免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)

標(biāo)識(shí)免疫技術(shù)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室三月免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第1頁(yè)標(biāo)識(shí)免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)識(shí)靈敏性特異性標(biāo)識(shí)免疫技術(shù)主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)識(shí)技術(shù)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第2頁(yè)標(biāo)識(shí)免疫技術(shù)免疫測(cè)定技術(shù)免疫組化技術(shù)示蹤物及標(biāo)識(shí)技術(shù)放射免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光技術(shù)金免疫技術(shù)???免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第3頁(yè)第八章放射免疫技術(shù)

類型：放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）免疫放射分析（immunoradiometricassay,IRMA）

廣義放射免疫技術(shù)還包含放射受體分析（使用受體測(cè)量抗原）和放射配體結(jié)合分析（使用配體研究受體）。特點(diǎn):靈敏度高(10-9-10-15g/L)、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第4頁(yè)標(biāo)識(shí)物:慣用核素有兩大類γ射線：131I、125I、57Cr和60Coβ射線：14C、3H和32P。使用最廣泛是：125I①性質(zhì)活潑、易制備標(biāo)識(shí)物②對(duì)被標(biāo)識(shí)物免疫活性影響小③測(cè)量方法簡(jiǎn)便、已推廣④半衰期較長(zhǎng)、核素豐度高免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第5頁(yè)標(biāo)識(shí)方法125I標(biāo)識(shí)原理：取代分子中酪氨酸或酪胺殘基及組胺殘基上氫原子方法：直接標(biāo)識(shí)法

氯胺T法和乳過(guò)氧化物酶法間接標(biāo)識(shí)法

聯(lián)接標(biāo)識(shí)法免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第6頁(yè)適用分子原理特點(diǎn)缺點(diǎn)直接標(biāo)識(shí)肽類、蛋白質(zhì)、酶存在酪氨酸、組胺殘基等基團(tuán)操作簡(jiǎn)便、易標(biāo)識(shí)、比放射性高不適于活性功效區(qū)殘基標(biāo)識(shí)間接標(biāo)識(shí)甾類化合物、核苷酸等小分子化合物不存在酪氨酸、組胺殘基等基團(tuán),需添加可防止氧化／還原劑對(duì)被標(biāo)識(shí)物活性損傷等添加基團(tuán)可能影響被標(biāo)識(shí)物活性免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第7頁(yè)標(biāo)識(shí)物純化

對(duì)游離125I等試劑與標(biāo)識(shí)物進(jìn)行分離方法：分子篩凝膠過(guò)濾；離子交換層析；聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）；高效液相色譜（HPLC）免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第8頁(yè)標(biāo)識(shí)物判定放射化學(xué)純度

單位標(biāo)識(shí)物中結(jié)合在被標(biāo)識(shí)物上放射性占總放射性百分率。普通要求大于95％。免疫活性

標(biāo)識(shí)過(guò)程中，被標(biāo)識(shí)物活性損傷程度。B/T％>80％，B/T％↑抗原損傷↓。比放射性

單位化學(xué)量標(biāo)識(shí)物中所含放射性強(qiáng)度.慣用Ci/g、mCi/mg、Ci/mmol等單位表示。比放射性↑方法更靈敏；過(guò)高輻射自損傷大，對(duì)標(biāo)識(shí)物免疫活性影響大，儲(chǔ)存穩(wěn)定性差。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第9頁(yè)抗血清判定多克隆抗體抗血清是放射免疫分析主要試劑之一，其質(zhì)量直接影響方法特異性和靈敏度。親協(xié)力選取親和常數(shù)K值大(109~1012L//mol)抗血清特異性其程度可直接影響結(jié)果準(zhǔn)確性

滴度最大稀釋度。在本技術(shù)方法中是指結(jié)合50％標(biāo)識(shí)抗原時(shí)抗血清稀釋度。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第10頁(yè)放射免疫分析（RIA）基本原理

采取定量標(biāo)識(shí)抗原（Ag＋）和非標(biāo)識(shí)抗原（Ag）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有限量特異性抗體（Ab）反應(yīng)。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第11頁(yè)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第12頁(yè)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第13頁(yè)以未結(jié)合Ag*為F，Ag*Ab復(fù)合物為B，則B/F與Ag量變存在著函數(shù)關(guān)系。B/F60(％)50403020

