分子遺傳學(xué)的學(xué)習(xí)教案

分子遺傳學(xué)的學(xué)習(xí)教案第1頁/共91頁2

1957年Crick提出了中心法測(cè)(centraldogma)

DNA→RNA→蛋白質(zhì)

1970Crick又作了部分修改：

DNARNA蛋白質(zhì)第2頁/共91頁3

基因表達(dá)(geneexpression)是指儲(chǔ)存遺傳信息的基因經(jīng)過一系列步驟表現(xiàn)出其生物功能的整個(gè)過程。典型的基因表達(dá)是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的過程?！褶D(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，以dsDNA中的一條單鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板，以核糖核苷三磷酸（rNTP）為底物，在依賴DNA的RNA聚合酶（DNA-dependentRNApolynerase,DDRP）的作用下，按AU，CG配對(duì)的原則，合成RNA分子的過程。第一節(jié)

基本概念第3頁/共91頁信使的發(fā)現(xiàn)1955年Brachet用洋蔥根尖和變形蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：若加入RNA酶，則蛋白質(zhì)合成就停止；若再加入從酵母的RNA，又可合成蛋白質(zhì)。這表明什么？第4頁/共91頁同年Goldstein和Plaut同位素標(biāo)記變形蟲RNA前體：發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的RNA在核內(nèi)標(biāo)記追蹤實(shí)驗(yàn)：經(jīng)過一段時(shí)間發(fā)現(xiàn)被標(biāo)記的RNA在細(xì)胞質(zhì)中

此表明什么？第5頁/共91頁1956年E.Volkin和L.Astrachan：用同位素脈沖一追蹤標(biāo)記：表明T2噬菌體新合成的RNA的堿基比和T2的DNA堿基比相似，而和細(xì)菌的堿基比不同。由于T2感染細(xì)菌時(shí)注入的是DNA，而在細(xì)胞里合成的是RNA此表明什么？第6頁/共91頁最令人信服的證據(jù)是Hall.B.D和Spiegeman.SDNA-RNA的雜交實(shí)驗(yàn)：將T2噬菌體感染E.coli后產(chǎn)生的RNA分離出來，分別與T2和E.coli的DNA進(jìn)行分子雜交，結(jié)果這種RNA只能和T2的DNA形成“雜種”鏈，而不能和E.coli的DNA進(jìn)行雜交。第7頁/共91頁Jacob和Monod預(yù)言:（1）這種“信使”應(yīng)是一個(gè)多核苷酸；（2）其分子平均不小于5105bp，足以攜帶一個(gè)基因的遺傳信息；（3）它們至少是暫時(shí)連在核糖體上；（4）其堿基組成反映了DNA的序列；（5）它們能高速更新。

Jacob和Monod將它定名為:

信使RNA（MessengerRNA）或mRNA第8頁/共91頁

一、RNA合成的基本特點(diǎn)1960年Weiss,S,B等發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶（RNAPol）。幾乎存在于所有細(xì)胞中，其特點(diǎn)是：（1）以核糖核苷三磷酸（rNTP）為底物；（2）以DNA為模板；（3）按5′→3′方向合成；（4）無需引物的存在能單獨(dú)起始鏈的合成；（5）第一個(gè)引入的rNTP是以三磷酸形式存在；（6）在體內(nèi)DNA雙鏈中僅一條鏈作為模板；（7）RNA的序列和模板是互補(bǔ)的。第9頁/共91頁

二、RNA合成和DNA復(fù)制的區(qū)別（1）轉(zhuǎn)錄時(shí)只有一條DNA鏈為模板，而復(fù)制時(shí)兩條鏈都可作為模板；（2）轉(zhuǎn)錄時(shí)形成的DNA-RNA雜合雙鏈不穩(wěn)定，RNA

合成后釋放；而DNA復(fù)制叉形成后一直打開，新鏈和模板鏈形成聚合雙鏈；（3）RNA合成不需引物，而DNA復(fù)制需引物；（4）轉(zhuǎn)錄的底物是rNTP，復(fù)制的底物是dNTP；（5）兩者使用的聚合酶系不同。第10頁/共91頁

