分子生物學(xué)第三章

分子生物學(xué)第三章第1頁/共30頁a)原核生物的復(fù)制基因與酶類

Initiatinggenes

dnaBprepriming300kd~20copies/cellhexamerRNApolprimaseforleadingS.dnaCactswithdnaB25kddnaGprimaseforlaggingS.60kd~25(Okazakifragment)monomer

SSB

BindingwithS.S.DNA74kd~300Preventsfromannealingmonomer第2頁/共30頁Elongatinggenes

dnaE

DNApolymeraseIII(α)140kd~20dnaZ

DNApolymeraseIII(β)52kd~20polADNApolymeraseI109kd~400polBDNApolymeraseII90-120kd~100第3頁/共30頁缺口酶活化(T4)(E.coli)缺口腺苷化封口連接dAMPTopoisomeraserep

Relaxedprotein(Helicase)D.S.DNA→S.S.DNAATPase1H-bond/2ATPligLigase

HDP

HelixDe-stabilizingProteinNoATPaseactivityBindingS.S.DNAdecreaseTmPreventsfromannealing第4頁/共30頁

b)DNA聚合酶（DNApolymerase）

PolApolBdnaEdnaZ

109kd120kd>250kd

monomer

klenowfragmentαα+EF-II

+Prokaryote

IIIIII

5’→3’elongation(dNMP)n+xdNTP→(dNMP)n+x+xppi

10dNt/sec1/10ofpolI500dNt/sec

(75,36)KornbergEββhetero-multimer第5頁/共30頁3’→5’editing

mismatch10-810-3yes

5’→3’exonuclease

smallfragmentrepairNoNo

whendNTPstarved

3’→5’pyro-phospholysis

(焦)yesyesyes

(dNMP)n+xppi→(dNMP)n-x+xdNTP

mutation

lethallethal

10-20mole./E.coli

IIIIII第6頁/共30頁b;primersite

c;primerterminater

a;templatesited;dNTPsitee;5’→3’repairsite

36kde胰酶75kdabcOHOHpppdppppppppppppOHOHOHDNApolymeraseI第7頁/共30頁DNApolymeraseIII

activableDNApolIII

DNApolIII(holoEnzyme)

(10subunits,seep665inMolecularbiology)α+α(dnaE)→DNApolIII(pureEnzyme)+EF-II

730nt/sec.

invitro1000nt/sec.Invivoβ+β(dnaZco-polIII)+第8頁/共30頁C)真核生物DNA復(fù)制的特點及聚合酶

●multiplereplicon

Prok.105bp/minEuk.500-5000bp/min13-900kb/perreplicon

●DNApolα+primase(50-60kd)

6-9NtRNAasprimer

例；果蠅5000replicons受精后genomereplication/3min

Replicons擴增到50,000第9頁/共30頁●DNApolymerase

α(主要酶類)βγ

Maxi.polMini.polNucleiNucleimt120-300kd30-50kd150-300kdpolymerize5’→3’yesyesediting3’→5’NoNoRNAprimerNoNoNoNoDNAprimer

2000-6000mole./cell第10頁/共30頁3.6DNA復(fù)制的調(diào)控

第11頁/共30頁Repressormodel

AntisenseRNAmodel

RNA-2Positivecontrol

0-5550

RNA-2

RnaseHOHDNA

/RNA

primerforDNAreplication

e.g.ColEIplasmid(15-20)Negativecontrol

RNA-2第12頁/共30頁RNA-1110bp

-555

-4450RNA-2RNA-1RNA-2

110bpD.S.RNARNaseHcan’trecognizeD.S.RNA-1/RNA-2,

can’tactivatetheformationofprimer’s

3’-OH第13頁/共30頁RNA-10

WhenRNA-2200-360Nt

Rom

geneexpression

RNA-1/RNA-2D.S.repression

RNA-1

/RNA-2

不能形成primer的

3’-OH促進

限制

63aaROP(Romprotein)