10

0.81.62.43.24.04.85.6Ag(ng/ml)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第14頁(yè)測(cè)定方法與步驟1.抗原抗體反應(yīng)：平衡法或非平衡法2.分離結(jié)合與游離標(biāo)識(shí)物沉淀劑沉淀復(fù)合物，離心分離。如第二抗體沉淀法、聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分離徹底，快速；分離試劑和過(guò)程不影響反應(yīng)平衡；操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好且經(jīng)濟(jì)。3.放射性測(cè)定及數(shù)據(jù)處理晶體閃爍計(jì)數(shù)儀(γ射線)或液體閃爍計(jì)數(shù)儀(β射線)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待檢抗原濃度。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第15頁(yè)免疫放射分析（IRMA）基本原理

單位點(diǎn)IRMA：利用過(guò)量標(biāo)識(shí)抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，反應(yīng)平衡后，用固相抗原結(jié)合反應(yīng)液中剩下未結(jié)合標(biāo)識(shí)抗體并將其分離，測(cè)定上清液放射量。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第16頁(yè)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第17頁(yè)雙位點(diǎn)IRMA先用固相抗體與抗原反應(yīng)結(jié)合,然后再用過(guò)量標(biāo)識(shí)抗體與已結(jié)合于固相抗原另一抗原決定簇結(jié)合,形成固相抗體-抗原-標(biāo)識(shí)抗體復(fù)合物,洗棄反應(yīng)液中剩下標(biāo)識(shí)抗體,測(cè)定固相上放射性。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第18頁(yè)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第19頁(yè)IRMA與RIA異同點(diǎn)

標(biāo)識(shí)物

在RIA中核素標(biāo)識(shí)抗原，抗原有不一樣種類，依據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，標(biāo)識(shí)時(shí)需用不一樣核素和不一樣方法。在IRMA中核素標(biāo)識(shí)抗體?？贵w為蛋白質(zhì)，有利于碘化標(biāo)識(shí)，不一樣抗體標(biāo)識(shí)方法基本相同。標(biāo)識(shí)抗體比活度高，提升了分析靈敏度。反應(yīng)速率反應(yīng)速度與反應(yīng)物濃度呈正比，在IRMA中標(biāo)識(shí)抗體是過(guò)量，而且不存在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合復(fù)雜反應(yīng)，所以反應(yīng)速度較RIA快。在RIA中抗體量是微量，所以一定要用高親和力多克隆抗體，而在IRMA中應(yīng)用親和力較低單克隆體也能得到滿意結(jié)果。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第20頁(yè)反應(yīng)原理

RIA為競(jìng)爭(zhēng)抑制，測(cè)得放射性量與受檢抗原呈反比。IRMA為非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，劑量反應(yīng)曲線為正相關(guān)直線關(guān)系。特異性

在雙位點(diǎn)IRMA中，普通均應(yīng)用針對(duì)不一樣位點(diǎn)單克隆抗體，其交叉反應(yīng)率低于應(yīng)用多克隆抗體RIA。檢測(cè)范圍

通常RIA工作范圍為2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，而RIMA可達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)以上。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第21頁(yè)分析誤差RIA中加入抗體和標(biāo)識(shí)抗原都是定量，加樣誤差可嚴(yán)重影響測(cè)定結(jié)果。IRMA中標(biāo)識(shí)和固相抗體在反應(yīng)中都是過(guò)量，只有受檢標(biāo)本加樣誤差才會(huì)影響分析結(jié)果。所以，IRMA批內(nèi)和批間變異均比較小。其它RIA能夠測(cè)定大分子量與小分子量物質(zhì)，雙位點(diǎn)IRMA只能測(cè)定在分子上含有2個(gè)以上抗原表位物質(zhì)。在RIA中應(yīng)用為多克隆抗體，親和力和特異性要求較高，但用量極少。IRMA中標(biāo)識(shí)抗體和固相抗體用量較多，普通均用起源豐富、特異性較高單克隆抗體。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第22頁(yè)放射免疫技術(shù)應(yīng)用慣用于各種激素、微量蛋白、腫瘤標(biāo)志物和藥品等微量物質(zhì)測(cè)定。問(wèn)題：放射性污染、慣用核素半衰期短、試劑盒穩(wěn)定時(shí)不長(zhǎng)不易自動(dòng)化儀器分析等。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第23頁(yè)第九章免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)(immunofluorescencetechnique)是標(biāo)識(shí)免疫技術(shù)中發(fā)展最早一個(gè)。

