ω-3多不飽和脂肪酸對樹突狀細胞成熟及其細胞內(nèi)信號傳導通路的影響

國家自然科學基金申請書PAGE7 第2頁版本1.005.544 申請代碼：受理部門：收件日期：受理編號：國家自然科學基金您現(xiàn)在不能檢查保護文檔或打印文檔，請根據(jù)以下三個步驟操作：1)如果您是Word2000或以上版本用戶，請把Word宏的安全性設為:"中"您現(xiàn)在不能檢查保護文檔或打印文檔，請根據(jù)以下三個步驟操作：1)如果您是Word2000或以上版本用戶，請把Word宏的安全性設為:"中"方法:Word菜單->工具->宏->安全性->安全級,設置為"中"(如果您是Word97用戶，繼續(xù)執(zhí)行以下步驟)2)關閉本文檔，重新打開本文檔3)點擊"啟用宏"按鈕，即可開始填寫本文檔或打印了資助類別：亞類說明：附注說明：項目名稱：申請者：電話：依托單位：通訊地址：郵政編碼：單位電話：電子郵件：申報日期：200FORMTEXT4年FORMTEXT3月FORMTEXT12日國家自然科學基金委員會國家自然科學基金申請書 報告正文（一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-8000字）：項目的立項依據(jù)（附主要的參考文獻目錄）。移植排斥反應是目前器官移植領域所面臨的一大難題,誘導移植耐受是人們在器官移植中的追求目標。近年來,隨著移植免疫反應機制研究的逐步深入,人們發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞（Dendriticcells,DCs）的成熟狀態(tài)是機體誘導移植排斥反應或是誘導移植耐受的關鍵環(huán)節(jié)[1]。樹突狀細胞是機體的專職抗原提成細胞，其在外周組織遭遇供體器官來源的抗原后，將其吞噬并提呈于細胞表面，并通過引流淋巴管移行至次級淋巴組織。同時，在炎癥因子或內(nèi)毒素LPS等因素的作用下，樹突狀細胞逐漸成熟并高表達MHC分子和共刺激分子CD40、CD80、CD86等，成熟樹突狀細胞通過MHC分子及共刺激分子分別向T細胞提供第一信號和第二信號,并通過IL-12的分泌共同導致抗原特異性初始型Th細胞的激活,并發(fā)育為效應性T細胞及記憶性T細胞。由此,淋巴結內(nèi)抗原特異性初始型T細胞,可以不需要直接與抗原物質(zhì)接觸,就被抗原特異性致敏。大量研究發(fā)現(xiàn)，采用非成熟DCs—即阻斷DCs共刺激信號的表達及IL-12的分泌，可以特異性誘導受體T細胞失活或無能，進而誘導對移植物的免疫耐受[2，3]。因此，尋求各種方法阻斷DCs的成熟已成為誘導T細胞無能和免疫耐受的有效途徑之一。ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3polyunsaturatedfattyacids,ω-3PUFAs）是人體的必需脂肪酸之一，主要包含二十碳五烯酸(eicosapetaenoicacid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaeoic，DHA),魚油中富含EPA和DHA。在臨床實踐中人們發(fā)現(xiàn)，ω-3多不飽和脂肪酸作為人體的營養(yǎng)物質(zhì)，不但可以在體內(nèi)氧化供能，而且對類風濕性關節(jié)炎，潰瘍性結腸炎等多種自體免疫性疾病具有一定的治療作用，可以緩解上述疾病的病程進展[4]。提示其可能與自體免疫反應的抑制有關。進一步的研究證實，ω-3PUFAs可以在體內(nèi)，體外對T細胞淋巴細胞產(chǎn)生明顯抑制作用。ω-3多不飽和脂肪酸可以降低T細胞IL-2的分泌水平，抑制絲分裂素誘導的T細胞增殖和抗原特異性的遲發(fā)型過敏性反應[5，6]，ω-3PUFAs融入到脂質(zhì)雙分子層，可以顯著改變T淋巴細胞的細胞膜脂質(zhì)的磷脂的組成，影響細胞膜的流動性，并發(fā)現(xiàn)這一結構上的改變可能是導致細胞內(nèi)信號傳導途徑變化的原因[7]。以上結果提示ω-3PUFAs是調(diào)節(jié)機體免疫功能的一種重要因子，有可能在抗免疫排斥反應中具有很大的應用潛能。ω-3PUFAs對樹突狀細胞成熟及功能的確切影響目前還沒有明確的結論。