微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(XXXX版)

食品微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)劉后偉、林丹瓊、劉旭光適合專業(yè)：綠色食品加工專業(yè)食品營(yíng)養(yǎng)與檢測(cè)專業(yè)農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)專業(yè)實(shí)訓(xùn)一顯微鏡的操作與使用實(shí)驗(yàn)1:顯微鏡的構(gòu)造、性能和使用方法目的要求(1)熟悉普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造及各部分的功能。(2)學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法。基本原理顯微鏡由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。油鏡物鏡的基本原理微生物學(xué)研究用的顯微鏡的物鏡通常有低倍物鏡（16mm，10×）、高倍物鏡（4mm，40—45×）和油鏡（1．8mm，95—100×）三種。油鏡通常標(biāo)有黑圈或紅圈，也有的以“OI字樣表示，它是三者中放大倍數(shù)最大的。根據(jù)使用不同放大倍數(shù)的目鏡，可使被檢物體放大1000—2000使用時(shí)，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是隔一層油質(zhì)，稱為油浸系。這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率n=1．52，與玻璃相同。當(dāng)光線通過(guò)載玻片后，可直接通過(guò)香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射。如果玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，則稱為干燥系，當(dāng)光線通過(guò)玻片后，受到折射發(fā)生散射現(xiàn)象，進(jìn)入物鏡的光線顯然減少，這樣就減低了視野的照明度。利用油鏡不但能增加照明度，更主要的是能增加數(shù)值孔徑，因?yàn)轱@微鏡的放大效能是由其數(shù)值孔徑?jīng)Q定的。所謂數(shù)值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角度（稱為鏡口角）的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率所得的乘積，可用下列公式表示：NA＝n·sinα式中NA=數(shù)值孔徑；n=介質(zhì)折射率；α=最大入射角的半數(shù)，即鏡口角的半數(shù)。因此，光線投射到物鏡的角度愈大，顯微鏡的效能就愈大（圖Ⅲ-5），該角度的大小決定于物鏡的直徑和焦距。同時(shí)，α的理論限度為90°，sin90°=1，故以空氣為介質(zhì)時(shí)（n=1），數(shù)值孔徑不能超過(guò)1，如以香柏油為介質(zhì)時(shí)，則n增大，其數(shù)值孔徑也隨之增大。如光線入射角為120°，其半數(shù)的正弦為sin60°=0．87，則：以空氣為介質(zhì)時(shí)：NA=1×0．87=0．87以水為介質(zhì)時(shí)：NA=1．33×0．87=1．15以香柏油為介質(zhì)時(shí)：NA=1．52×0．87=1．32顯微鏡的分辨力是指顯微鏡能夠辨別兩點(diǎn)之間最小距離的能力。它與物鏡的數(shù)值孔徑成正比，與光波長(zhǎng)度成反比。因此，物鏡的數(shù)值孔徑愈大，光波波長(zhǎng)越短，則顯微鏡的分辨力愈大，被檢物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)也愈能明晰地區(qū)別出來(lái)。因此，一個(gè)高的分辨力意味著一個(gè)小的可分辨距離，這兩個(gè)因素是成反比關(guān)系的，通常有人把分辨力說(shuō)成是多少微米或納米，這實(shí)際上是把分辨力和最小分辨距離混淆起來(lái)了。顯微鏡的分辨力是用可分辨的最小距離來(lái)表示的。式中λ=光波波長(zhǎng)。我們?nèi)庋鬯芨惺艿墓獠ㄆ骄L(zhǎng)度為0．55μm，假如數(shù)值孔徑為0．65的高倍物鏡，它能辨別兩點(diǎn)之間的距離為0．42μm。而在0．42μm以下的兩點(diǎn)之間的距離就分辨不出，即使用倍數(shù)更大的目鏡，使顯微鏡的總放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用數(shù)值孔徑更大的物鏡，增加其分辨力才行。例如用數(shù)值孔徑為1．25的油鏡時(shí)，能辨別兩點(diǎn)之間的因此，我們可以看出，假如采用放大率為40倍的高倍物鏡（NA=0．65），和放大率為24倍的目鏡，雖然總放大率為960倍，但其分辨的最小距離只有0．42μm。假如采用放大率為90倍的油鏡（NA=1．25），和放大率為9倍的目鏡，雖然總的放大率為810倍，但卻能分辨出0．22μm間的距離。材料及器材顯微鏡、擦鏡紙、二甲苯、香柏油、微生物制片標(biāo)本等。方法與步驟(1)觀察前的準(zhǔn)備置顯微鏡于平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊沿約3—4cm。鏡檢者姿勢(shì)要端正，一般用左眼觀察，右眼便于繪圖或記錄，兩眼必須同時(shí)睜開，以減少疲勞，亦可練習(xí)左右眼均能觀察。調(diào)節(jié)光源，對(duì)光時(shí)應(yīng)避免直射光源，因直射光源影響物像的清晰，損壞光源裝置和鏡頭，并刺激眼睛。如陰暗天氣，可用日光燈或顯微鏡燈照明。調(diào)節(jié)光源時(shí)，先將光圈完全開放，升高聚光鏡至與載物臺(tái)同樣高，否則使用油鏡時(shí)光線較暗。然后轉(zhuǎn)下低倍鏡觀察光源強(qiáng)弱，調(diào)節(jié)反光鏡，光線較強(qiáng)的天然光源宜用平面鏡；光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡。在對(duì)光時(shí)，要使全視野內(nèi)為均勻的明亮度。凡檢查染色標(biāo)本時(shí)，光線應(yīng)強(qiáng)；檢查未染色標(biāo)本時(shí)，光線不宜太強(qiáng)。可通過(guò)擴(kuò)大或縮小光圈、升降聚光器、旋轉(zhuǎn)反光鏡調(diào)節(jié)光線。(2)低倍鏡觀察檢查的標(biāo)本需先用低倍鏡觀察，因?yàn)榈捅剁R視野較大，易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定檢查的位置。將金黃色葡萄球菌染色標(biāo)本置鏡臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推動(dòng)器，使觀察對(duì)象處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器，使物鏡降至距標(biāo)本約0．5cm處，由目鏡觀察，此時(shí)可適當(dāng)?shù)乜s小光圈，否則視野中只見光亮一片，難見到目的物，同時(shí)用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒，直至物像出現(xiàn)后再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚時(shí)為止，然后移動(dòng)標(biāo)本，認(rèn)真觀察標(biāo)本各部位，找到合適的目的物，并將其移至視野中心，準(zhǔn)備用高倍鏡觀察。(3)高倍鏡觀察將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，在轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)，需用眼睛在側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后由目鏡觀察，并仔細(xì)調(diào)節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜，同時(shí)用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒至物像出現(xiàn)后，再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)至物像清晰為止，找到最適宜觀察的部位后，將此部位移至視野中心，準(zhǔn)備用油鏡觀察。(4)油鏡觀察用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒提起約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在香柏油中，其鏡頭幾乎與標(biāo)本相接，應(yīng)特別注意不能壓在標(biāo)本上，更不可用力過(guò)猛，否則不僅壓碎玻片，也會(huì)損壞鏡頭。從接目鏡內(nèi)觀察，進(jìn)一步調(diào)節(jié)光線，使光線明亮，再用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野出現(xiàn)物像為止，然后用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。如油鏡已離開油面而仍未見物像，必須再?gòu)膫?cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作至物像看清為止。用同樣的方法觀察枯草芽孢桿菌染色標(biāo)本。觀察完畢，上旋鏡筒。先用擦鏡紙拭去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用干凈擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。切忌用手或其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭。用綢布擦凈顯微鏡的金屬部件。將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋。同時(shí)把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)作業(yè)分別繪出你在低倍鏡、高倍鏡和油鏡下觀察到的金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的狀態(tài)，包括在三種情況下視野中的變化，同時(shí)注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。在使用高倍鏡和油鏡進(jìn)行調(diào)焦時(shí)，應(yīng)將鏡筒徐徐上升還是下降？為什么？用油鏡觀察時(shí)，為什么要在載玻片上滴加香柏油？