RNA-2

只能轉(zhuǎn)錄到100-220base,

不能到達“0”原點

不能形成primer

的3’-OH0第14頁/共30頁

ColEIplasmid(15-20copies)

Preventingoverreplicationmainlybynegativecontrol第15頁/共30頁因為RNA1與引物RNA分子的相互作用可逆，因此細胞內(nèi)RNA1的濃度決定了ColE1質(zhì)粒復(fù)制起始頻率。負因子rop蛋白能提高RNA1與引物前體的相互作用，從而增加了RNA1的負調(diào)控作用。

ColEIplasmid(15-20copies)

Preventingoverreplicationmainlybynegativecontrol第16頁/共30頁真核細胞DNA復(fù)制的調(diào)控真核生物細胞的生命周期：G(復(fù)制預(yù)備期)、S（復(fù)制期）、G2（有絲分裂準(zhǔn)備期）和M（有絲分裂期）。在三層水平調(diào)控：a

細胞生活周期水平調(diào)控，是停留在G1期還是進入S期。外部因子或細胞質(zhì)因子起誘導(dǎo)作用；b

染色體水平調(diào)控，不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一定順序進入S期，機理不明；c

復(fù)制子水平調(diào)控，決定復(fù)制起始與否。這一機制與原核生物細胞相似，包括轉(zhuǎn)錄激活、復(fù)制起始復(fù)合物的組裝和引物合成等的調(diào)控。第17頁/共30頁3.7Nucleosomereplication

組蛋白的合成在細胞核內(nèi)與DNA復(fù)制同步（現(xiàn)用現(xiàn)造，不積壓浪費）oldoctamer是否解離？組蛋白分子是否重新組裝成？Octamer的組裝是全保留？半保留？隨機？第18頁/共30頁Cellincubationin

C12,N14,H1

Yes!C14,N15,H31hr分離ν-body甲酸飽和的密度梯度離心+++……放射性帶第19頁/共30頁●Oldoctamer/newoctamer在DNA復(fù)制的雙鏈上的分布狀況（偏袒分布？隨機分布？相間分布？）cycloheximide(放線菌酮,蛋白質(zhì)合成起始抑制劑)生長的細胞（不重新啟動Histone合成）電鏡圖象第20頁/共30頁DNA復(fù)制時,Octamer不離開親本DNALeadingS.+oldLaggingS.+newNewold第21頁/共30頁3.8MethylationofDNA(m5CinEukaryote)

第22頁/共30頁m5C

a)DNA中m5C的特點

●對MspI,HpaII位點的高頻修飾

MspIHpaII

CmCGGCCmGG

+HNH

H4153

62OHNNCH3第23頁/共30頁●m5C的復(fù)制

●m5C的分布

含CG序列HpaIICCmGG;MspICmCGG

HhaIGCmGC;ThaICmGCmG

HeaGGCCm;PstICmTGCAG

（啟動甲基化酶）（去甲基化）(保持甲基化酶)

（識別半甲基化）CmGCmGGCGCmCmGGC

CGGC

CGGC

CmG

GC

第24頁/共30頁●Animal

70%ofCGseq.PlantCNGseq.ofNucleiDNA(mtDNA,cpDNAnom5C)●EukaryoteHighrepetitiveseq.frequentm5CStructuregenerarem5C

Clustergenefrequentm5C

Expressinggenerarem5C

Closedgenefrequentm5C

(inGCislandofpromoter)第25頁/共30頁b)Functionofm5C

細胞分化，組織特化，階段發(fā)育，組織培養(yǎng)過程的脫分化與m5C的相關(guān)性（5-氨胞苷去甲基化的作用）

m5C---甲基化是生物自我保護的機制

m5C

的不足基因表達相關(guān)

m5C的豐富基因關(guān)閉相關(guān)

m5C

的程度具有明顯的組織，細胞的特異性(時空性)

m5C-----使Z-DN