分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件：質(zhì)粒DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳

質(zhì)粒DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳基因克隆簡(jiǎn)介

目的基因

載體

酶切，連接

重組基因

轉(zhuǎn)入

受體細(xì)胞

篩選陽(yáng)性克隆

基因克隆流程圖基因克隆簡(jiǎn)介分切接轉(zhuǎn)篩二.載體定義：載體是一類能將外源基因攜帶進(jìn)入受體細(xì)胞并能自我復(fù)制的DNA分子。結(jié)構(gòu)的三要素多克隆位點(diǎn)遺傳標(biāo)記復(fù)制起點(diǎn)包含多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的DNA片段載體種類：質(zhì)粒噬菌體載體酵母人工染色體（YAC）病毒載體常用的克隆載體三.質(zhì)粒（一）定義：質(zhì)粒是獨(dú)立存在于細(xì)菌染色體外的，能獨(dú)立復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子。（三）質(zhì)粒的構(gòu)型1.超螺旋DNA（supercoiledDNA,scDNA）超螺旋2.開(kāi)環(huán)DNA(opencircleDNA,ocDNA)開(kāi)環(huán)DNA3.線形DNA（linearcircleDNA，lcDNA)（四）與本實(shí)驗(yàn)有關(guān)的兩種質(zhì)粒1.PBR322(作為目的基因供體)

oriiamprtetr2.PUC18(作為載體）orii實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和方法。2.掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理和基本操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理：（一）堿裂解法堿裂解法是利用質(zhì)粒DNA和染色體DNA之間變性和復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。強(qiáng)堿及機(jī)械剪切力①染色體DNA斷裂成小片段線性DNA（機(jī)械剪切力)②染色體氫鍵斷裂，雙鏈解離變性（強(qiáng)堿）；①質(zhì)粒DNA保持閉合環(huán)狀；②雙鏈DNA并未完全分離（強(qiáng)堿）。酸中和至中性變性的染色體DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物質(zhì)粒DNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中二.瓊脂糖凝膠電泳回顧：1.電泳的定義及影響電泳的因素？2.醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)的原理？瓊脂糖凝膠電泳分離DNA原理點(diǎn)樣孔

超螺旋DNA線形DNA開(kāi)環(huán)DNA帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度由于電場(chǎng)力的作用，使帶電顆粒在電場(chǎng)中向一定方向泳動(dòng)；此顆粒在泳動(dòng)過(guò)程中還受到一個(gè)相反方向的摩擦力(f·υ)阻擋；當(dāng)這兩種力相等時(shí)，顆粒則以均勻速度(υ)向前泳動(dòng)點(diǎn)樣孔

超螺旋DNA線形DNA開(kāi)環(huán)DNA帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度由于電場(chǎng)力的作用，使帶電顆粒在電場(chǎng)中向一定方向泳動(dòng)；此顆粒在泳動(dòng)過(guò)程中還受到一個(gè)相反方向的摩擦力(f·υ)阻擋；當(dāng)這兩種力相等時(shí)，顆粒則以均勻速度(υ)向前泳動(dòng)式中f為摩擦系數(shù)。根據(jù)Stoke公式，阻力大小取決于帶電顆粒的大小、形狀以及所處介質(zhì)的黏度，即式中f——阻力，牛頓；r——粒子半徑，米；——介質(zhì)粘度，牛頓·秒/米2；從公式看出，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度與電場(chǎng)強(qiáng)度和帶電顆粒的凈電荷量成正比，而與顆粒半徑和介質(zhì)黏度成反比

電泳遷移率電泳遷移率（mobility）:在電位強(qiáng)度E的影響下，帶電顆粒在時(shí)間t中的遷移距離d。d為帶電顆粒泳動(dòng)的距離(cm)；l為支持物的有效長(zhǎng)度(cm)；t為通電時(shí)間(秒)；V為加在支持物兩端的實(shí)際電壓(V)

單位是cm2·sec-1·V-1加1.5ml培養(yǎng)物于EP管，12000rpm×30S

重復(fù)一次除去上清，加入冰的100μl溶液I，劇烈振蕩EP管

以下動(dòng)作要輕柔

加入200μl溶液II，溫和顛倒數(shù)次，室溫放置3min

加入150μl冰溶液III，溫和顛倒2-3次，冰浴5min，12000rpm×5min轉(zhuǎn)移上清到新EP管（統(tǒng)一吸350微升）加入等體積氯仿，溫和混勻，12000rpm×2min

上層水相轉(zhuǎn)移到新EP管（統(tǒng)一吸250微升）加入2倍體積無(wú)水乙醇，顛倒混勻，室溫靜置2min，12000rpm5min

棄上清，沉淀中加1ml70%乙醇，12000rpm×2min

去上清，管平放室溫靜置10min，40μlTE溶解DNA

實(shí)驗(yàn)步驟瓊脂糖凝膠板的制備（封板、制備1%凝膠、倒膠、插梳、凝固后拔梳）倒緩沖液，加樣（取質(zhì)粒DNA樣品液10μl+2μl上樣緩沖液，輕輕混勻，避免氣泡）電泳（100V0.5小時(shí)，5V/cm）檢測(cè)（紫外燈下檢測(cè)）主要試劑及作用1.solutionⅠ：①蔗糖：增加溶液的粘度,減少抽提過(guò)程中的機(jī)械剪切作用,防止破壞質(zhì)粒.(保護(hù)作用)②EDTA

：絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子,防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用。（保護(hù)作用）③

Tris?HCl：能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）2.solutionII：①SDS的作用裂解細(xì)胞和蛋白質(zhì)變性作用②NaOH（PH>12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（DNA變性作用）3.solutionIII：①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的堿性，使質(zhì)粒DNA復(fù)性。②KAC會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；溶液中的染色體DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNA分離。4.氯仿：進(jìn)一步沉淀去除蛋白質(zhì)5.無(wú)水乙醇：沉淀質(zhì)粒DNA6.70%乙醇：洗滌質(zhì)粒DNA7.上樣緩沖液（6x）：

①50%蔗糖：增加密度，以確保DNA樣品沉入點(diǎn)樣孔內(nèi)。②溴酚藍(lán)：指示前沿。便于觀察DNA片段的位置質(zhì)粒