實(shí)訓(xùn)二培養(yǎng)基的配制和滅菌

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.明確培養(yǎng)基的配制原理。2.掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容學(xué)習(xí)細(xì)菌、放線菌、酵母菌及霉菌四大類微生物培養(yǎng)基的配制。實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。各類微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不盡相同，因而培養(yǎng)基的種類繁多。培養(yǎng)細(xì)菌常用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)放線菌常用高氏I號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)霉菌常用蔡氏培養(yǎng)基或馬鈴薯培養(yǎng)基，培養(yǎng)酵母菌常用麥芽汁培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。另外還有固體、液體、加富、選擇、鑒別等培養(yǎng)基之分。在這些培養(yǎng)基中，就營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而言，一般不外乎碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子及水等幾大類。瓊脂只是固體培養(yǎng)基的支持物，一般不為微生物所利用。它在96℃以上熔化成液體，而在45℃左右開始凝固成固體。在配制培養(yǎng)基時(shí)，根據(jù)各類微生物的特點(diǎn)，就可以配制出適合不同種類微生物生長(zhǎng)發(fā)育所需要的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基除了滿足微生物所必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還要求有一定的酸堿度和滲透壓。霉菌和酵母菌的pH偏酸；細(xì)菌、放線菌的pH為微堿性。所以每次配制培養(yǎng)基時(shí)，都要將培養(yǎng)基的pH值調(diào)到一定的范圍。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方牛肉膏3.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g水1000mLpH7.4~7.6高氏I號(hào)培養(yǎng)基配方可溶性淀粉20gNaCl0.5gKNO31gK2HPO4·3H2O0.5gMgSO4·7H2O0.5gFeSO4·7H2O0.01g瓊脂15—25g水1000mLpH7.4~7.6馬鈴薯培養(yǎng)基配方馬鈴薯（去皮）20葡萄糖（或蔗糖）2瓊脂15~2水1000ml自然pH察氏培養(yǎng)基配方蔗糖3NaNO32K2HPO41gKCl0.5gMgSO4·7H2O0.5gFeSO4·7H2O0.01g瓊脂15~2蒸餾水1000ml自然pH實(shí)驗(yàn)及器材牛肉膏，蛋白胨，NaCl，瓊脂，1mol/LNaOH,1mol/LHCl，KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，F(xiàn)eS04·7H2O，馬鈴薯，蔗糖等。試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙，pH試紙(pH5.5~9.0)，棉花，牛皮紙，記號(hào)筆，麻繩，紗布等。實(shí)驗(yàn)步驟1．牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法(1)稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次推確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放人燒杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯，也可按在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時(shí)如稍微加熱，牛肉膏便會(huì)與稱量紙分離，然后立即取出紙片。蛋白胨很易吸濕，在稱取時(shí)動(dòng)作要迅速。另外，稱藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另一藥品。瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。(2)溶化：在上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。將藥品完全溶解后，補(bǔ)充水到所需的總體積，如果配制固體培養(yǎng)基時(shí)，將稱好的瓊脂放入己溶的藥品中，再加熱溶化，最后補(bǔ)足所損失的水分。在瓊脂溶化過(guò)程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時(shí)．需不斷攪拌．以防瓊脂糊底燒焦。配制培養(yǎng)基時(shí)，不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基中，影晌細(xì)菌生長(zhǎng)。(3)調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH,邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)其pH，直至pH達(dá)7.6。反之，用mol/LHCL進(jìn)行調(diào)節(jié)。對(duì)于有些要求pH較精確的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn)行。pH不要調(diào)過(guò)頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。配制pH低的瓊脂培養(yǎng)基時(shí)，若預(yù)先調(diào)好pH并在高壓蒸氣下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固。因此，應(yīng)將培養(yǎng)基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調(diào)整PH。(4)過(guò)濾趁熱用濾紙或多層紗布過(guò)濾，以利某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。一般無(wú)特殊要求的情況下可以省去（本實(shí)驗(yàn)勿需過(guò)濾）。(5)分裝按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝人試管內(nèi)或三角燒瓶?jī)?nèi)。1)液體分裝：分裝高度以試管高度的l／4左右為宜。分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過(guò)三角瓶容積的一半為宜，如果是用于振蕩培養(yǎng)用，則根據(jù)通氣量的要求酌情減少；有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，需要補(bǔ)加一定量的其他無(wú)菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準(zhǔn)確。2)固體分裝：分裝試管，其裝量不超過(guò)管高的1/5，滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過(guò)三角燒瓶容積的一半為宜。3)半固體分裝：試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。圖1-1培養(yǎng)基的分裝A漏斗分裝裝置；B自動(dòng)分裝裝置1鐵架；2漏斗；3孔膠管；4彈簧夾；5玻璃；6流速調(diào)節(jié)；7裝量調(diào)節(jié)；8開關(guān)分裝過(guò)程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染。(6)加塞圖1-2棉塞的制作培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角烷瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞及試管帽等），棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基，防止由此而引起的污染；另一方面保證有良好的通氣性能，使培養(yǎng)在里面的微生物能夠從外界源源不斷地獲得新鮮無(wú)菌空氣。因此棉塞質(zhì)量的好壞對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有著很大的影響。一只好的棉塞，外形應(yīng)象一只蘑菇，大小、松緊都應(yīng)適當(dāng)。加塞時(shí)的棉塞的總長(zhǎng)度的3/5應(yīng)在口內(nèi)，2/5在口外。(7)包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時(shí)容易解開，同樣用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。(8)滅菌將上述培養(yǎng)基以0.103MPa，121℃(9)擱置斜面將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50℃(10)無(wú)菌撿查將滅菌培養(yǎng)基放人37℃的溫室中培養(yǎng)24—2．高氏I號(hào)培養(yǎng)基配制方法(1)稱量和溶化按配方先稱取可溶性淀粉、放入小燒杯中，并用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化。然后再稱取其他各成分依次逐一溶化。對(duì)微量成分FeSO4·7H2O可先配成高濃度的貯備液按比例換算后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4·7H2O配成0.01g／ml，再在1000mL培養(yǎng)基中加1mL的0.0lg／m1的貯備液即可。待所有藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基，其溶化過(guò)程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法。(2)pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無(wú)菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法。3．馬鈴薯培養(yǎng)基配制方法取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，放入1500mL的燒杯中煮沸30min，注意用玻棒攪拌以防糊底。然后用雙層紗布過(guò)濾，取濾液加糖（酵母菌用葡萄糖，霉菌用蔗糖），加熱煮沸后加入瓊脂，繼續(xù)加熱融化并補(bǔ)足失水。再按前所述，進(jìn)行分裝、加塞、包扎、0.1MPa滅菌20min。4．察氏培養(yǎng)基配制方法方法同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論針對(duì)實(shí)驗(yàn)原理、步驟、現(xiàn)象進(jìn)行討論。實(shí)驗(yàn)作業(yè)（選做3題）1．牛肉膏應(yīng)置于何種容器中稱量為宜?2．配制高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基時(shí)，可溶性淀粉需經(jīng)什么處理后才能倒入到沸水中?3．何謂培養(yǎng)基的自然pH?4．培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌?如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無(wú)菌的5．在配制培養(yǎng)基的操作過(guò)程中應(yīng)注意些什么問(wèn)題?為什么?6．配制合成培養(yǎng)基加入微量元素時(shí)最好用什么方法加入?天然培養(yǎng)基為什么不需要另加微量元素?7．有人認(rèn)為自然環(huán)境中微生物是生長(zhǎng)在不按比例的基質(zhì)中，為什么在配制培養(yǎng)基時(shí)要注意各種營(yíng)養(yǎng)成分的比例?8．你配制的高氏I號(hào)培養(yǎng)基有沉淀產(chǎn)生嗎?說(shuō)明產(chǎn)生或未產(chǎn)生的原因。9．細(xì)菌能在高氏I號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)嗎?為了分離放線菌，你認(rèn)為應(yīng)該采取什么措施?實(shí)訓(xùn)三革蘭氏染色法目的要求了解革蘭氏染色的原理，學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色的方法。基本原理 革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立的。革蘭氏染色法不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示。細(xì)菌對(duì)于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過(guò)程中，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞內(nèi)而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍(lán)紫色；革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復(fù)染液（番紅）的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料初染液；媒染劑；脫色劑和復(fù)染液。堿性染料初染液的作用象在細(xì)菌的單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫。媒染劑的作用是增加染料和細(xì)胞之間的親和性或附著力，即以某種方式幫助染料固定在細(xì)胞上，使不易脫落，碘是常用的媒染劑。脫色劑是將被染色的細(xì)胞進(jìn)行脫色，不同類型的細(xì)胞脫色反應(yīng)不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95％的酒精。復(fù)染液也是一種堿性染料，其顏色不同于初染液，復(fù)染的目的是使被脫色的細(xì)胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細(xì)胞仍然保持初染的顏色，從而將細(xì)胞區(qū)分成G+和G-兩大類群，常用的復(fù)染液是番紅。材料及器材(1)大腸桿菌，枯草芽孢桿菌(2)革蘭氏染色液，載玻片，顯微鏡等方法與步驟涂片將培養(yǎng)14—16小時(shí)的枯草芽孢桿菌和培養(yǎng)24小時(shí)的大腸桿菌分別作涂片（注意涂片切不可過(guò)于濃厚），干燥、固定。固定時(shí)通過(guò)火焰1—2次即可，不可過(guò)熱，以載玻片不燙手為宜。初染加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗?！饺镜渭拥庖簺_去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗?！撋珜⑤d玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時(shí)為止，約20—30秒鐘，立即用水沖凈酒精。復(fù)染用番紅液染1—2分鐘，水洗。鏡檢干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色。以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過(guò)于密集的細(xì)菌，常常呈假陽(yáng)性。同法在一載玻片上以大腸桿菌與枯草芽孢桿菌混合制片，作革蘭氏染色對(duì)比。革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度，如脫色過(guò)度，則陽(yáng)性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時(shí)，陰性菌可被誤染為陽(yáng)性菌。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽(yáng)性菌培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。革蘭氏染色過(guò)程：實(shí)驗(yàn)作業(yè)在你所作的革蘭氏染色制片中，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌各染成何色？它們是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽(yáng)性菌？作革蘭氏染色涂片為什么不能過(guò)于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？