鑒于ω-3PUFAs對T淋巴細胞功能的抑制及細胞膜脂質(zhì)結構的影響，我們因此提出如下假設：ω-3PUFAs對樹突狀細胞的成熟及功能也可能具有潛在的抑制作用,并且這種抑制作用與ω-3PUFAs對樹突狀細胞的成熟過程中信號傳導通路的干預有關。細胞的一切生命活動都與信號傳導有關。在目前人們研究的數(shù)條細胞信號通路中，絲裂原活化蛋白激酶家族即MAPK信號通路參與了細胞生長、發(fā)育、分裂及細胞間的功能同步等多種生理過程，是細胞信號傳導研究的熱點領域。在真核細胞中,已確定出四條MAPK信號轉導通路,即ERK通路、JNK通路、p38通路和ERK5通路。大量資料證實,細菌內(nèi)毒素(LPS)與其受體結合后可通過細胞內(nèi)酪氨酸激酶或G蛋白耦聯(lián)的信號途徑激活細胞內(nèi)MAPK激酶,最終導致各種轉錄因子的核轉錄。p38是MAPK家族最重要的成員之一，是LPS誘導細胞反應的重要信號環(huán)節(jié)。由于在人的許多細胞因子基因的啟動子上存在多種轉錄因子的結合位點,而這些轉錄因子又是p38的磷酸化作用底物,因此p38就是通過活化這些轉錄因子來調(diào)節(jié)細胞因子的基因轉錄。LPS刺激、生理應激等因素均可導致細胞內(nèi)p38的迅速活化,進而誘導下游細胞因子的產(chǎn)生及各種細胞反應。已有研究表明，p38激酶在LPS、TNF-a或CD40配體誘導的樹突狀細胞的成熟過程中具有重要的作用。采用p38激酶特異性的阻滯劑SB203580孵育樹突狀細胞，可以顯著的阻斷由LPS或TNF-a誘導的細胞成熟，其CD80、CD86等共刺激分子的表達及T細胞刺激能力明顯下降[8，9]?？梢哉J為，p38激酶信號通路是樹突狀細胞成熟過程中最重要的一條信號通路，與樹突狀細胞的抗原提呈和T細胞刺激功能密切相關。近期已經(jīng)有研究提示ω-3PUFAs可以在細胞內(nèi)信號傳導水平干預T細胞的功能。但ω-3PUFAs對細胞內(nèi)p38激酶通路的影響尚無任何研究。因此，本課題擬以人外周血單核細胞來源的樹突狀細胞為研究對象,從細胞膜結構組成，細胞免疫表型,抗原提呈功能以及相關細胞因子的表達等多方面觀察ω-3多不飽和脂肪酸對樹突狀細胞功能的影響,并對其細胞內(nèi)p38SAP激酶信號通路的影響進行初步探討。以明確ω-3多不飽和脂肪酸對樹突狀細胞的抑制作用，以期為ω-3多不飽和脂肪酸在臨床器官移植領域的應用提供理論依據(jù)。主要參考文獻1.GadM,ClaessonMH,PedersenAEetal.Dendriticcellsinperipheraltoleranceandimmunity.APMIS.2003,111(7-8):766-7752.ToungouzM,DonckierV,GoldmanM.Toleranceinductioninclinicaltransplantation:thependingquestions.Transplantation.2003,75(9):58-60.3.SteinmanRM,HawigerD,NussenzweigMC.Tolerogenicdendriticcells.AnnuRevImmunol.2003,21:685-711.4.ClelandLG,JamesMJandProudmanSM.Theroleoffishoilsinthetreatmentofrheumatoidarthritis.Drugs.2003;63(9):845-853.5.ArringtonJL,McMurrayDN,SwitzerKCetal.DocosahexaenoicAcidSuppressesFunctionoftheCD28CostimulatoryMembraneReceptorinPrimaryMurineandJurkatTCells.JNutr.2001,131:1147-1153.6.PomposLJandFritscheKL.Antigen-drivenmurineCD4+Tlymphocyteproliferationandinterleukin-2productionarediminishedbydietary(n-3)polyunsaturatedfattyacids.JNutr.2002,132(11):3293-3300.7.FanYY,McMurrayDN,LyLHetal.Dietary(n-3)polyunsaturatedfattyacidsremodelmouseT-celllipidrafts[J].JNutr.2003,133(6):1913-1920.8.KiritM.Ardeshna,ArnoldRetal.ThePI3kinase,p38SAPkinase,andNF-Kbsignaltransductionpathwaysareinvolvedinthesurvivalandmaturationoflipopolysaccharide-stimulatedhumanmonocyte-deriveddendriticcells.Blood,2000,96(3):1039-10469.AmayaPK,MiguelR,OskarFCetal.Extracellularsignal-regulatedproteinkinasesignalingpathwaynegativelyregulatesthephenotypicandfunctionalmaturationofmonocyte-derivedhumandendriticcells.Blood,2001,98(7):2175-2182項目的研究內(nèi)容、研究目標,以及擬解決的關鍵問題。主要研究內(nèi)容：第一部分人外周血單核細胞來源的DCs細胞的誘導，培養(yǎng)及鑒定。外周全血分離白膜，GM-CSF，IL-4,LPS誘導分化DC,流式細胞術鑒定其細胞表型。第二部分ω-3多不飽和脂肪酸對DCs細胞膜脂質(zhì)組成結構的影響觀察ω-3多不飽和脂肪酸（EPA和DHA，）對DCs細胞細胞膜脂質(zhì)成分變化的影響。（氣相色譜法）,探討DCs體外培養(yǎng)條件下,ω-3多不飽和脂肪酸是否可以直接改變細胞膜脂質(zhì)的構成。第三部分ω-3多不飽和脂肪酸對DCs表型，抗原提呈功能及細胞因子分泌的影響:1.研究ω-3多不飽和脂肪酸（EPA和DHA）對DCs抗原提呈能力變化的影響。（混合淋巴細胞反應H3法）2.觀察ω-3多不飽和脂肪酸（EPA和DHA）對DCs細胞免疫表型CD1a、CD40、CD80、CD83、CD86及HLA-DR表達率的影響,以期明確對DCs成熟和抗原提呈功能起重要作用的相關免疫因子的表達情況.（流式細胞術檢測）3.研究ω-3多不飽和脂肪酸（EPA和DHA）對DCs細胞分泌IL-12，IL-10及TNF-a的影響。（northernblot及ELISA）,觀察多不飽和脂肪酸是否可能通過對相關細胞因子的分泌影響了T細胞的Th1/Th2平衡，這一平衡是機體細胞免疫增強或減弱的重要原因。第四部分ω-3多不飽和脂肪酸對LPS誘導的DCs成熟過程中p38SAP激酶信號傳導通路的干預作用:研究ω-3多不飽和脂肪酸（EPA和DHA）對DCs細胞內(nèi)p38SAP激酶的影響（westernblot）。p38SAP信號通路參與了LPS誘導的DCs的成熟，p38SAP的激活可以導致許多重要的細胞因子和趨化因子基因的轉錄。了解ω-3多不飽和脂肪酸對p38SAP信號通路的影響將使我們能夠從機制上解釋ω-3多不飽和脂肪酸對樹突狀細胞潛在的抑制性作用。研究目標：通過本課題研究，希望了解ω-3多不飽和脂肪酸是否能夠改變DCs細胞的免疫表型和抗原提呈功能，并明確這種改變是否和DCs胞膜上脂質(zhì)成分的改變以及細胞內(nèi)信號轉導途徑p38SAP激酶的參與有關。從而確定ω-3多不飽和脂肪酸對DCs的免疫功能的影響及可能的機制.本項目的完成，將進一步明確ω-3多不飽和脂肪酸對機體免疫系統(tǒng)的影響，使器官移植的術后營養(yǎng)支持的使用更有針對性，并可能為將來使用免疫營養(yǎng)制劑替代或部分替代目前價格昂貴,副作用明顯的免疫抑制藥物提供了可能.重點解決問題：1.樹突狀細胞細胞膜脂質(zhì)成分的分離，提取及各種脂肪酸含量的分析；2.樹突狀細胞非成熟狀態(tài)及成熟狀態(tài)的誘導，維持及鑒定標準；3.細胞內(nèi)p38SAP激酶磷酸化的檢測。擬采取的研究方案及可行性分析。研究步驟第一部分人外周血單核細胞來源的DCs細胞的誘導，培養(yǎng)及鑒定。外周全血分離白膜，帖壁法獲取單核細胞，加入GM-CSF，IL-4誘導DCs的形成,培養(yǎng)第7天加入LPS誘導DCs的成熟,流式細胞術鑒定其細胞表型。