三、有義鏈和無義鏈1963J.Marmur和DotySpiegeman區(qū)分有義鏈，采用枯草桿菌的SP8噬菌體為材料；SP8DNA雙鏈有“輕”、“重”，差異明顯；現(xiàn)在將作為轉(zhuǎn)錄模板的DNA單鏈稱為模板鏈（templatestrand）或反義鏈（antisensestrand）；非模板鏈稱為有義鏈（sensestrand）或編碼鏈（codingstrand）；在體外DNA的兩條鏈都可作為RNA合成的模板。第11頁/共91頁第12頁/共91頁13●

模板單鏈DNA的極性方向?yàn)?’→5’,而非模板單鏈

DNA的極性方向與RNA鏈相同，均為5’→3’DNA(書寫DNA序列時(shí)，僅寫非模板序列，可不注明極性方向)3’----TACTCAT----5’RNA5’----AUGAGUA----3’5’---ATGAGTA----3’Non-template(sensestrand，編碼鏈，與mRNA序列相同的那條鏈)template(antisensestrand，指根據(jù)堿基互補(bǔ)原則指導(dǎo)mRNA生物合成的DNA鏈

)第13頁/共91頁用實(shí)驗(yàn)證實(shí)mRNA的合成總是延著5′-3′方向進(jìn)行的：E.coli在0C時(shí)需13秒鐘才能加上一個(gè)核苷酸，但在37C每秒就可加上40個(gè)核苷酸;利用這個(gè)差別以14C來標(biāo)記U,在0C培養(yǎng)E.coli，提取這種正在伸長的mRNA分子發(fā)現(xiàn)14C標(biāo)記首先出現(xiàn)在伸長的3′端

因此可以證明合成是延著5′-3′方向進(jìn)行的第14頁/共91頁●某一基因只以一條單鏈DNA為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄（不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄）

●RNA轉(zhuǎn)錄包括promotion,elongation,termination

三個(gè)過程

●從啟動(dòng)子（promoter）到終止子（terminator）稱為轉(zhuǎn)錄單位

（transcriptionalunit）

在DNA雙鏈上，一條鏈可轉(zhuǎn)錄，另一條鏈不轉(zhuǎn)錄模板鏈并非永遠(yuǎn)在一條單鏈上第15頁/共91頁●原核生物中的轉(zhuǎn)錄單位多為多順反子，有操縱子結(jié)構(gòu)；

●轉(zhuǎn)錄原點(diǎn)記為+1，其上游記為負(fù)值，下游記為正值

真核生物中的轉(zhuǎn)錄單位多為單順反子，無操縱子結(jié)構(gòu)；

upstreamstartpointdownstream

啟動(dòng)子：指DNA分子上被RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合形成起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的區(qū)域。

終止子：在轉(zhuǎn)錄過程中，提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列第16頁/共91頁研究轉(zhuǎn)錄涉及到兩個(gè)方面：其一是RNA合成的酶學(xué)反應(yīng)；其二是RNA合成的起始、延伸、終止和釋放各階段；

第二節(jié)原核生物的轉(zhuǎn)錄第17頁/共91頁

大腸桿菌的RNA聚合酶是目前了解最詳細(xì)的RNA聚合酶在一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中，大約有7000個(gè)RNA聚合酶分子，其中有2000－5000個(gè)酶分子在參與RNA的合成RNA聚合酶合成RNA的速度：37℃約40個(gè)核苷酸/秒

RNApol和DNApol有兩點(diǎn)不同：（1）RNApol沒有任何校對(duì)功能；（2）在不需要引物的前提下能起始合成新的RNA鏈。一．大腸桿菌的RNA聚合酶第18頁/共91頁大腸桿菌RNA聚合酶βααβ’CoreEnzyme核心酶HoloEnzyme全酶480kDaforelongationforinitiation依靠靜電作用力依靠空間結(jié)構(gòu)非專一性與DNA結(jié)合專一性與

DNA結(jié)合半衰期；1h半衰期；數(shù)小時(shí)cover60bp

βα

αβ’全酶中的σ亞基與其他亞基結(jié)合較松弛，常易從全酶上解離σ亞基的功能是識(shí)別和結(jié)合啟動(dòng)子的保守區(qū)，介導(dǎo)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合。此外，新發(fā)現(xiàn)的一種ω亞基的功能尚不清楚。第19頁/共91頁E.coliRNAPolymerase用于延伸用于起始36.5KD36.5KD151KD155KD11KD70KD第20頁/共91頁21因子★可重復(fù)使用(Reusable)