實(shí)驗(yàn)四乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V.P試驗(yàn))一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私忤b別不同腸桿菌科各菌屬的乙酰甲基甲醇試驗(yàn)原理，并掌握其操作方法二、原理某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合、脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱為V.P(+)反應(yīng)。CH3CH3CH3NH3N=CH-CH3︱︱︱／／CO→CO→CO＋NH=C→NH=C︱︱︱＼＼COOHCHOHCONH3N=CH-CH3︱︱CH3CH3三、實(shí)驗(yàn)材料(1)菌種大腸埃希氏菌(Escherichiacoli),枯草芽孢桿菌(Bacillussubttilis)的斜面菌種。(2)培養(yǎng)基葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的試管(3)其它酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。四、方法與步驟發(fā)酵液試管→標(biāo)記→接種→培養(yǎng)→觀察→記錄。(1)．標(biāo)記試管取5支裝有葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的試管，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌和空白對(duì)照。(2)．接種培養(yǎng)以無(wú)菌操作分別接種少量菌至以上相應(yīng)試管中，空白對(duì)照管不接菌，置37℃恒溫箱中，培養(yǎng)24(3)．觀察記錄a.取出以上試管，振蕩2min。另取5支空試管相應(yīng)標(biāo)記菌名，分別加入35mL以上對(duì)應(yīng)管中的培養(yǎng)液，再加入400g／L氫氧化鈉溶液10~20滴，并用牙簽挑人約0.5~1mg微量肌酸，振蕩試管，以使空氣中的氧溶人，置37℃恒溫箱中保溫15b.也可以取上述試管，加入和培養(yǎng)液一半的6%的萘酚，搖勻，再加入培養(yǎng)液1/3的40%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，觀察結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果若培養(yǎng)液呈紅色，記錄為V．P試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)(用“+”表示)；若不呈紅色，記錄為V．P試驗(yàn)陰性反應(yīng)(用“-”表示)。注意：原試管中留下的培養(yǎng)液用作甲基紅試驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)五甲基紅試驗(yàn)(M.R試驗(yàn))一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解鑒別腸桿菌科各菌屬的甲基紅試驗(yàn)原理．2、學(xué)習(xí)甲基紅試驗(yàn)的操作技術(shù)。二、原理腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸。培養(yǎng)液→指示劑→珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基pH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。三、實(shí)驗(yàn)材料(1)菌種同V.P試驗(yàn)(2)培養(yǎng)基同V.P試驗(yàn)(3)其它酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。四、方法與步驟于V.P試驗(yàn)留下的培養(yǎng)液中，各加入2~3滴甲基紅指示劑，注意沿管壁加入，仔細(xì)觀察培養(yǎng)液上層。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果若培養(yǎng)液上層變成紅色,即為陽(yáng)性反應(yīng)；若仍呈黃色，則為陰性反應(yīng)，分別用“+”或“-”表示。

實(shí)驗(yàn)六吲哚試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握吲哚試驗(yàn)(Ehrlich法)的原理和方法：2、學(xué)習(xí)吲哚試驗(yàn)(Ehrlich法)試驗(yàn)的操作技術(shù)。二、原理有些細(xì)菌含有色氨酸酶。能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基質(zhì))。吲哚本身沒(méi)有顏色，不能直接看看見，但當(dāng)加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛試劑時(shí)，該試劑與吲哚作用．形成紅色的攻瑰吲哚。三、實(shí)驗(yàn)材料(1)菌種大腸桿菌(Esch~ichiacoli)，枯草芽孢桿菌。(2)培養(yǎng)基蛋白胨水培養(yǎng)基。(3)其它二甲基氨基苯甲醛溶液，乙醚，酒精燈，接種針，恒溫箱等。四、方法與步驟標(biāo)記試管→接種→培養(yǎng)→觀察→記錄。取裝有蛋白胨水培養(yǎng)基的試管3支，分別標(biāo)記大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和空白對(duì)照。置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24~在培養(yǎng)基中加入乙醚l~2ml，經(jīng)充分震蕩使吲哚萃取至乙醚中．靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面。此時(shí)沿管璧緩慢加入5~10滴吲哚試劑(加人吲哚試劑后切勿搖動(dòng)試管，以防破壞乙醚層影響結(jié)果觀察)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)，陽(yáng)性用“+”；陰性用“-”表示。