是將抗原抗體反應(yīng)特異性與熒光物質(zhì)檢測(cè)敏感性和直觀性結(jié)合起來(lái)一個(gè)方法。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第24頁(yè)基本原理利用熒光素標(biāo)識(shí)抗體，使之在涂片上或組織切片上與標(biāo)本中待檢抗原特異結(jié)合，采取高發(fā)光效率點(diǎn)光源，透過(guò)濾色板發(fā)出一定波長(zhǎng)光，使結(jié)合在標(biāo)本上熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態(tài)，來(lái)判斷有沒(méi)有待檢抗原或抗體。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第25頁(yè)第一節(jié)熒光基本知識(shí)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第26頁(yè)異硫氰酸熒光素（FITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，分子量為389.4，最大吸收光波長(zhǎng)為490-495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)520-530nm，展現(xiàn)明亮黃綠色熒光，是應(yīng)用最廣泛熒光素。主要優(yōu)點(diǎn)：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感；②通常切片標(biāo)本中綠色熒光少于紅色，降低背景干擾

。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第27頁(yè)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第28頁(yè)四乙基羅丹明（RB200）

為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)久保留。最大吸收光波長(zhǎng)為570nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為595－600nm，呈橘紅色熒光。慣用于雙重標(biāo)識(shí)或?qū)Ρ热旧?/p>

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第29頁(yè)四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）

最大吸引光波長(zhǎng)為550nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第30頁(yè)

熒光分子輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間照射后會(huì)減弱甚至猝滅，一些化合物對(duì)熒光有猝滅作用，所以熒光物質(zhì)保留應(yīng)注意防止光（尤其是紫外光）直接照射和與其它化合物接觸。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第31頁(yè)熒光抗體制備作為標(biāo)識(shí)熒光素應(yīng)符合以下要求：

①應(yīng)含有能與蛋白質(zhì)分子形成共價(jià)健化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合色素及其降解產(chǎn)物易于去除。②熒光效率高,與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高熒光效率。③熒光色澤與背景組織色澤對(duì)比鮮明。④與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有生化與免疫性質(zhì)，與蛋白質(zhì)結(jié)合物穩(wěn)定，易于保留。

⑤標(biāo)識(shí)方法簡(jiǎn)單、安全無(wú)毒。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第32頁(yè)熒光抗體是將熒光素（如FITC）與特異性抗體以化學(xué)方式共價(jià)結(jié)合而成。

標(biāo)識(shí)方法：攪拌法(適合大樣品)透析法(適合小樣品)標(biāo)識(shí)抗體純化：透析法層析分離法

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第33頁(yè)熒光抗體判定F/P比率：將制備熒光抗體稀釋至A280≈1.0，分別測(cè)讀A280（蛋白質(zhì)特異吸收峰）和標(biāo)識(shí)熒光素特異吸收峰免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第34頁(yè)F/P值越高，說(shuō)明抗體分子上結(jié)合熒光素越多，反之則越少。普通用于固定標(biāo)本熒光抗體以F/P＝1.5為宜，用于活細(xì)胞染色以F/P＝2.4為宜。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第35頁(yè)抗體效價(jià)：效價(jià)越大標(biāo)識(shí)抗體特異性越高非特異熒光越少。效價(jià)在1:16-1:32者較為理想抗體特異性：免疫電泳和交叉免疫電泳觀察特異性沉淀線或沉淀峰，在紫外線照射下發(fā)出強(qiáng)烈熒光免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第36頁(yè)第二節(jié)免疫熒光顯微技術(shù)基本原理：使熒光抗體與標(biāo)本切片中組織或細(xì)胞表面抗原進(jìn)行反應(yīng)，洗滌除去游離熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見(jiàn)明亮特異熒光。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第37頁(yè)直接法

熒光抗體染色免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第38頁(yè)直接法優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、特異性高、非特異熒光染色原因少，缺點(diǎn)：靈敏度偏低，每檢驗(yàn)一個(gè)抗原需制備對(duì)應(yīng)特異熒光抗體免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第39頁(yè)間接法

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第40頁(yè)間接法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，在不一樣抗原檢測(cè)中只需應(yīng)用一個(gè)熒光抗體。既可檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第41頁(yè)免疫熒光技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用在細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中主要用于菌種判定。免疫熒光用于梅毒螺旋體抗體檢測(cè)是梅毒特異性診療慣用方法之一。用熒光抗體染色法可檢出病毒及其繁殖情況。在寄生蟲(chóng)感染診療中，間接免疫熒光試驗(yàn)（IFAT）是當(dāng)前公認(rèn)最有效檢測(cè)瘧疾抗體方法。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第42頁(yè)免疫熒光法還是檢測(cè)本身抗體好工具，在本身免疫病試驗(yàn)診療中應(yīng)用廣泛。其突出優(yōu)點(diǎn)是能以簡(jiǎn)單方法同時(shí)檢測(cè)抗體和與抗體起特異反應(yīng)組織成份，并能在同一組織中同時(shí)檢驗(yàn)抗不一樣組織成份抗體。熒光抗體技術(shù)一個(gè)特殊應(yīng)用是流式細(xì)胞分析（flowcytometry）?？捎糜跈z測(cè)細(xì)胞大小、折散率、粘滯度等，更慣用于T細(xì)胞亞群等檢測(cè)。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第43頁(yè)第十章酶免疫技術(shù)