★使全酶識(shí)別SextamaBox(－35區(qū)R位點(diǎn))，并通過與模板鏈結(jié)合★修飾RNAPol構(gòu)型降低全酶與DNA的非專一性結(jié)合力（107/mol）

增強(qiáng)全酶與R,Bsite（-10區(qū)）的專一性結(jié)合力

(1014/mol)★啟動(dòng)因子

R位點(diǎn)-Sextama框，松弛結(jié)合位點(diǎn)B位點(diǎn)-Pribnow框(-10區(qū))，緊密結(jié)合位點(diǎn)第21頁/共91頁

因子（蛋白）包含一個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，可以嵌入DNA大溝，并通過氫鍵與DNA緊密結(jié)合。第22頁/共91頁23

?轉(zhuǎn)錄開始后，亞基脫離聚合酶，以后僅由核心酶催化RNA鏈的延長，否則RNA鏈的延伸緩慢不同的σ因子識(shí)別不同的啟動(dòng)子

E.coli中有四種σ因子（σ70、σ32、σ54、σ28）枯草桿菌中有11種σ因子（通過σ因子的更替對(duì)轉(zhuǎn)錄起始進(jìn)行調(diào)控）第23頁/共91頁

枯草桿菌至少有10種因子：A，B，C，D，H，L：識(shí)別營養(yǎng)生長期表達(dá)的基因的啟動(dòng)子E，F(xiàn)，G，K：識(shí)別孢子形成期表達(dá)的基因的啟動(dòng)子第24頁/共91頁25因子★促使RNAPol與DNA模板鏈結(jié)合

★位于前端的因子使雙鏈解鏈為單鏈

★位于尾端的因子使單鏈重新聚合為雙鏈

★核心酶的組建因子

+→2

+β→+β’

第25頁/共91頁26β因子；★促進(jìn)RNA聚合酶+NTP→使RNA鏈延長

★完成NMP之間的磷酸二酯鍵的連接

★Editing（校正）

★與終止蛋白R(shí)ho(ρ)因子競爭RNA3’-end，決定轉(zhuǎn)錄是否終止

★構(gòu)成HoloEnzyme后，β因子含有

兩個(gè)位點(diǎn)Isite(RifS):Esite(RifR):要求高濃度的ATPorGTP專一性地結(jié)合ATPorGTP對(duì)

NTP非專一性結(jié)合第26頁/共91頁27β’

因子★強(qiáng)堿性亞基★與非模板鏈（sensestrand）結(jié)合（充當(dāng)SSB）

★受K酶抑制（K酶與終止有關(guān)，K酶結(jié)合后RNAPol從DNA上脫離，轉(zhuǎn)錄終止）第27頁/共91頁28全酶含有五個(gè)功能位點(diǎn)

★sensestrandDNAbindingpoint(β’)

★DNA/RNA雜合位點(diǎn)hybridsite(β)

★dsDNA解鏈位點(diǎn)unwindingpoint(α)

★dsDNA再纏繞位點(diǎn)rewindingpoint(α)

★

factorpoint

第28頁/共91頁原核生物RNAPol(Core)的結(jié)構(gòu)與功能EnzymeMovementDNAcodingstrand(β’)Rewindingpoint(α)Unwindingpoint(α)RNAbindingsiteRNA/DNAhybrid(β)DNAtemplatestrandHoloEnzyme使

DNA形成10-17bp的解鏈區(qū)

第29頁/共91頁第30頁/共91頁RNApol執(zhí)行的功能識(shí)別DNA雙鏈上的啟動(dòng)子（promoter）；使DNA變性，在啟動(dòng)子處解旋成單鏈；通過閱讀啟動(dòng)子序列，RNApol確定它自己的轉(zhuǎn)錄方向和模板鏈；最后當(dāng)它達(dá)到終止子時(shí)，通過識(shí)別終止序列停止轉(zhuǎn)錄。