實(shí)驗(yàn)七β—半乳糖苷酶試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解β-半乳糖苷酶試驗(yàn)的用途與原理：2、學(xué)習(xí)β-半乳糖苷酶試驗(yàn)的操作技術(shù)。二、原理在鄰硝基酚β-D-半乳糖苷培養(yǎng)基(ONPG培養(yǎng)基)中含有鄰硝基酚β-D-半乳糖苷和pH7．5的0.01mol／L的磷酸緩沖液。當(dāng)試驗(yàn)產(chǎn)生β-半乳糖苷酶時(shí)，鄰硝基酚β-D-半乳糖苷被水解，釋放出鄰硝基酚，此物為酸堿指示劑，它的指示范圍是pH6.8(無(wú)色)→pH8.6(黃色)，故能使pH7.5的培養(yǎng)液成為黃色，否則不變色。三、實(shí)驗(yàn)材料(1)菌種大腸桿菌(Esch~ichiacoli)，愛得華氏菌（Edwardsiellasp）(2)培養(yǎng)基ONPG培養(yǎng)基(3)其它酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。四、方法與步驟取ONFG培養(yǎng)基試管三支，于其上分別做好培養(yǎng)基名稱和“大腸桿菌”、“愛檀華氏苗”、“空白對(duì)照”等標(biāo)記，然后分別將試驗(yàn)菌相應(yīng)地接人ONPG培養(yǎng)基中，連同對(duì)照，置36℃土1五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果試管中培養(yǎng)基顏色變黃者為該試驗(yàn)陽(yáng)性，記“十”號(hào)，否則記“一”

實(shí)驗(yàn)三含碳化臺(tái)物的利用試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)會(huì)測(cè)定某菌能否利用某一含碳化合物的方法。二、原理細(xì)菌能否利用某些含碳化合物作為唯一碳源，反映該菌是否含有代謝這種含碳化合物有關(guān)的酶，因而可作為鑒定的依據(jù)。做這項(xiàng)測(cè)定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方很多，因酶的種類而異．培養(yǎng)基可制成液體分裝試管，也可加1.5％一2％水洗瓊脂制成平板?？捎脕?lái)測(cè)定的底物種類很多，有單糖類、雙糖類、糖醇類、脂肪酸類、羥基酸類、各種有機(jī)酸類、醇類、各種氮基酸類、胺類以及磺氫化合物等。糖的含量一般為l％，醇類、酚等底物在培養(yǎng)基中含量一般為0.1％一0.2％，氨基酸的含量一般為0.5％。因碳?xì)浠衔锊蝗苡谒?，可在液體中撮搞培養(yǎng)或加入45℃三，實(shí)驗(yàn)材料(1)菌種大腸桿菌(E.coli)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。(2)培養(yǎng)基細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基(附錄Ⅲ—5)。試驗(yàn)時(shí)，往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加糖類1％或醇、酚0.1％—0.2％，或氨基酸0.5％。四、方法與步驟將實(shí)驗(yàn)菌種首先制成懸液，以避免帶人少量碳源而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果．平板接種用接種環(huán)點(diǎn)種，液體培養(yǎng)基用直針接種．每一測(cè)定苗都必須接種未加碳水化合物的空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對(duì)照。適溫培養(yǎng)2、5、7D后觀察。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果凡測(cè)定菌在有碳水化合物的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況明顯超過(guò)在空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基的生長(zhǎng)量者為陽(yáng)性，否則為陰性。如兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況差別不明顯，可在同一培養(yǎng)基上連續(xù)移種三次，如差別仍不明顯，則為陰性。

實(shí)驗(yàn)四丙二酸鹽試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解丙二酸鈉試驗(yàn)的用途及原理．2、學(xué)習(xí)丙二酸試驗(yàn)的操作技術(shù)。二、原理由于微生物的酶系統(tǒng)不同，故有的菌能利用醋酸鹽作為氮源，有的菌則不能，當(dāng)醋酸鹽被分解利用后，培養(yǎng)基中產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使培養(yǎng)基縣堿性，促使培養(yǎng)基中酸堿指示劑麝香草酚藍(lán)由綠色變成藍(lán)色，可利用此反應(yīng)來(lái)鑒別有關(guān)微生物。三、實(shí)驗(yàn)材料(1)菌種大腸桿菌(Esch~ichiacoli)及沙門氏菌（Salmonellasp）(2)培養(yǎng)基丙二酸鈉培養(yǎng)墓(附錄Ⅲ—6)。(3)其它酒精棉球，酒精燈，接種環(huán)，恒溫箱等．四、方法與步驟取丙二酸鈉培養(yǎng)基試管三支，于其上分別做好培養(yǎng)基名稱和“大腸桿菌”及“沙門氏菌”及“空白對(duì)照”等標(biāo)記。然后對(duì)應(yīng)地將菌種接入丙二酸鈉培養(yǎng)基試管中，連同空白對(duì)照置于37℃五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果培養(yǎng)基由綠色變成藍(lán)色者，表明實(shí)驗(yàn)菌能利用醋酸鹽作為碳源，故丙二酸鈉實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，，記“十”號(hào)，培養(yǎng)基不變藍(lán)色者為陰性，否則記“一”

實(shí)驗(yàn)五葡萄糖銨試驗(yàn)—、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?)了解葡萄糖銨試驗(yàn)的用途及原理。2)學(xué)習(xí)掌握葡萄糖銨試驗(yàn)的操作技術(shù)。二、原理有的菌種能利用銨鹽作為氮源而生長(zhǎng)，有的菌則不能用，在葡萄糖銨培養(yǎng)基中。磷酸二銨是唯一的氮源，故以能否在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)來(lái)作為鑒別有關(guān)細(xì)菌的依據(jù)之一。三、實(shí)驗(yàn)材料菌種大腸桿菌(Escherichiacoli)和福氏志賀菌（Shigelleflexneri）2)培養(yǎng)基葡萄糖銨培養(yǎng)基(附錄Ⅲ-8),普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面。3)其它酒精棉球，酒精燈，接種針，無(wú)菌生理鹽水8mL(二支)．四、方法與步驟做標(biāo)記取葡萄糖銨培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面、無(wú)菌生理鹽水個(gè)2支，分別于其上做好培養(yǎng)基名稱和菌名等標(biāo)記。制備菌懸液將苗種相應(yīng)接人理鹽水管內(nèi)，研磨并攪動(dòng)使其均勻。要求每一接種環(huán)內(nèi)含菌數(shù)在20—100個(gè)為宜（或肉眼觀察不見渾濁）。接種用無(wú)菌接種環(huán)分別取大腸桿菌菌液一環(huán)，在對(duì)應(yīng)的葡萄糖銨斜面培養(yǎng)基和普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上劃線接種，并以同樣的方法接種福氏志賀菌。培養(yǎng)將種接好的試管置36℃土1五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果在葡萄糖銨斜面上有正常大小菌落生長(zhǎng)者為葡萄糖銨試驗(yàn)陽(yáng)性，記“十”號(hào)；不生長(zhǎng)或只生長(zhǎng)為極微小的菌落，而在對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好者，為陰性，否則記“一”

