螺旋是DNA三級結(jié)構(gòu)的主要形式。自從1965年Vinograd等人發(fā)現(xiàn)多瘤病毒的環(huán)形DNA的超螺旋以來，現(xiàn)已知道絕大多數(shù)原核生物都是共價封閉環(huán)(covalentlyclosedcircle,CCC)分子，這種雙螺旋環(huán)狀分子再度螺旋化成為超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix或supercoil)。第42頁/共51頁原核生物的超螺旋結(jié)構(gòu)（PM2病毒）。有正超螺旋和負(fù)超螺旋之分。真核生物中，DNA與組蛋白八聚體形成核小體結(jié)構(gòu)時，存在著負(fù)超螺旋。第43頁/共51頁(二)染色質(zhì)和核小體1、染色質(zhì)(chromatin)

真核生物的染色體(chromasome)在細(xì)胞生活周期的大部分時間里都是以染色質(zhì)的形式存在的。染色質(zhì)是一種纖維狀結(jié)構(gòu)，叫做染色質(zhì)絲，它是由最基本的單位核小體(nucleosome)成串排列而成的。DNA是染色體的主要成分，約占染色體全部成分的30-40%，另