第31頁/共91頁

二、轉(zhuǎn)錄的起始與延伸(一)啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能啟動(dòng)子（promoter）：是指DNA分子上被RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合形成起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的區(qū)域，它還包括一些調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)因子的結(jié)合位點(diǎn)。位于基因5′端的調(diào)控區(qū)域，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的起始。啟動(dòng)子是控制轉(zhuǎn)錄起始的序列，并決定某一基因的表達(dá)強(qiáng)度；與RNA聚合酶親和力高的啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄起始頻率和效率均高；啟動(dòng)子的DNA序列有其獨(dú)特的特點(diǎn)，原核生物和真核生物的啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu)上有一定差異。第32頁/共91頁第33頁/共91頁34promoter由兩個(gè)重要部分組成

(擴(kuò)展的啟動(dòng)子)●上游部分—CAP-cAMP結(jié)合位點(diǎn)-70~-40●下游部分—RNAPol的進(jìn)入（結(jié)合）位點(diǎn)-35~-10+1基因表達(dá)調(diào)控的正控制位點(diǎn)CAP;CatabolitegeneActivatorProteincAMPAcceptorProtein(環(huán)化AMP受體蛋白)(降解物基因激活蛋白)

上游控制因子UCE,upstreamcontrolelement核心啟動(dòng)子，corepromoter第34頁/共91頁CAP-cAMPbindingsite

●

siteI+

CAP-cAMP●

siteI;IR是CAP-cAMP

的強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)（-70~-50）●

siteII;

CAP-cAMP

的弱結(jié)合位點(diǎn)（-50~-40）cooperativeeffect提高siteII的結(jié)合效率IR-70

siteI-40siteII

IR

-501.上游控制因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)第35頁/共91頁SiteII+CAP-cAMP

復(fù)合體促使SextamaBox附近GC島區(qū)的雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，PribnowBox的解鏈溫度降低，利于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)

SiteIsiteIIGCIslandSextamaPribnow

●NullsiteII→RNAPopribnowboxtranscriptionoff

●siteII+CAP-AMP

promotionRNAPoSextamaBoxintoPribnowBoxstartingtranscriptionRNAPol第36頁/共91頁37第37頁/共91頁(1)結(jié)構(gòu)典型,都含識(shí)別（R，即-35區(qū)),結(jié)合（B，即-10區(qū))和起始（I，+1）位點(diǎn);(2)序列保守;如-35和-10序列結(jié)構(gòu)；(3)位置和距離都比較恒定；(4)直接和多聚酶相結(jié)合；(5)位于基因的上游；(6)決定轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)和方向；(7)常和鄰近基因共同組成操縱子（operon），這也是原

核生物的特性。2.核心啟動(dòng)子序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：第38頁/共91頁

典型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)

-35區(qū)-10區(qū)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)+1TTGACA16-19bpTATAAT5-9bp第39頁/共91頁40-35區(qū)（Sextama框）

是RNAPol的松弛（初始）結(jié)合位點(diǎn)因子可以識(shí)別該位點(diǎn)，所以稱作recognitionsite(Rsite)

保守序列為TTGACA，每個(gè)堿基的出現(xiàn)頻率不同，又可寫為T82T84G78A65C54A45功能是:

（1）為RNApol的識(shí)別位點(diǎn)。σ亞基識(shí)別-35序列，為轉(zhuǎn)錄選擇模板，很大程度上決定了啟動(dòng)子的強(qiáng)度；（2）-35和-10序列的距離是穩(wěn)定的，此與RNApol的結(jié)構(gòu)有關(guān)。位置在啟動(dòng)子中略有變動(dòng)第40頁/共91頁

-10區(qū)（Pribnow框）-10序列是由Pribnow和Schaller（1975）發(fā)現(xiàn)，故稱為Pribnow框（Pribnowbox），它位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游約-10bp處，是RNApol的牢固結(jié)合位點(diǎn)bindingsite(Bsite)。保守序列為TATAAT，每個(gè)堿基的出現(xiàn)頻率不同，又可寫為T80A95T45A60A50T96;位置范圍-4到-13，AT較豐富，易于解鏈。其功能是：

(1)RNApol緊密結(jié)合位點(diǎn);(2)在此形成開放啟動(dòng)子復(fù)合體；

(3)使RNApol定向轉(zhuǎn)錄。第41頁/共91頁-10序列的堿基組成對(duì)轉(zhuǎn)錄的效率影響很大，發(fā)生此區(qū)域的某些突變會(huì)導(dǎo)致如下結(jié)果：