實(shí)驗(yàn)六酪蛋白分解試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1)了解酪蛋白分解試驗(yàn)的用途及原理．(2)學(xué)習(xí)酪蛋白分解試驗(yàn)的操作技術(shù)．二、原理某些菌具有酪蛋白分解酶，而有的菌則不具有。具有酪蛋白分解酶的細(xì)菌在蛋白瓊脂平板上可分解酪蛋白而令菌落周圍形成透明圈。三、實(shí)驗(yàn)材料（1）菌種蠟樣牙孢桿菌和球形芽孢桿菌。(2)培養(yǎng)基酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基平板(附錄Ⅲ—19)(3)其它酒精棉球，酒精燈，接種環(huán)，恒溫箱等。四、方法與步驟以劃線接種法將試驗(yàn)菌接種于酪蛋白培養(yǎng)基上，然后置37℃恒溫箱培養(yǎng)1—五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果平板中菌落周圍有透明圈者，為酪蛋白分解試驗(yàn)陽(yáng)性。反之為陰性．***注：1、培養(yǎng)基在倒時(shí)要搖勻（因?yàn)槔业鞍撞蝗芙猓?、倒好后，培養(yǎng)基放置時(shí)間要較長(zhǎng)（凝固時(shí)間較長(zhǎng)）

實(shí)驗(yàn)七細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1)了解細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)的用途與原理．(2)學(xué)習(xí)細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)的操作技術(shù)．二、原理在不以氧為直接受氫體的生物氧化體系中，生物氧化需要在多種酶聯(lián)合作用下方能進(jìn)行。組成這類生物氧化體系的酶，主要是細(xì)胞色素類酵。這種酶在有分子氧與脫氫酶的存在下，可氧化二甲基對(duì)苯撐二胺和α—萘酚成吲哚酚藍(lán)，其反應(yīng)式同氧化酶試驗(yàn)．三、實(shí)驗(yàn)材料(1)菌種大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草桿菌(13acill~subtilis)。(2)試劑同氧化酶試驗(yàn)。四、方法與步驟取37℃培養(yǎng)20h的斜面培養(yǎng)物一支，將兩種試劑各2—五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果在兩分鐘內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)色者為陽(yáng)性，2min以后出現(xiàn)微弱或可疑反應(yīng)者均作為陰性結(jié)果.

實(shí)驗(yàn)九淀粉水解試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1)了解淀粉水解試驗(yàn)的原理及用途。(2)學(xué)習(xí)淀粉水解試驗(yàn)的操作技術(shù)。二、原理許多菌產(chǎn)生淀粉酶，能把培養(yǎng)基中的淀粉水解為無(wú)色糊精的等小分子，或進(jìn)—分解為麥芽糖和葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色．三、實(shí)驗(yàn)材料(1)菌種大腸桿菌(Escherichiacoil)和枯草芽抱桿酶(Bacillussubtilis)。(2)培養(yǎng)基在肉湯蛋白胨瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分裝0.1MPa20min滅菌。(3)試劑路哥氏碘液(附錄1—3．2)‘(4)其它酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。四，方法與步驟將培養(yǎng)基熔化，倒成平板，凝固后，取菌種點(diǎn)種于平板上，每皿可點(diǎn)3—5個(gè)菌，37℃恒溫箱培養(yǎng)2—五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果取培養(yǎng)好的平皿，在平板上滴加路哥氏碘液以鋪滿菌落周圍為度，平板呈藍(lán)色，而菌落周圍如有無(wú)色透明圈出現(xiàn)，說(shuō)明淀粉已被水解，稱淀粉水解試驗(yàn)陽(yáng)性。透明圈的大小一般說(shuō)明水解淀粉能力的大小。

實(shí)驗(yàn)八過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)—，實(shí)驗(yàn)?zāi)康?)了解過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)的用途與原理。2)學(xué)習(xí)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)的操作技術(shù)。二、原理在以需氧脫氫酶催化的氧化體系中，氧原子接受電子后，即與溶液中氫離子結(jié)合，生成過(guò)氧化氫，此物對(duì)微生物有毒性。有的菌具有過(guò)氧化氧酶，可將其分解成水和氧，但有的菌不具有此酶．故過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)是鑒別菌種的依據(jù)之一。三、實(shí)驗(yàn)材料(1)菌種大腸桿菌(Escherichiacoli)和某種乳酸桿菌(Lactobacillussp)。(2)培養(yǎng)基肉湯培養(yǎng)基(附錄Ⅱ—1．1),麥汁培養(yǎng)基.(3)試劑3%過(guò)氧化氫溶液．(4)其它酒精棉球，酒精燈，潔凈小試管，接種環(huán)等。四、方法與步驟從斜面挑取一環(huán)菌種置于潔凈試管內(nèi)，滴加3%過(guò)氧化氫溶液約2mL,觀察結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果于半分鐘內(nèi)產(chǎn)生氣泡者，為過(guò)氧化氧酶試驗(yàn)陽(yáng)性；不發(fā)生氣泡者，為陰性。

菌落總數(shù)測(cè)定范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中菌落總數(shù)的測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品中菌落總數(shù)的測(cè)定。術(shù)語(yǔ)與定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。2.1菌落總數(shù)食品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)后（培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、PH、需氧性質(zhì)等），所得1ml（或1g）檢樣中形成菌落的總數(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的培養(yǎng)條件下所得結(jié)果，只包括一群在平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)發(fā)育的嗜中溫需氧菌或兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：3.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃，33.2冰箱：2℃~53.3恒溫水浴箱：46℃±13.4天平：感量0.1g.3.5均質(zhì)器。3.6振蕩器。3.7無(wú)菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸頭。3.8無(wú)菌錐形瓶：容量250ml、500ml。3.9無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm3.10PH計(jì)或PH比色管或精密PH試紙。3.11放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器或petrifilm自動(dòng)判讀儀。4培養(yǎng)基和試劑4.1平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：見第A..1章。4.2磷酸鹽緩沖液：見第A..2章。4.3無(wú)菌生理鹽水：稱取8.5g氯化鈉溶于100ml蒸餾水中，1214.41mol/L氫氧化鈉（NaOH）：稱取40g氫氧化鈉溶于1000ml蒸餾水中。4.51mol/L鹽酸（HCL）:移取濃鹽酸90ml用蒸餾水稀釋1000ml。4.6petrifilm菌落總數(shù)測(cè)試片和壓板。第一法平板菌落計(jì)數(shù)法5檢驗(yàn)程序菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序見圖1檢樣檢樣25g（或25ml）樣品+225ml稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2個(gè)~3個(gè)適宜樣品勻液，各取1ml分別加入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)每皿中加入15ml~20ml平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，混勻培養(yǎng)36℃±48h±2h計(jì)數(shù)各平板菌落數(shù)計(jì)數(shù)菌落總數(shù)報(bào)告圖1菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序操作步驟樣品的稀釋固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min,或放入盛有225ml稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min,制成1：10的樣品勻液。液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25ml樣品置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻,制成1：10的樣品勻液。用1ml無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1ml，沿管壁緩慢注于盛有9ml稀釋液的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用一支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。按6.1.3操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用一次1ml無(wú)菌吸管或吸頭。根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)~3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1ml樣品勻液加入兩個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)。同時(shí)分別取1ml稀釋液加入兩個(gè)無(wú)菌平皿左空白對(duì)照。及時(shí)將15ml~20ml冷卻至46℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46℃±培養(yǎng)6.2.1瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。水產(chǎn)品30℃±3h.6.2.2如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4ml），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按6.2.1條件進(jìn)行培養(yǎng)。6.3菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-formingunits,CFU）表示。選取菌落數(shù)在30CPU~300CPU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù);若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果的表述菌落總數(shù)的計(jì)算方法若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克（或毫升）中菌落總數(shù)結(jié)果。7.1.2若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按式（1）計(jì)算：式中：N-----樣品中菌落數(shù)；∑C-----平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和；n1-----第一個(gè)適宜稀釋度平板上的菌落數(shù)；n2-----第二個(gè)適宜稀釋度平板上的菌落數(shù)；d-----稀釋因子（第一稀釋度）。示例：稀釋度1；100（第一稀釋度）1；100（第二稀釋度）菌落數(shù)232，24433，357.1.3若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均大于300，則對(duì)所有稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)。7.1.4若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均若有所有稀釋度的平板菌落數(shù)均少于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)7.1.5若所有稀釋度（包括液體樣品原液）的平板均無(wú)菌落數(shù)生成，則以少于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)。7.1.6若所有稀釋度的菌落數(shù)均不在30~300之間，其中一部分小于30或大于300時(shí)，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.2菌落總數(shù)的報(bào)告7.2.1菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字報(bào)告。7.2.2大于或等于100時(shí)，第三位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取用兩位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式表示，按四舍五入原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。7.2.3若所有平板上蔓延菌落而無(wú)法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。7.2.4若空白對(duì)照有菌落生成，則這次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。7.2.5稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/ml為單位報(bào)告。第二法菌落總數(shù)PetrifilmTM測(cè)試片法

