染色質(zhì)免疫沉淀專家講座

基因型決定表型染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第1頁(yè)破壞了基因型也就改變了表型染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第2頁(yè)不過(guò)，也有一些無(wú)法解釋現(xiàn)象在對(duì)應(yīng)基因堿基序列沒(méi)有發(fā)生改變情況下，一些生物體表型卻發(fā)生了改變。染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第3頁(yè)什么是表觀遺傳學(xué)?是DNA及其染色質(zhì)環(huán)境穩(wěn)定改變，這些可遺傳改變并不包括DNA序列突變。染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第4頁(yè)表觀遺傳修飾

在不影響DNA序列情況下改變基因組修飾，不但能夠影響個(gè)體發(fā)育，而且還能夠遺傳下去。這類變異被稱為“表觀遺傳修飾”，并被認(rèn)為是造成遺傳物質(zhì)一致孿生子出現(xiàn)個(gè)體差異主要原因。染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第5頁(yè)染色質(zhì)重塑染色質(zhì)重塑在廣義上是指染色質(zhì)結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)調(diào)整或重新塑造染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。在一些核內(nèi)因子作用下，染色質(zhì)DNA與其包繞關(guān)鍵組蛋白之間親和力改變或相對(duì)位置改變使得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得較為渙散，DNA更易于暴露。染色質(zhì)重塑就是經(jīng)過(guò)這么改變來(lái)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。在狹義上，染色質(zhì)重塑專指由ATP提供能量、經(jīng)過(guò)依賴于ATP染色質(zhì)重塑復(fù)合物改變組蛋白與DNA結(jié)合狀態(tài)，在靠近關(guān)鍵組蛋白DNA表面建立特殊構(gòu)象，使轉(zhuǎn)錄因子較易于靠近DNA過(guò)程。染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第6頁(yè)染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)發(fā)展使染色質(zhì)重塑研究得以進(jìn)步染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第7頁(yè)試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)學(xué)習(xí)掌握染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)基本原理與關(guān)鍵操作步驟。染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第8頁(yè)試驗(yàn)原理染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第9頁(yè)試驗(yàn)流程一、交聯(lián)及染色質(zhì)DNA剪切條件優(yōu)化準(zhǔn)備一瓶靠近長(zhǎng)滿HeLa細(xì)胞，向培養(yǎng)液中加入37%甲醛至終濃度為1%，輕輕搖勻，在37℃孵育10分鐘。

①甲醛作用②細(xì)胞用量③交聯(lián)條件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷至4℃帶蛋白酶抑制劑PMSF1×PBS洗細(xì)胞兩次，刮細(xì)胞到一個(gè)2ml離心管，rpm，4℃離心4min搜集細(xì)胞。

染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第10頁(yè)

甲醛作用在各種交聯(lián)試劑中，甲醛（HCHO）應(yīng)用最為廣泛。甲醛濃度、作用時(shí)間及交聯(lián)溫度等均可能影響交聯(lián)程度。甲醛能夠經(jīng)過(guò)賴氨酸、精氨酸和組氨酸以及那些DNA氨基和亞氨基基團(tuán)之間交聯(lián)，高效地在體內(nèi)交聯(lián)蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，形成生物復(fù)合體，預(yù)防細(xì)胞內(nèi)組分重新分布。除此之外，HCHO能夠忠實(shí)地保留染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，而且在溫和條件下交聯(lián)很輕易逆轉(zhuǎn)。通常交聯(lián)所用甲醛終濃度為1%，在12-37℃作用30min。不過(guò)假如反應(yīng)溫度超出30℃，本底就可能增加。所以，當(dāng)必須在高溫進(jìn)行交聯(lián)時(shí)，則應(yīng)降低作用時(shí)間或甲醛濃度。過(guò)分交聯(lián)將影響細(xì)胞裂解，而且在超聲處理時(shí)不能取得理想長(zhǎng)度DNA片段及影響DNA溶解。對(duì)于尤其輕易進(jìn)行交聯(lián)目標(biāo)蛋白質(zhì)（比如，組蛋白）需降低交聯(lián)時(shí)間或甲醛濃度。甲醛交聯(lián)反應(yīng)可被加入甘氨酸終止。染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第11頁(yè)細(xì)胞用量通常2.5×108細(xì)胞足夠進(jìn)行4次免疫沉淀。所以，普通為了確保用量，采取培養(yǎng)多瓶細(xì)胞，胰酶消化，搜集在50ml離心管中，培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)。（普通分裝1х107細(xì)胞于一個(gè)EP管，用于免疫沉淀反應(yīng)）。