減效突變：TATAAT→AATAAT，轉(zhuǎn)錄效率會(huì)下降，即稱減效突變（downmutation）。增效突變：TATGTT→TATATT，則轉(zhuǎn)錄效率會(huì)上升，即稱增效突變（upmutation）。前者可能由于T-A的堆集能要小于A-T的堆積能，后者可能是由于堆集能降低和氫鍵的減少。第42頁/共91頁轉(zhuǎn)錄開始時(shí)模板上的第一個(gè)堿基為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；在原核生物中90%以上為A或G；位置固定，常見序列是CAT。

轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（initiationsite）：+1位點(diǎn)第43頁/共91頁44l

SextamaBox與PribnowBox間距17bp,

有利于RNAPol啟動(dòng)l

SextamaBoxorPribnowBoxmut.

間距趨近于17bp，upmutation間距遠(yuǎn)離于17bp，downmutation17bp的間距較17bp的序列對(duì)轉(zhuǎn)錄更為重要SextamaBoxandPribnowBoxmut.→

轉(zhuǎn)錄率下降100X→

轉(zhuǎn)錄率下降1000X第44頁/共91頁*-35和-10都是大致位點(diǎn)第45頁/共91頁46第46頁/共91頁47因子起著識(shí)別啟動(dòng)子的作用；在菌體細(xì)胞中，只有很少的RNA聚合酶分子（核心酶）呈游離狀態(tài)，大部分與DNA分子結(jié)合存在。這種結(jié)合為松弛型結(jié)合，形成松弛型復(fù)合物，并且核心酶對(duì)啟動(dòng)子無特殊的親和力；全酶形成后，對(duì)啟動(dòng)子的親和力大大提高，轉(zhuǎn)錄酶沿DNA滑行至啟動(dòng)子，由因子識(shí)別并緊密結(jié)合，形成緊密閉合型復(fù)合物；（二）轉(zhuǎn)錄的起始第47頁/共91頁48全酶在很長的基因組中（大腸桿菌4.2×106bp）尋找到約60bp的啟動(dòng)子是一個(gè)復(fù)雜的過程；RNA聚合酶沿DNA滑行至啟動(dòng)子，由因子識(shí)別并緊密與啟動(dòng)子-35序列結(jié)合后，與DNA形成封閉型啟動(dòng)子-酶二元復(fù)合物（closedbinarycomplex）；與－10區(qū)左右的DNA發(fā)生熔解，

在TATAAT盒處解鏈，形成12～17bp的單鏈區(qū)，形成開放型啟動(dòng)子二元復(fù)合物；此時(shí)RNA聚合酶大約與75bp的DNA（－55～＋20）相互接觸；第48頁/共91頁49

在開放型啟動(dòng)子起始復(fù)合物中，RNA聚合酶移動(dòng)到轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)I，酶上的起始位點(diǎn)和延伸位點(diǎn)被相應(yīng)的核苷酸占據(jù)，在亞基的催化下形成第一個(gè)磷酸二酯鍵，從而形成酶-啟動(dòng)子-rNTP三元復(fù)合體（ternarycomplex）

轉(zhuǎn)錄開始，當(dāng)RNA合成至長約9核苷酸時(shí)，因子解離下來，形成延伸復(fù)合物，此時(shí)核心酶約與55bp（－35～＋20）的DNA相互接觸。第49頁/共91頁50第50頁/共91頁第51頁/共91頁第52頁/共91頁第53頁/共91頁（三）RNA的合成延伸在酶分子上有兩個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，一是

起始位點(diǎn)，一是延伸位點(diǎn)；當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)都與模板互補(bǔ)的核苷酸結(jié)合后，第一磷酸二酯鍵才能形成；隨著RNA聚合酶沿著模板鏈的滑動(dòng)，由β亞基催化合成RNA鏈；延伸方向?yàn)?′-3′。第54頁/共91頁轉(zhuǎn)錄過程

轉(zhuǎn)錄酶沿編碼鏈53方向移動(dòng)，開放復(fù)合體（保持約17bp長）隨之前移，RNA鏈以53方向合成延伸，速度約為43核苷酸/秒。第55頁/共91頁第56頁/共91頁

三、轉(zhuǎn)錄的終止在開放復(fù)合體中，RNA與DNA的氫鍵結(jié)合能夠防止轉(zhuǎn)錄酶脫離DNA。當(dāng)RNA-DNA雜交區(qū)被迫分離時(shí)，則轉(zhuǎn)錄酶和RNA均脫離DNA，轉(zhuǎn)錄結(jié)束。