8檢驗(yàn)程序

除將平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基改成PetrifilmTM菌落總數(shù)測(cè)試片外，其他與第5章相同。

9操作步驟

9.1樣品的稀釋

按照6.1.1-6.1.2制備1:10的樣品勻液后，用1mol/L氫氧化鈉（NaOH）或1mol/L鹽酸(HCL）調(diào)節(jié)pH至6.6-7.2。

9.2接種

根據(jù)對(duì)樣本污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)~3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液進(jìn)行檢驗(yàn)。將測(cè)試片置于平坦實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面，揭開上層膜，用吸管或微量移液器吸取1mL樣品勻液，垂直滴加在測(cè)試片的中央，將上層膜蓋下，允許上層膜直接落下，但不要滾動(dòng)上層膜，將壓板（凹面底朝下）放置在上層膜中央，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)膜上，切勿扭轉(zhuǎn)壓板。拿起壓板，靜置至少1min以使培養(yǎng)基凝固。每個(gè)稀釋度接種兩張測(cè)試片。

9.3培養(yǎng)

將測(cè)試片的透明面朝上，水平置于培養(yǎng)箱內(nèi)?？啥询B至20片，培養(yǎng)溫度和時(shí)間同6.2。

9.4計(jì)數(shù)

9.4.1培養(yǎng)結(jié)束后立即計(jì)數(shù)，可肉眼觀察計(jì)數(shù)，或用菌落計(jì)數(shù)器、放大鏡、PetrifilmTM自動(dòng)判讀儀計(jì)數(shù)。選取菌落數(shù)在30-300之間的測(cè)試片計(jì)數(shù)。

9.4.2計(jì)數(shù)所有紅色菌落。細(xì)菌濃度很高時(shí)，整個(gè)測(cè)試片會(huì)變成紅色或粉紅色，將結(jié)果記錄為“多不可計(jì)”。

9.4.3有時(shí)，當(dāng)細(xì)菌濃度很高時(shí)，測(cè)試片中央沒(méi)有可見菌落，但圓形培養(yǎng)膜的邊緣有許多小的菌落，其結(jié)果也記錄為“多不可計(jì)”；進(jìn)一步稀釋樣品可獲得準(zhǔn)確的讀數(shù)。

9.4.4某些微生物會(huì)液化凝膠，造成局部擴(kuò)散或菌落模糊的現(xiàn)象。如果液化現(xiàn)象干擾計(jì)數(shù)，可以計(jì)數(shù)未液化的面積來(lái)估算菌落數(shù)。

10結(jié)果的表述同第7章附錄A(規(guī)范性附錄)培養(yǎng)基和試劑A1平板計(jì)數(shù)瓊脂(platecountagar，PcA)培養(yǎng)基A11成分胰蛋白胨5酵母浸膏2葡萄糖1瓊脂15蒸餾水1000mLpH7.0士0.2A12制法將上述成分加于蒸餾水巾A2磷酸鹽緩沖液A21成分磷酸二氫鉀(KH2P04)蒸餾水PH7.2A22制法GB／T47892—2∞8煮沸溶解，調(diào)節(jié)PH。分裝試管或錐形瓶，121℃34.0g500mL貯存液：稱取34.0g的磷酸_二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約1液調(diào)節(jié)pH至7.2，蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液l.25mL，用蒸餾水稀釋至l000mL，分裝于適宜容器中，121℃