第二部分ω-3多不飽和脂肪酸對DCs細胞膜脂質(zhì)組成結構的影響分為EPA、DHA、硬脂酸及空白對照四個組，將以上物質(zhì)分別于細胞培養(yǎng)第五天加入細胞培養(yǎng)液，作用48小時后再加入LPS誘導DCs的成熟，然后獲取細胞膜，氣相色譜法分析ω-3多不飽和脂肪酸及其他脂肪酸的組成含量。第三部分ω-3多不飽和脂肪酸對DCs表型，抗原提呈及T細胞刺激能力功能的影響。細胞分組及處理同第二部分。收獲細胞后，采用流式細胞術檢測ω-3干預組和對照組之間DCs細胞表型CD1a、CD40、CD80、CD83、CD86及HLA-DR表達情況。采用northernblot及ELISA分別檢測IL-12、IL-10及TNF-a的細胞內(nèi)基因水平及細胞外分泌能力。采用混合淋巴細胞反應H3法檢測DCs刺激同種異體T細胞增殖的能力。第四部分ω-3多不飽和脂肪酸（EPA和DHA）對DCs細胞內(nèi)p38SAP信號通路的影響分為EPA、DHA、硬脂酸、空白對照及SB203580（p38SAP阻滯劑）五個組，于細胞培養(yǎng)第五天將以上物質(zhì)分別加入細胞培養(yǎng)液，作用48小時后再加入LPS誘導DCs的成熟后提取細胞蛋白，采用抗p38SAP抗體和抗磷酸化的p38SAP抗體分別檢測p38SAP激酶和磷酸化的p38SAP激酶的含量。技術路線樹突狀細胞的誘導，培養(yǎng)及鑒定樹突狀細胞的誘導，培養(yǎng)及鑒定細胞培養(yǎng)液中分別加入EPA，DHA或?qū)φ占毎囵B(yǎng)液中分別加入EPA，DHA或?qū)φ諜z測DCs細胞因子的分泌能力觀察DCs表型和抗原提呈能力檢測檢測DCs細胞因子的分泌能力觀察DCs表型和抗原提呈能力檢測細胞膜脂質(zhì)組成成分檢測p38激酶的磷酸化檢測p38激酶的磷酸化結論結論研究可行性分析：項目申請者長期致力于樹突狀細胞的臨床、科研研究，熟悉該領域的研究基礎及發(fā)展動態(tài)，并已經(jīng)在該領域以第一作者撰寫和發(fā)表多篇論文。項目組成員均接受過比較正規(guī)及全面的科研訓練，熟練掌握實驗所必需的細胞生物學及分子生物學實驗技術；本研究所為全軍普通外科研究所和普通外科國家重點實驗室，在營養(yǎng)支持治療和小腸移植方面具有豐富的臨床積累，治療效果顯著，實驗室設備先進、齊全，能滿足該研究所需要的設備條件，部分指標在校內(nèi)其他實驗室均可完成檢測；以上條件可以保證該研究的順利進行。本項目的特色與創(chuàng)新之處。樹突狀細胞的成熟狀態(tài)是機體誘導移植排斥反應或是誘導移植耐受的關鍵環(huán)節(jié)。該課題研究ω-3多不飽和脂肪酸對樹突狀細胞成熟和功能的影響并試圖闡明其可能作用機制，這一結果可能為我們提供一條通過抑制樹突狀細胞誘導移植耐受的新方法。這一課題的研究將有助人們進一步理解ω-3PUFAs造成免疫抑制的原因,從而為ω-3PUFAs在臨床免疫移植排斥反應中的應用提供理論依據(jù)。該課題所涉及的領域也是當前移植免疫研究中的重點和前沿，從小分子物質(zhì)ω-3PUFAs的角度來探討其對樹突狀細胞成熟的影響，并對其相關信號轉導機制進行研究具有一定的原始創(chuàng)新性，在該領域的國內(nèi)外研究中尚未見報道。5、年度研究計劃及預期研究結果。2004.04－2004.05訂購試劑、相關試驗條件準備2004.06－2004.08外周血DC分離、誘導培養(yǎng)及鑒定；2004.08－2005.01DCs細胞膜脂質(zhì)組成結構的檢測；2005.01－2005.06ω-3多不飽和脂肪酸對DCs表型，抗原提呈及T細胞刺激能力功能的影響的檢測；2005.7－2005.12DCs細胞內(nèi)p38SAP信號通路的分析。2006.01－2006.04試驗數(shù)據(jù)的整理、統(tǒng)計分析；試驗結題報告、研究論文的書寫及交流、投稿預期結果：ω-3PUFAs在多方面抑制了樹突狀細胞的成熟和功能，這種抑制作用與ω-3PUFAs對細胞膜脂質(zhì)成分的改變和細胞內(nèi)信號通路p38激酶的參與有關。（二）研究基礎與工作條件工作基礎項目申請者長期從事樹突狀細胞的臨床應用及基礎研究,熟悉樹突狀細胞的研究方法,對相關研究的國內(nèi)外最新動態(tài)能近快了解.