終止子（terminator,t）：在轉(zhuǎn)錄過程中，提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的序列，按終止方式不同分為強(qiáng)終止子和弱終止子。強(qiáng)終止子：內(nèi)部終止子（intrinsicterminators）

或稱自發(fā)終止；弱終止子：需要ρ因子（rhofactor）又稱為

ρ依賴性終止子（rho-dependentterminator）。第57頁/共91頁自發(fā)終止在RNA鏈中需要兩種序列元件：位于RNA3末端的富含U的序列，即U串；靠近RNA3末端的自互補(bǔ)序列（即回文序列），可形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。

莖-環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄酶停止合成RNA。接著由于U-A間氫鍵較弱，故而RNA自行脫離DNA，從而終止轉(zhuǎn)錄。第58頁/共91頁

強(qiáng)終止子的結(jié)構(gòu)

…NNAAGCGCCGNNNCCGGCGCTTTTTTNNN…

…NNTTCGCGGCNNNGGCCGCGAAAAAANNN…

DNA

…NNAAGCGCCGNNNCCGGCGCUUUUUUNNN…RNA第59頁/共91頁NNN

NNG·CC·GC·GG·CC·GG·CC·U…NNNNC·UUUUU…-OH3’mRNA

強(qiáng)終止子結(jié)構(gòu)的模式圖

發(fā)夾結(jié)構(gòu)第60頁/共91頁強(qiáng)終止子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：(1)有回文結(jié)構(gòu)存在；(2)莖的區(qū)域內(nèi)富含G-C；(3)強(qiáng)終止子3′端上有連續(xù)6個(gè)U。終止機(jī)制：*終止作用發(fā)生在RNA水平上,形成的頸環(huán)空間結(jié)構(gòu)阻止了轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行,同時(shí)3′端上連續(xù)6個(gè)U使RNA易解離,脫離DNA模板,于是整個(gè)mRNA釋放出來,轉(zhuǎn)錄停止。第61頁/共91頁第62頁/共91頁依賴于因子的終止大腸桿菌中的因子為堿性蛋白，分子量為46kDa，有解旋酶功能。因子識(shí)別RNA上的rut位點(diǎn)，與之結(jié)合，然后向轉(zhuǎn)錄酶移動(dòng)。當(dāng)轉(zhuǎn)錄酶到達(dá)終止序列時(shí)，則停止合成RNA，于是因子趕上轉(zhuǎn)錄酶，使RNA-DNA雜交鏈解開，從而RNA和轉(zhuǎn)錄酶脫離，轉(zhuǎn)錄結(jié)束。第63頁/共91頁含有IR序列，也能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；C的含量多，G的含量少；缺少U串；

*RNA聚合酶在此處暫停，若加入ρ因子，則使轉(zhuǎn)錄停止在特定的終止位點(diǎn)。

ρ依賴性終止子結(jié)構(gòu)與終止機(jī)制第64頁/共91頁*ρ因子可識(shí)別終止位點(diǎn)上游50～90bp的區(qū)域，該區(qū)域RNA分子中C的

含量高，G的含量少。第65頁/共91頁

RNAPol轉(zhuǎn)錄DNAρ因子附著到RNA

識(shí)別位點(diǎn)上

ρ因子跟在RNAPol

后沿RNA移動(dòng)

RNAPol在終止位點(diǎn)停下，并被ρ因子追上在轉(zhuǎn)錄泡中ρ因子使DNA-RNA雜種雙鏈解開轉(zhuǎn)錄終止,釋放出

RNAPol,ρ子和RNA第66頁/共91頁

野生型突變型核糖體結(jié)合到mRNA上核糖體阻礙核糖體在突了ρ因子的變位點(diǎn)解離附著和移動(dòng)

ρ因子附著ρ因子和RNA

核糖體阻礙聚合酶接觸

ρ因子移動(dòng)轉(zhuǎn)錄繼續(xù)轉(zhuǎn)錄提前終止第67頁/共91頁

第三節(jié)真核生物的轉(zhuǎn)錄

真核生物的轉(zhuǎn)錄和原核轉(zhuǎn)錄的不同點(diǎn)：原核只有一種RNA聚合酶，而真核細(xì)胞有三種聚合酶；啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有所不同，原核生物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)類似，真核有三種不同的啟動(dòng)子和有關(guān)的元件，分別對(duì)應(yīng)不同的RNA聚合酶；真核的轉(zhuǎn)錄有很多蛋白質(zhì)因子的介入。第68頁/共91頁