大腸桿菌計(jì)數(shù)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群計(jì)數(shù)的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。2術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。2.1大腸菌群coliforms一群在362.2最可能數(shù)mostprobablenumber；MPN基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：3.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±3.2冰箱：2℃～53.3恒溫水浴箱：46℃±13.4天平：感量0.1g。3.5均質(zhì)器。3.6振蕩器。3.7無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器吸頭。3.8無(wú)菌錐形瓶：容量500mL。3.9無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。3.10pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。3.11菌落計(jì)數(shù)器或Pertrifilm自動(dòng)判讀儀。培養(yǎng)基和試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白棟（laurylsulfatetryptose，LST）肉湯：見第A.1章?；途G乳糖膽鹽（brilliantgreenlactosebile，BGLB）肉湯：見第A.2章。結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（violetredbileagar，VRBA）：見第A.3章。磷酸鹽緩沖液：見第A.4章?！狿ctrifilmtm是由3M公司提供的產(chǎn)品的商品名，給出這一個(gè)薪資是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效的產(chǎn)品。GB/T4789.3－20084.5無(wú)菌生理鹽水：稱取8.5g氯化鈉溶于100mL蒸餾水中，121℃4.61mol/L氫氧化鈉（NaOH）：稱取40g氫氧化鈉溶于1000mL蒸餾水中。4.71mol/L鹽酸（Hcl）：移取農(nóng)鹽酸90mL,用蒸餾水稀釋至1000mL4.8Petrifilm?大腸菌群檢驗(yàn)測(cè)試片和壓板。第一法大腸菌群MPN計(jì)數(shù)檢驗(yàn)程序檢樣檢樣25g（或25mL）樣品＋225mL稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋10倍系列稀釋 選擇適宜三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種LST肉湯管選擇適宜三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種LST肉湯管36℃＋1℃48h±不產(chǎn)氣 不產(chǎn)氣產(chǎn)氣產(chǎn)氣BGLB肉湯BGLB肉湯36℃＋1℃48h±產(chǎn)氣不產(chǎn)氣產(chǎn)氣不產(chǎn)氣大腸桿菌陽(yáng)性大腸桿菌陰性大腸桿菌陽(yáng)性大腸桿菌陰性查MPN表查MPN表報(bào)告結(jié)果報(bào)告結(jié)果圖1大腸菌群MPN計(jì)數(shù)檢驗(yàn)程序操作步驟6.1樣品的稀釋6.1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min，或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min，制成1：10的樣品勻液。6.1.2液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品，置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)與之適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，置盛1：10的樣品勻液。6.1.3樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，必要時(shí)分別用1mol/L氫氧化鈉（NaOH）或1mol/L鹽酸（Hcl）調(diào)節(jié)。6.1.4用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1mL，巖管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或用1支1mL無(wú)菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。6.1.5根據(jù)對(duì)樣品污染的狀況估計(jì)，按上述操作，依次制成10倍遞增系稀釋樣品勻液。美遞增稀釋1次，換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全程不過(guò)15min。6.2初發(fā)酵試驗(yàn)每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接3管月桂基硫酸鹽胰蛋白（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過(guò)1mL，則用雙料LST肉湯），36℃±1℃培養(yǎng)24h復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)用接種環(huán)從所有48h±2h內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種與煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)7檢驗(yàn)程序大腸菌群平板計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序見下圖2檢樣25g檢樣25g（或25mL）樣品＋225mL稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋10倍系列稀釋選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，接種VRBA平板選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，接種VRBA平板36℃＋1℃48h±計(jì)數(shù)典型和可疑菌落計(jì)數(shù)典型和可疑菌落BGLG肉湯或復(fù)發(fā)試驗(yàn)BGLG肉湯或復(fù)發(fā)試驗(yàn)報(bào)告結(jié)果36℃＋1℃48h±報(bào)告結(jié)果圖2大腸菌群平板計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序GB/T4789.3—20088操作步驟8.1樣品的稀釋按6.1進(jìn)行。8.2平板計(jì)數(shù)8.2.1選取2個(gè)～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)無(wú)菌平皿，每皿1mL。同時(shí)分別取1mL生理鹽水加入兩個(gè)無(wú)菌平皿作空白對(duì)照。8.2.2及時(shí)將15mL～20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±8.3平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在30～150之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。8.4證實(shí)試驗(yàn)從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±18.5大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以8.3中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（每毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽(yáng)性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×10-4/g（mL）=6.0×105CFU/g（CFU/mL）。第三法大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試片法9檢驗(yàn)程序大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試片法的檢驗(yàn)程序見圖3檢樣檢樣25g（或25mL）樣品＋225mL稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋10倍系列稀釋選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，接種選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，接種PetrifilmTM測(cè)試片36℃36℃＋1℃24h計(jì)數(shù)紅色帶氣泡的的菌落的菌落計(jì)數(shù)紅色帶氣泡的的菌落的菌落報(bào)告結(jié)果報(bào)告結(jié)果圖3大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試片計(jì)數(shù)法程序圖GB/T4789.3—200810操作步驟樣品的稀釋按6.1進(jìn)行。測(cè)定樣品接種及培養(yǎng)將待檢樣品選取2個(gè)～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種兩張測(cè)試片。將PetrifilmTM大腸菌群測(cè)試片置于平坦實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，揭開上層膜，用吸管吸取1mL樣液垂直滴加在測(cè)試片的中央，將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產(chǎn)生和上層膜直接落下。把壓板（平面底朝下）放置在上層膜中央，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)面積上，切勿扭轉(zhuǎn)壓板。拿起壓板，靜置至少1min以使培養(yǎng)基凝固。將測(cè)試片的透明面朝上置于培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不超過(guò)20片，36℃±1℃培養(yǎng)24h±10.2.2判讀培養(yǎng)24h±2h后應(yīng)立即計(jì)數(shù)，可目測(cè)或用標(biāo)準(zhǔn)菌落計(jì)數(shù)器、放大鏡或PetrifilmTM自動(dòng)判讀儀來(lái)計(jì)數(shù)。紅色有氣泡的菌落確定認(rèn)為大腸菌群。圓形培養(yǎng)區(qū)邊緣上及邊緣以外的菌落不作計(jì)數(shù)。當(dāng)培養(yǎng)區(qū)域出現(xiàn)大量氣泡，大量不明顯小菌落或培養(yǎng)區(qū)呈暗紅色三種情況，表明大腸菌群的濃度較高，需要進(jìn)一步稀釋樣品以獲得更準(zhǔn)確的讀數(shù)。10.3大腸菌群測(cè)試片計(jì)數(shù)的報(bào)告選取菌落數(shù)在15～150之間的測(cè)試片，計(jì)數(shù)其紅色有氣泡的菌落數(shù)，兩個(gè)測(cè)試片的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即為每克（或毫升）樣品中的大腸菌群菌落形成單位（CFU）數(shù)。如果所有稀釋度測(cè)試片上的菌落數(shù)都小于15。則計(jì)數(shù)稀釋度最低的測(cè)試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如果所有稀釋度的測(cè)試片上均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告；如果最高稀釋度的菌落數(shù)大于150，計(jì)數(shù)最高稀釋度的測(cè)試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。計(jì)數(shù)菌落數(shù)大于150的測(cè)試片時(shí)，可計(jì)數(shù)一個(gè)或兩個(gè)具有代表性的方格內(nèi)的菌落數(shù)，換算成單個(gè)方格內(nèi)的菌落數(shù)后乘以20即為測(cè)試片上估算的菌落數(shù)（圓形生長(zhǎng)面積為20cm2）。報(bào)告單位以CFU/g（或CFU/mL）表示。GB/T4789.3—2008附錄A(規(guī)范性附錄)培養(yǎng)基和試劑A.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯A.1.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化鈉5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀（K3HPO4）2.75g磷酸二氫鉀（KH2PO4）2.75g月桂基磺酸鈉0.1g蒸餾水1000mlPH6.8±0.2A.1.2制法將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)解PH。煮沸2min，將培養(yǎng)基冷卻至45℃~A.4磷酸鹽緩沖液A.4.1成分磷酸二氫鉀（KH2PO4）34.0g蒸餾水500mlPH7.2A.4.2制法貯存液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500ml蒸餾水中，用大約175ml的1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)解PH至7.2，用蒸餾水稀釋至1000ml后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液1.25ml，用蒸餾水稀釋至1000ml，分裝于適宜容器中，121℃GB/T4789.3-2008附錄B（規(guī)范性附錄）大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表每克（或毫升）的檢索見表B.1表B.1大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表陽(yáng)性管數(shù)MPN95%可信限陽(yáng)性管數(shù)MPN95%可信限0.100.010.001下限上限0.100.010.001下限上限000000111111112222220011230001122300011101010001201010012012﹤3.03.03.06.16.29.43.67.2117.4111115169.21420152027——0.150.151.21.23.60.171.33.61.33.63.64.54.51.43.64.53.74.58.79.59.611181838181838203842424238424242429422222333333333333333222330001111222233330120101201230123012321283529362338644375120160931502102902404601100﹥11004.58.78.78.78.74.68.71791737401837409042901804204294949494941101801802004204204204204301000100020004100——注1：本表采用3個(gè)稀釋度〔0.1g（或0.1ml）、0.01g(或0.01ml)和0.001ml〕〕,每個(gè)稀釋度接種3管注2：表內(nèi)所列檢樣量如改用1g(或1ml)、0.1g(或o.1ml)和0.01g(或0.01ml)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用0.01g(或0.01ml)、0.001g(或0.001ml)、0.0001g(或0.0001ml)時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字相應(yīng)增高10倍，其余類推。