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第44頁(yè)第一節(jié)酶免疫技術(shù)概述基本原理利用酶催化底物反應(yīng)生物放大作用,提升特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)檢測(cè)敏感性一個(gè)標(biāo)識(shí)免疫技術(shù)。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第45頁(yè)基本特點(diǎn)：①標(biāo)識(shí)后保留酶和抗原(抗體)活性②酶促反應(yīng)專一性，確保特異性③底物反應(yīng)放大作用，提升敏感性④酶標(biāo)試劑保留穩(wěn)定⑤操作簡(jiǎn)便，安全易行免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第46頁(yè)主要試劑制備與要求免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第47頁(yè)一、酶與酶作用底物（一）用于標(biāo)識(shí)酶要求：酶活性高標(biāo)識(shí)后酶活性穩(wěn)定，且不影響標(biāo)識(shí)抗原與抗體免疫反應(yīng)性酶催化底物后信號(hào)易判定或測(cè)定酶活性不受樣品中其它成份影響酶、輔助因子及底物理化性質(zhì)穩(wěn)定，安全無(wú)害，價(jià)廉免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第48頁(yè)（二）慣用酶及其底物1.辣根過(guò)氧化物酶（HRP）慣用底物：鄰苯二胺（OPD）：反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：反應(yīng)后呈藍(lán)色，無(wú)需避光，無(wú)致癌性，但水溶性差。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第49頁(yè)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第50頁(yè)2.堿性磷酸酶（AP）

慣用底物為對(duì)硝基苯磷酸酯（p-NPP），產(chǎn)物為黃色。

*AP靈敏性高與HRP，但不易取得純品，穩(wěn)定性及酶標(biāo)識(shí)物收率低于HRP，且價(jià)高，故應(yīng)用不如HRP普及。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第51頁(yè)二、酶標(biāo)識(shí)抗體或抗原基本要求：酶標(biāo)識(shí)抗原純度要高，抗原性完整；抗體特異性好，效價(jià)高，親和力強(qiáng)，比活性高以及易于批量生產(chǎn)和分離純化免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第52頁(yè)酶標(biāo)識(shí)方法

1.交聯(lián)法以雙功效交聯(lián)劑為“橋”，分別與酶和抗體（抗原）連接形成結(jié)合物。如戊二醛交聯(lián)法。2.直接法

用過(guò)碘酸鈉活化酶蛋白分子后，再與抗體（抗原）結(jié)合。僅適合用于含糖蛋白分子酶（如HRP）標(biāo)識(shí)物制備。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第53頁(yè)三、固相載體基本要求結(jié)合容量高，結(jié)合穩(wěn)定；可與抗原抗體復(fù)合物等大分子蛋白結(jié)合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法簡(jiǎn)便易行、快捷經(jīng)濟(jì)。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第54頁(yè)固相載體種類與選擇1.塑料制品材料經(jīng)濟(jì)，操作簡(jiǎn)便，易于自動(dòng)化，最慣用。2.微顆粒結(jié)合容量大，反應(yīng)快速，逐步普遍用于自動(dòng)化分析。3.膜載體硝酸纖維素膜（NC）、尼龍膜等微孔濾膜，廣泛應(yīng)用于定性或半定量斑點(diǎn)ELISA。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第55頁(yè)四、免疫吸附劑原理：非共價(jià)鍵吸附或共價(jià)鍵化學(xué)偶聯(lián)（包被）。普通采取偏堿性（pH9.6）碳酸鹽溶液（ELISA板）。封閉：1％－5％牛血清白蛋白或5％－20％小牛血清。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第56頁(yè)酶免疫技術(shù)分類