表12-2真核生物的三種RNA聚合酶的特點(diǎn) RNAPol 位置 產(chǎn)物 相對(duì)活性對(duì)α-鵝膏蕈的敏 PolⅠ 核仁 28s,18s,5.8srRNAs50～70%不敏感 PolⅡ 核質(zhì) hnRNA,mRNA,某些SnRNA20～40% 高度敏感 PolⅢ 核質(zhì) tRNA,5SrRNA,某些SnRNAs～10%片段特異，中等敏感

表12-3轉(zhuǎn)錄的抑制劑 抑制劑 靶酶 抑制作用 利福霉素 細(xì)菌全酶 和β亞基結(jié)合，抑制起始 鏈霉溶菌素 細(xì)菌核心酶 和β亞基結(jié)合，抑制起始 放射線素D 真核PolⅠ 和DNA結(jié)合，阻止延伸

α-鵝膏蕈 真核PolⅡ 和RNAPolⅡ結(jié)合

一、真核的RNA聚合酶第69頁/共91頁

真核生物有三種轉(zhuǎn)錄酶：轉(zhuǎn)錄酶I：轉(zhuǎn)錄rRNA（5SrRNA除外）轉(zhuǎn)錄酶II：轉(zhuǎn)錄所有mRNA及某些snRNA轉(zhuǎn)錄酶III：轉(zhuǎn)錄所有tRNA及5SrRNA和幾種小分子RNA

三種轉(zhuǎn)錄酶都含有約10個(gè)亞基，其中2個(gè)大亞基與細(xì)菌轉(zhuǎn)錄酶的和亞基相似，起催化RNA合成的作用。真核生物轉(zhuǎn)錄酶全酶不包括轉(zhuǎn)錄因子，但須有轉(zhuǎn)錄因子才能起始轉(zhuǎn)錄。第70頁/共91頁二、啟動(dòng)子

真核生物的三種轉(zhuǎn)錄酶對(duì)應(yīng)有三種啟動(dòng)子，它們通常包含一個(gè)核心啟動(dòng)子和一些調(diào)控元件。第71頁/共91頁轉(zhuǎn)錄酶I的啟動(dòng)子不同生物的轉(zhuǎn)錄酶I啟動(dòng)子沒有序列同源性，但位置相對(duì)一致。

45SrRNA是串聯(lián)重復(fù)的冗余基因（18S+5.8S+28S），在基因內(nèi)和間隔區(qū)都有啟動(dòng)子，因此可以轉(zhuǎn)錄出兩種產(chǎn)物。第72頁/共91頁轉(zhuǎn)錄酶II的啟動(dòng)子起始區(qū)中轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)通常為A，其上游為2個(gè)嘧啶及C，下游為5個(gè)嘧啶；TATA盒負(fù)責(zé)精確定位轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)。

GC盒（GGGCGG）和CAAT盒（GGCCAATCT）為轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)，將轉(zhuǎn)錄酶吸引到啟動(dòng)子附近，其數(shù)量和位置因基因不同可有很大變化。第73頁/共91頁轉(zhuǎn)錄酶III的啟動(dòng)子

A、B、C盒皆為長約10bp的序列，協(xié)助轉(zhuǎn)錄酶III與DNA結(jié)合。第74頁/共91頁三、轉(zhuǎn)錄因子在真核生物中已發(fā)現(xiàn)一些通用的轉(zhuǎn)錄因子：

轉(zhuǎn)錄酶I的轉(zhuǎn)錄因子上游結(jié)合因子（UBF）SL1因子：由TATA結(jié)合蛋白（TBP）和TATA結(jié)合蛋白聯(lián)結(jié)因子（TAF）組成第75頁/共91頁