沙門氏菌檢驗(yàn)1.范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品和食物中毒樣品中沙門氏菌的檢驗(yàn)。2設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下。2.1冰箱:2℃~2.2恒溫培養(yǎng)箱:36℃士1℃,42.3均質(zhì)器。2.4振蕩器。2.5電子天平;感量0.1g2.6無(wú)菌錐形瓶:容量500ml,250ml2.7無(wú)菌吸管:1ml(具0.0lml，刻度),10ml(具0.1ml刻度)或微量移液器及吸頭。2.8無(wú)菌培養(yǎng)皿:直徑90mm2.9無(wú)菌試管:3mmX50mm,10mmX75mm2.10無(wú)菌毛細(xì)管。2.11pH計(jì)或PH比色管或精密pH試紙。2.12全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)(VITEK)1)3培養(yǎng)基和試劑3.1緩沖蛋白胨水(BPW):見第A.1章。3.2四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液:見第A.2章。3.3亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液:見第A.3章。3.4亞硫酸秘(BS)瓊脂:見第A.4章。3.5HE(HektoenEnteric)瓊脂:見第A.5章。3.6木糖賴氨酸脫氧膽鹽<XLD)瓊脂:見第A.6章。3.7科瑪嘉沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基z>3.8三糖鐵(TSI)瓊脂:見第A.7章。3.9蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑:見第A.8章。3.10尿素瓊脂(pH7.2>:見第A.9章。3.11氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基:見第A.10章。3.12賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基:見第A.11章。⑴由法國(guó)生物梅里埃公司提供的產(chǎn)品的商品名。給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效的產(chǎn)品。⑵由法國(guó)科瑪嘉公司提供的產(chǎn)品的商品名。給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效的產(chǎn)品。GB/T4789.4－20083.13糖發(fā)酵管:見第A.12章。3.14鄰硝基酚β－D半乳糖昔(ONPG)培養(yǎng)基:見第A.13章。3.15半固體瓊脂:見第A.14章。3.16丙二酸鈉培養(yǎng)基:見第A.15章。3.17沙門氏菌O和H診斷血清。3.18API20E生化鑒定試劑盒或VITEKGNI"生化鑒定卡’。4檢驗(yàn)程序沙門氏菌檢驗(yàn)程序見圖1檢樣檢樣25g(ml)+225mlBPW=1ml+TTP10ml1ml+SC10mlBSXLD(或HE、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基)挑取可疑菌落TSI，賴氨酸，營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA），靛基質(zhì)，尿素（PH7.2）,氰化鉀（KCN）商品化生化鑒定系統(tǒng)H2S+靛基質(zhì)-尿素-KCN-賴氨酸+H2S+靛基質(zhì)+尿素-KCN-賴氨酸+H2S-靛基質(zhì)-尿素-KCN-賴氨酸+/-反應(yīng)結(jié)果與左側(cè)描述不符甘露醇+、山梨醇+ONPG-沙門氏菌，血清學(xué)試驗(yàn)非沙門氏菌報(bào)告36℃±142℃±136℃±136℃±136℃±15操作步驟5.1前增菌稱取25g(ml)樣品放人盛有225mlBPW的無(wú)菌均質(zhì)杯中，以8000r/min^"10000r/min均質(zhì)1min^－2min，或置于盛有225m工JBPW的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min^}2min。若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。如需要，測(cè)定pH值，用1mol/ml無(wú)菌氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH至6.8士0.2。無(wú)菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500ml錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)，于36℃士1℃培養(yǎng)8h如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45℃以下不超過(guò)15min，或2℃^}5.2增菌輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)的樣品混合物,移取1ml，轉(zhuǎn)種于10mlTTB內(nèi)，于42℃士1℃培18h同時(shí)，另取1ml，轉(zhuǎn)種于10mlSC內(nèi)，于36℃士1℃5.3分離分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)BS瓊脂平板和一個(gè)XLD瓊脂平板(或HE瓊脂平板或科瑪嘉顯色培養(yǎng)基平板)。于36℃士1℃分別培養(yǎng)18h~24h(XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基平板)或表1沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門氏菌BS瓊脂菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色;有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變HE瓊脂藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色;有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色XLD瓊脂菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落;有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心科瑪嘉顯色培養(yǎng)基菌落為紫紅色5.4生化試驗(yàn)5.4.1自選擇性瓊脂平板上分別挑取兩個(gè)以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺;接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫梭酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，于36℃士118h~24h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48h。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫梭酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)，沙門氏菌屬的反應(yīng)結(jié)果見表20表2沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫梭酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果三糖鐵瓊脂賴氨酸脫梭酶試驗(yàn)培養(yǎng)基初步判斷斜面底層產(chǎn)氣硫化氫—++(一)+(一)+可疑沙門氏菌屬—++(一)+(一)_可疑沙門氏菌屬+++(一)+(一)+可疑沙門氏菌屬+++/一+/一_非沙門氏菌注:+陽(yáng)性，一陰性;+(一)多數(shù)陽(yáng)性，少數(shù)陰性;+/一陽(yáng)性或陰性。GB/T4789.4－2008表2說(shuō)明，在三糖鐵瓊脂內(nèi)斜面產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，同時(shí)賴氨酸脫梭酶試驗(yàn)陰性的菌株可以排除。其他的反應(yīng)結(jié)果均有沙門氏菌屬的可能，同時(shí)也均有不是沙門氏菌屬的可能。5.4.2接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫竣酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的同時(shí)，可直接接種蛋白陳水(供做靛基質(zhì)試驗(yàn))、尿素瓊脂(pH7.2),氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于36℃±1℃培養(yǎng)18h于2℃±5℃表3沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號(hào)硫化氫(H,S)靛基質(zhì)pH7.2尿素氰化鉀KCN賴氨酸脫羧酶A1+－－－+A2++－－+A3－－－+/－注：+陽(yáng)性；－陰性；+（－）陽(yáng)性或陰性5.4.2.2反應(yīng)序號(hào)A1典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素。氰化鉀和賴氨酸脫羧酶3項(xiàng)中有1項(xiàng)異常。按表4可判定為沙門氏菌。如有2項(xiàng)異常為非沙門氏菌表4沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表pH7.2尿素氰化鉀（KCN）賴氨酸脫羧酶判定結(jié)果———甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）—++沙門氏菌IV或V（要求符合本群生化特性）+—+沙門氏菌個(gè)別變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）+表示陽(yáng)性，—表示陰性。5.4.2.2反應(yīng)序號(hào)A2：補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn)，沙門氏菌靛基質(zhì)陽(yáng)性變體兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。5.4.2.3反應(yīng)序號(hào)A3：補(bǔ)做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌，同時(shí)賴氨酸脫羧酶陽(yáng)性，甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。5.4.2.4必要時(shí)按表5進(jìn)行沙門氏菌生化群的鑒別。表5沙門氏菌屬各生化群的鑒別項(xiàng)目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ衛(wèi)矛醇++——+—山梨醇+++++—水楊苷———+——ONPG——+—+—丙二酸鹽—++———氰化鉀（KCN）———++—注：+表示陽(yáng)性—表示陰性。5.4.3如選擇API20E生化鑒定試劑盒或VITEK全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，可根據(jù)5.4.1的初步判斷結(jié)果，從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙?，使用API20E生化鑒定試劑盒或VITEK全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。GIi/T4789.4－2008食品中乳酸菌檢驗(yàn)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lacticacidbacteria）的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于含活性乳酸菌的固體、半固體和液體食品中乳酸菌的檢驗(yàn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T4789.34食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)雙歧桿菌檢驗(yàn)3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1乳酸菌lacticacidbacteria一類可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱。與食品工業(yè)密切相關(guān)的乳酸菌主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和鏈球菌屬（Streptococcus）中的嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus）等。4設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下。4.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃4.2冰箱：2℃～5℃4.3均質(zhì)器及無(wú)菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳體。4.4天平：感量0.1g。4.5無(wú)菌試管：18mm×180mm、15mm×100mm。4.6無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。4.7無(wú)菌錐形瓶：500mL、250mL、5培養(yǎng)基和試劑5.1API50CH生化鑒定試劑盒①。5.2MRS（manrogosasharpe）培養(yǎng)基：見第A.1章。5.3MC（modifiedchalmers）培養(yǎng)基：見第A.2章。5.40.5%蔗糖發(fā)酵管：見第A.3章。5.50.5%纖維二糖發(fā)酵管：見第A.3章。①由法國(guó)生物梅里埃公司提供的產(chǎn)品的商品名。給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效的產(chǎn)品。0.5%麥芽糖發(fā)酵管：見第A.3章.0.5%甘露醇發(fā)酵管：見第A.3章.0.5%水楊苷發(fā)酵管：見第A.3章.0.5%山梨醇發(fā)酵管：見第A.3章.0.5%乳酸發(fā)酵管：見第A.3章.七葉苷發(fā)酵管.見第A.4章.革蘭氏染色液:見第A.5章6檢驗(yàn)程序乳