酶免疫組化用于檢測(cè)組織切片或細(xì)胞涂片中抗原和抗體

酶免疫技術(shù)均相酶免疫測(cè)定酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定異相酶免疫測(cè)定（ELISA）液相酶免疫測(cè)定免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第57頁(yè)均相酶免疫測(cè)定Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E基本原理：利用酶標(biāo)抗體結(jié)合抗原形成復(fù)合物后，標(biāo)識(shí)酶活性發(fā)生改變?cè)?，在不將?fù)合物與游離酶標(biāo)抗體分離情況下，直接測(cè)定系統(tǒng)中總標(biāo)識(shí)酶活性改變，進(jìn)而推算出待檢樣品中抗原量。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第58頁(yè)異相酶免疫測(cè)定（enzymeimmunoassay,EIA）基本原理：在抗原抗體反應(yīng)后，先將抗原抗體復(fù)合物與游離酶標(biāo)抗體分離，再測(cè)定酶標(biāo)識(shí)復(fù)合物催化底物顯色活性，最終推算出樣品中抗原含量。液相EIA：分離劑分離游離和結(jié)合標(biāo)識(shí)物。固相EIA：固相載體結(jié)合酶標(biāo)復(fù)合物，經(jīng)洗滌去除游離酶標(biāo)抗體。如ELISA。Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第59頁(yè)

第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)enzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第60頁(yè)基本原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不一樣步驟與固相載體表面抗原或抗體起反應(yīng)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第61頁(yè)用洗滌方法使固相載體上形成抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開(kāi)，最終結(jié)合在固相載體上酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)量成一定百分比。加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)量直接相關(guān)，故可依據(jù)顏色反應(yīng)深淺進(jìn)行定性或定量分析免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第62頁(yè)ELISA技術(shù)類型：

ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體，在這種測(cè)定方法中有3種必要試劑：固相抗原或抗體，酶標(biāo)識(shí)抗原或抗體，酶作用底物。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第63頁(yè)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第64頁(yè)1．雙抗體夾心法

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第65頁(yè)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第66頁(yè)特點(diǎn)：非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)慣用于抗原檢測(cè)適合用于分子中含有最少兩個(gè)抗原決定簇多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原檢測(cè)所用兩種抗體分別針對(duì)同一個(gè)抗原分子不一樣抗原決定簇

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第67頁(yè)2．間接法

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第68頁(yè)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第69頁(yè)3.競(jìng)爭(zhēng)法

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第70頁(yè)特點(diǎn)：用于抗原和半抗原定量測(cè)定，也可反抗體進(jìn)行測(cè)定。酶標(biāo)Ag（Ab）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中非標(biāo)識(shí)Ag（Ab）含有相同與固相Ab(Ag)結(jié)合能力。反應(yīng)體系中，固相Ab（Ag）和酶標(biāo)Ag（Ab）是固定限量，且前者結(jié)合位點(diǎn)少于酶標(biāo)識(shí)與非標(biāo)識(shí)Ag（Ab）分子數(shù)量和。反應(yīng)后，結(jié)合與固相載體上復(fù)合物中被測(cè)定酶標(biāo)Ag（Ab）量（酶活性）與樣品中非標(biāo)識(shí)Ag（Ab）濃度成反比。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第71頁(yè)4.捕捉法（反向間接法）

主要用于血清中某種抗體亞型成份（如IgM）測(cè)定。基本原理：

固相抗IgM待檢標(biāo)本(IgM)抗原(與特異抗體結(jié)合)酶標(biāo)抗體底物免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第72頁(yè)

第三節(jié)膜載體酶免疫測(cè)定固相膜免疫測(cè)定與ELISA相類似,其特點(diǎn)是以微孔膜作為固相.標(biāo)識(shí)物可用酶和各種有色微粒子,如彩色乳膠、膠體金等。慣用固相膜為硝酸纖維素膜。類型：免疫滲濾試驗(yàn)：穿流形式免疫層析試驗(yàn)：橫流形式斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)（dot-ELISA）免疫印跡法(Westernblot)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第73頁(yè)免疫印跡法（immunoblottingtest，IBT）亦被稱為Westernblot分三個(gè)階段進(jìn)行:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）電轉(zhuǎn)移酶免疫定位

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第74頁(yè)SDS抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯胺凝膠中從陰極向陽(yáng)泳動(dòng)，分子量越小，泳動(dòng)速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見(jiàn)（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶）

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第75頁(yè)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第76頁(yè)電轉(zhuǎn)移將在凝膠中已經(jīng)分離條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選取低電壓（100V）和大電流（1-2A），通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此分階段分離蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見(jiàn)。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第77頁(yè)酶免疫定位將印有蛋白質(zhì)條帶硝酸纖維素膜（相當(dāng)于包被了抗原固相載體）依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。陽(yáng)性反應(yīng)條帶清楚可辨，并可依據(jù)SDA加入分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分分子量。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第78頁(yè)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記技術(shù)第79頁(yè)免疫學(xué)及免疫