交聯(lián)條件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響對(duì)于不一樣細(xì)胞類型，甲醛濃度、交聯(lián)長(zhǎng)度或者交聯(lián)溫度都需要調(diào)整。假如交聯(lián)不充分，會(huì)造成不完全固定，則DNA片段平均長(zhǎng)度會(huì)小于500bp。交聯(lián)過(guò)分時(shí)細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，就算延長(zhǎng)超聲波作用時(shí)間也會(huì)造成主要原料丟失。交聯(lián)時(shí)間假如過(guò)短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性，交聯(lián)時(shí)間通常為5分鐘到1個(gè)小時(shí)，詳細(xì)時(shí)間依據(jù)試驗(yàn)而定。染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第12頁(yè)3.用500μl預(yù)熱至室溫帶有蛋白酶抑制劑SDS裂解液重懸并裂解細(xì)胞，冰浴10分鐘；超聲波處理剪切染色質(zhì)DNA，使其形成300-1000bp即大約相當(dāng)于2-5個(gè)核小體長(zhǎng)度片段；

①超聲條件對(duì)試驗(yàn)影響及超聲注意事項(xiàng)②設(shè)置超聲破碎條件③酶消化與超聲消化相比較區(qū)分染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第13頁(yè)

①超聲條件對(duì)試驗(yàn)影響及超聲注意事項(xiàng)

超聲波是使用機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，輕易引發(fā)升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會(huì)引發(fā)蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響ChIP效率。所以在超聲波斷裂染色質(zhì)時(shí)，要在冰上進(jìn)行，且要設(shè)計(jì)時(shí)斷時(shí)續(xù)超聲程序，確保低溫。另外，超聲探頭要盡可能深入管中，但不接觸管底或側(cè)壁，以免產(chǎn)生泡沫。總超聲時(shí)間也不要太長(zhǎng)，以免蛋白降解。染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第14頁(yè)②設(shè)置超聲破碎條件超聲處理?xiàng)l件通常能夠設(shè)置為10秒每次，共3-4次，功率為50W時(shí)設(shè)置為最大功率30%，采取2mm超聲頭。不一樣超聲處理儀器設(shè)置不太一樣，探索超聲條件時(shí)，能夠先固定其它條件，先確定每次超聲多長(zhǎng)時(shí)間不會(huì)造成顯著發(fā)燒，然后探索不一樣超聲次數(shù)。直至找到比較適當(dāng)超聲次數(shù)能夠使大部分基因組DNA斷裂成200-1000bp大小。需要注意是每次超聲體積和細(xì)胞用量宜固定，不然就不能使用一個(gè)相對(duì)比較固定超聲條件用于后續(xù)試驗(yàn)。染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第15頁(yè)③酶消化與超聲消化相比較區(qū)分MicrococcalNuclease能夠?qū)⑷旧|(zhì)切成一到幾個(gè)核小體，比超聲波處理結(jié)果更精巧，更均一。另外，酶反應(yīng)條件比較溫和，對(duì)DNA和DNA-蛋白復(fù)合物損傷較小，而且蛋白不易變性。酶處理染色質(zhì)適合用于新鮮細(xì)胞或組織樣品和冰凍樣品。在研究組蛋白時(shí)，經(jīng)常采取沒(méi)經(jīng)過(guò)甲醛固定NativeChIP（N-ChIP）研究方法。因?yàn)镹-ChIP沒(méi)經(jīng)過(guò)甲醛固定，超聲波處理會(huì)打斷組蛋白和DNA結(jié)合，所以只能選擇酶處理染色質(zhì)方法。對(duì)于甲醛固定樣品，普通選擇超聲波處理方法。也有研究人員使用酶處理方法研究甲醛固定較溫和樣品。Millipore企業(yè)有商品化MicrococcalNuclease處理ChIP試劑盒（EZ-Enzyme）提供。染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第16頁(yè)Enzyme和sonication處理結(jié)果比較染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第17頁(yè)

超聲處理?xiàng)l件需要優(yōu)化，各試驗(yàn)組可采取不一樣超聲波處理?xiàng)l件，比較剪切效果。按以下步驟操作比較各種條件下剪切效果：a.將超聲處理過(guò)樣品離心搜集上清（4℃13000rpm離心10分鐘），加入10μl0.5MEDTA、20μl1MTris-HClpH6.5、2μl20mg/ml蛋白酶K，45℃孵育0.5-1小時(shí)；b.酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20μlddH2O中，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。試驗(yàn)組12345678超聲次數(shù)3691136911超聲功率15W15W15W15W25W25W25W25W此頁(yè)內(nèi)容不在正常ChIP步驟中染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第18頁(yè)酚/氯仿抽提步驟

按照1：1體積比加酚/氯仿充分混勻后離心，取上層水相至新管，加入1/10體積3MNacl，2倍體積無(wú)水乙醇，大轉(zhuǎn)數(shù)離心5min染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第19頁(yè)5.將超聲處理過(guò)樣品在4℃13000rpm離心10分鐘搜集上清，10倍稀釋，將其移入一新2mlEP管中；6.按照每2ml稀釋后液體加入75μl百分比加入蛋白A-瓊脂糖/鮭精DNA(50%混懸液)，4℃搖動(dòng)30分鐘，預(yù)處理，短暫離心(700-1000rpm4℃，小于1分鐘)，搜集上清液；

①Beads選擇②Input設(shè)置7.向2ml上清液中加入適量抗乙酰化組蛋白H3抗體(20μl)，4℃搖動(dòng)過(guò)夜，陰性對(duì)照組不加抗體一樣搖動(dòng)過(guò)夜；