轉(zhuǎn)錄酶II的轉(zhuǎn)錄因子已知作用于TATA盒的轉(zhuǎn)錄因子II主要有6種，

從酵母到人類均是保守的：

TFIIA：使TFIID與TATA盒結(jié)合更緊密，故非必需。

TFIIB：將轉(zhuǎn)錄酶II引進(jìn)起始復(fù)合體。

TFIID：識(shí)別TATA盒，主要成分是TBP和TAF。

TFIIE：促進(jìn)TFIIH激酶活性，反控其的解旋酶活性。

TFIIF：促進(jìn)轉(zhuǎn)錄酶II進(jìn)入起始復(fù)合體，與轉(zhuǎn)錄酶II結(jié)合后有解旋酶活性，為開放復(fù)合體形成所必需。

TFIIH：對(duì)由閉合復(fù)合體轉(zhuǎn)向開放復(fù)合體起作用，使轉(zhuǎn)錄酶II脫離起始復(fù)合體，進(jìn)入延伸狀態(tài)。第76頁/共91頁

轉(zhuǎn)錄酶III的轉(zhuǎn)錄因子已知轉(zhuǎn)錄因子III有3種：

TFIIIA：識(shí)別BoxA和BoxC，啟動(dòng)5SrRNA的轉(zhuǎn)錄。

TFIIIC：識(shí)別BoxA和BoxB，啟動(dòng)tRNA的轉(zhuǎn)錄。

TFIIIB：含有TBP，與TFIIIA-5SrDNA復(fù)合體及TFIIIC-tDNA復(fù)合體發(fā)生作用，然后使轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游的DNA彎曲，將轉(zhuǎn)錄酶III定位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，激活轉(zhuǎn)錄。第77頁/共91頁TBP在轉(zhuǎn)錄起始中的作用I類TAFI類起始因子+轉(zhuǎn)錄酶II類轉(zhuǎn)錄

SL1復(fù)合體rRNAII類TAFII類起始因子+轉(zhuǎn)錄酶IIII類轉(zhuǎn)錄TBPTFIID復(fù)合體mRNAIII類TAFIII類起始因子+轉(zhuǎn)錄酶IIIIII類轉(zhuǎn)錄

TFIIIB復(fù)合體tRNA第78頁/共91頁真核生物細(xì)胞中有三種轉(zhuǎn)錄方式，分別由三種RNA聚合酶（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）催化，與之相對(duì)應(yīng)有三種啟動(dòng)子：RNA聚合酶Ⅰ啟動(dòng)子------Ⅰ類基因RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子------Ⅱ類基因RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子------Ⅲ類基因重點(diǎn)介紹RNA聚合酶Ⅱ催化的mRNA的轉(zhuǎn)錄四、真核生物轉(zhuǎn)錄的起始第79頁/共91頁

1.RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子

啟動(dòng)子Ⅱ最為復(fù)雜，它和原核的啟動(dòng)子有很多不同：（1）有多種元件：TATA框，GC框，CAAT框等；（2）結(jié)構(gòu)不恒定；（3）它們的位置、序列、距離和方向都不完全相同；（4）有的存在遠(yuǎn)距離的調(diào)控元件，如增強(qiáng)子；（5）這些元件常常起到控制轉(zhuǎn)錄效率和選擇起始位點(diǎn)的作用；（6）不直接和RNApol結(jié)合；

(7)需多種轉(zhuǎn)錄因子介入。第80頁/共91頁

Ⅱ類基因的啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)TATA框：轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-30處，又稱Hogness框。核心元件起始子（initiator，Inr）：一般由Py2CAPy5構(gòu)成，

位于-3～+5，可能提供RNApolⅡ識(shí)別。

CAATbox：轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-75處。Ⅱ類啟動(dòng)子上游元件組成

GCbox：轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-90處。

增強(qiáng)子（enhancer）遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)減弱子（dehancer）靜息子（sisencer）上游激活序列（upstreamactivatingseguencesUASs）

第81頁/共91頁

起始子（initiator，Inr）起始點(diǎn)一般沒有同源序列;mRNA的第一個(gè)堿基傾向A，包括A在內(nèi)的兩側(cè)翼由Py組成稱為起始子（initiator,Inr)。在原核CAT起始序列也有這種情況）;一般由Py2CAPy5構(gòu)成;位于－3～+5處；提供RNApolⅡ識(shí)別；無論TATA是否存在，Inr起始子的強(qiáng)度和起始位點(diǎn)的選擇都很重要；現(xiàn)已純化了Inr結(jié)合蛋白。第82頁/共91頁TATAboxTATA