能夠熟練的進行DCs的體外誘導和培養(yǎng),掌握流式細胞檢測技術，northern雜交技術,western雜交等常用實驗技術。南京軍區(qū)總醫(yī)院普通外科研究所是國家衛(wèi)生部臨床藥理基地（營養(yǎng)支持專業(yè)），全軍器官移植重點實驗室，江蘇省代謝與營養(yǎng)重點實驗室。學術帶頭人為著名普通外科專家黎介壽院士。長期從事腸內(nèi)腸外營養(yǎng)的臨床應用。本所先后獲得全國科學大會獎、全軍專業(yè)技術重大貢獻獎、國家科技進步二等獎、軍隊科技進步一等獎、軍隊醫(yī)療成果一等獎、軍隊科技進步二等獎、國家教委與省級科技進步二等獎等各種獎勵25項。工作條件本研究所涉及的細胞培養(yǎng),流式細胞檢測等相關儀器（超凈臺，孵箱，PCR擴增儀，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，凝膠攝像分析系統(tǒng)，高速冷凍離心機，紫外-可見分光光度計，流式細胞檢測等相關儀）已基本到位。northern雜交所需相關器材可以進一步購買添置.分析脂質(zhì)成分的高效氣相色譜儀有專人操作,技術上有一定保證。實驗所需各種單抗,熒光抗體,試劑盒,各種細胞因子,酶類均可從各試劑公司購買獲得。誘導DCs所需健康成人外周血可從我院血庫購買獲得.申請人簡歷汪灝，男，33歲。臨床醫(yī)學（普通外科）專業(yè)，博士后。1994年畢業(yè)于第一軍醫(yī)大學醫(yī)療系。2001年獲第三軍醫(yī)大學普通外科專業(yè)博士學位?，F(xiàn)任南京軍區(qū)南京總醫(yī)院普通外科主治醫(yī)師。研究生階段分別主持完成了“腫瘤細胞對樹突狀細胞功能影響的研究”及“樹突狀細胞疫苗抗胃癌作用的臨床應用研究”等科研項目。自2000年至今以第一作者發(fā)表或投稿論文9篇，其中英文論著2篇。2003年獲王寬成教育基金博士后獎學金一項。目前已投稿或發(fā)表的文章:1.汪灝.樹突狀細胞疫苗在腫瘤免疫治療中的作用.免疫學雜志2000.08128-1302.汪灝郝群.DC疫苗在腫瘤臨床治療中的應用進展.中國腫瘤臨床2003.12901-904 3.汪灝余佩武曾冬竹等.臨床用DC疫苗的制備及檢測.第三軍醫(yī)大學學報2004.94.汪灝余佩武王月禾等.樹突狀細胞疫苗對胃癌術外周血IL-12及Th1/Th2平衡的影響.中華普通外科雜5.汪灝余佩武張坤等.樹突狀細胞疫苗對胃癌患者術后療效的初步觀察.中華胃腸外科雜志6.汪灝余佩武曾冬竹等.樹突狀細胞疫苗治療胃癌患者后腫瘤特異性免疫反應的誘導.中華腫瘤雜志7.汪灝郝群曾冬竹等.腫瘤細胞培養(yǎng)上清對DC細胞凋亡誘導的研究.重慶醫(yī)學.8.Wanghao,haoqun，yupeiwu.InductionofTumorSpecificImmuneResponseinPatientsWithGastricCarcinomaAfterVaccinationWithTumorAntigenPulsedDendriticCells.ChineseJournalofMedicine9.Wanghao,haoqun,yupeiwu.Clinicalandimmunologicaleffectsofdendriticcellsvaccineonpatientswithgastriccancer.WorldJournalofGastrointential.郝群，女，漢族，醫(yī)學博士。1994年畢業(yè)于徐州醫(yī)學院臨床醫(yī)學系獲學士學位。2003年畢業(yè)于上海復旦大學醫(yī)學院婦產(chǎn)科專業(yè)獲博士學位。目前在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院任主治醫(yī)師。主要從事婦科免疫方面的研究工作。近年已發(fā)表論文十余篇。主要負責細胞流式檢測工作。于寶軍，男，漢族，醫(yī)學博士。1993年畢業(yè)于第二軍醫(yī)大學，獲學士學位，2001年畢業(yè)于第二軍醫(yī)大學獲博士學位。2003年5月在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院博士后工作站工作期滿出站?，F(xiàn)在南京軍