①抗體選擇②對(duì)照設(shè)置二、免疫沉淀染色質(zhì)DNA片段染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第20頁(yè)

①Beads選擇利用目標(biāo)蛋白質(zhì)特異抗體經(jīng)過(guò)抗原-抗體反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物，然后使用Agarosebeads或Magnabeads沉淀此復(fù)合物，特異性地富集與目標(biāo)蛋白結(jié)合DNA片段。再經(jīng)過(guò)屢次洗滌，除去非特異結(jié)合染色質(zhì)后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復(fù)合物。Magnabeads是近年來(lái)出現(xiàn)一個(gè)新型beads，它使用方便，不像Agarosebeads那樣輕易破裂，所以在操作過(guò)程中更簡(jiǎn)單，而且免去了離心步驟，節(jié)約不少時(shí)間。Millipore企業(yè)最新推出MagnaChIP試劑盒就是采取這種Magnabeads。染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第21頁(yè)免疫共沉淀和染色質(zhì)免疫沉淀input設(shè)置在進(jìn)行免疫沉淀步驟前樣品染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第22頁(yè)染色質(zhì)免疫沉淀抗體選擇ChIPValidated染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第23頁(yè)②對(duì)照設(shè)置ChIP試驗(yàn)最少應(yīng)設(shè)置3種對(duì)照：①未經(jīng)免疫沉淀超聲處理樣本（input）；②陽(yáng)性對(duì)照。普通用組蛋白抗體或anti-RNAPolymeraseII抗體這些比較保守在全部細(xì)胞中都能結(jié)合基因蛋白抗體；③陰性對(duì)照。即用一個(gè)無(wú)關(guān)抗體（或?qū)?yīng)動(dòng)物免疫前血清），與抗目標(biāo)蛋白質(zhì)抗體同時(shí)分別與交聯(lián)染色質(zhì)樣本進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)；④選擇不與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合基因組區(qū)域作對(duì)照，即“基因組對(duì)照”。另外，還應(yīng)依據(jù)對(duì)ChIP不一樣特殊應(yīng)用設(shè)置不一樣試驗(yàn)對(duì)照。比如，試圖檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)是否與某一推測(cè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，則必須將此位點(diǎn)突變后作為對(duì)照；又如，欲測(cè)定突變細(xì)胞株中目標(biāo)蛋白質(zhì)與基因組DNA結(jié)合情況時(shí)，必須用野生型細(xì)胞株作對(duì)照等。染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第24頁(yè)8.加60μl蛋白A-瓊脂糖/鮭精DNA(50%混懸液)，4℃搖1小時(shí)；短暫離心(700-1000rpm，4℃，小于1分鐘)搜集沉淀，分別用低鹽免疫復(fù)合物洗液、高鹽免疫復(fù)合物洗液、LiCl免疫復(fù)合物洗液洗滌沉淀各一次，每種液體每次用1ml，搖動(dòng)3-5分鐘后短暫離心搜集沉淀。然后用一樣方法用TE緩沖液洗滌沉淀兩次三、PCR判定結(jié)合于乙酰化組蛋白H3DNA片段10.向上步所得沉淀中加入250μl洗脫液(1%SDS,0.1MNaHCO3)，震蕩，室溫孵育15分鐘，離心搜集上清；染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第25頁(yè)11.加入10μl0.5MEDTA、20μl1MTris-HClpH6.5、和2μl20mg/ml蛋白酶K，45℃孵育0.5-1小時(shí)；12.酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20μlddH2O中，取1μl作模板，按以下配方加樣，PCR擴(kuò)增試驗(yàn)組和對(duì)照組以及Input組GAPDH開啟子序列，擴(kuò)增條件95℃1分鐘，95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒、30個(gè)循環(huán)，72℃5分鐘，1.5%瓊脂糖電泳檢驗(yàn)結(jié)果。①此步DNA純化能夠選擇適當(dāng)DNA純化試劑盒②PCR策略染色質(zhì)免疫沉淀專家講座第26頁(yè)P(yáng)CR策略

引物選擇取決于試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)。如若判定目標(biāo)蛋白質(zhì)特異結(jié)合位點(diǎn)，除了必須設(shè)計(jì)一對(duì)能使擴(kuò)增片段跨過(guò)該位點(diǎn)引物外，最少還應(yīng)設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增DNA序列中沒(méi)有目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)對(duì)照引物。對(duì)于平均長(zhǎng)度為500bpDNA分子，它大部分片段長(zhǎng)度是500-1000bp，以至遠(yuǎn)離真正結(jié)合位點(diǎn)1000bp處DNA序列很可能被抗體共沉淀下來(lái)。所以，對(duì)照引物擴(kuò)增DNA區(qū)域與試驗(yàn)引物擴(kuò)增DNA區(qū)域之間距離必須大于1000bp。引物設(shè)計(jì)依據(jù)通用引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。有時(shí)為提升擴(kuò)增產(chǎn)