微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座

3/9/20231微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第1頁借助于顯微鏡觀察微生物方法即顯微技術(shù)，顯微技術(shù)是微生物檢驗技術(shù)中最慣用技術(shù)之一。3/9/20232微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第2頁顯微鏡種類和原理顯微觀察樣品制備3/9/20233微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第3頁一、顯微鏡種類和原理(一)、光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡暗視野顯微鏡相差顯微鏡熒光顯微鏡現(xiàn)在光學(xué)顯微鏡分辨最小極限達(dá)0.2μm。3/9/20234微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第4頁普通光學(xué)顯微鏡幾個基本概念3/9/20235微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第5頁3/9/20236微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第6頁3/9/20237微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第7頁3/9/20238微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第8頁3/9/20239微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第9頁1、普通光學(xué)顯微鏡由三部分組成①照明系統(tǒng)：包含光源和聚光器；②光學(xué)放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡主體，目鏡和物鏡都由復(fù)雜透鏡組組成；③機械裝置：用于固定材料和觀察方便3/9/202310微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第10頁油鏡使用光鏡使用方法3/9/202311微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第11頁2、暗視野顯微鏡原理：聚光鏡中央有擋光片，使照明光線不直接進人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射光線進入物鏡，因而視野背景是黑，物體邊緣是亮。適用范圍：生活細(xì)菌運動性觀察。

3/9/202312微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第12頁特點:只能看到物體存在與運動,不能辨清其微細(xì)結(jié)構(gòu)。暗視野顯微鏡使用3/9/202313微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第13頁基本原理:把透過標(biāo)本可見光光程差變成振幅差，從而提升了各種結(jié)構(gòu)間對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清楚可見。3、相差顯微鏡相差顯微鏡使用3/9/202314微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第14頁微分干涉差顯微鏡DIC顯微鏡下硅藻形態(tài)適用范圍：對透明活體進行直接觀察3/9/202315微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第15頁4、熒光顯微鏡原理：熒光素吸收紫外線并放出部分波長較長可見光，發(fā)熒光物體會在黑暗背景顯現(xiàn)為光亮有色物體3/9/202316微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第16頁綠色：銅綠假單胞菌黃色：蠟樣芽孢桿菌綠色：微管紅色：微絲藍(lán)色：核3/9/202317微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第17頁1931年在德國柏林由克諾爾和哈羅斯卡首先裝配完成。用高速電子束代替光束。放大倍數(shù)可達(dá)80萬倍，分辨最小極限達(dá)0.2納米。

（二）電子顯微鏡透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡3/9/202318微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第18頁1、透射電子顯微鏡當(dāng)前TEM分辨力可達(dá)0.2nm。用電子束作光源，用電磁場作透鏡。用于電鏡標(biāo)本須制成厚度約50nm左右超薄切片。放大倍數(shù)最高可達(dá)近百萬倍.由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、統(tǒng)計系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分組成。3/9/202319微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第19頁高爾基體TEM照片(偽彩色)3/9/202320微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第20頁3/9/202321微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第21頁2、掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡大腸桿菌掃描電鏡圖工作原理：電子束掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，電子產(chǎn)生多少與標(biāo)本表面立體形貌相關(guān)。電子經(jīng)探測器搜集，經(jīng)光電倍增管和放大器，產(chǎn)生樣品立體圖像于熒光屏上。主要用于：樣品表面結(jié)構(gòu)3/9/202322微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第22頁掃描電子顯微鏡原理3/9/202323微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第23頁3/9/202324微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第24頁3、掃描隧道顯微鏡（STM）掃描隧道顯微鏡拍攝7個鈾原子團3/9/202325微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第25頁3/9/202326微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第26頁4原子力顯微鏡3/9/202327微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第27頁3/9/202328微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第28頁特點光學(xué)顯微鏡電子顯微鏡最高放大倍數(shù)約1000-150010萬以上最正確分辨率0.2微米0.5納米輻射源可見光電子束輻射源經(jīng)過媒介空氣高真空透鏡類型玻璃電磁體反差起源光吸收差異或特定波長電子散射聚焦機械機械調(diào)整透鏡位置調(diào)整電磁透鏡流向改變放大倍數(shù)方法調(diào)換物鏡或目鏡調(diào)整電磁透鏡流向樣品承載載玻片金屬網(wǎng)（通常為銅網(wǎng)）光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡特點比較3/9/202329微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第29頁（一）光學(xué)顯微鏡制樣活體觀察染色壓滴法懸滴法菌絲埋片法活菌死菌美藍(lán)染色簡單染色判別染色革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色二、顯微觀察樣品制備3/9/202330微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第30頁（1）壓滴法：菌懸液滴于載玻片上，加蓋玻片，觀察。（2）懸滴法：蓋玻片中央加一小滴菌懸液，翻轉(zhuǎn)置于特制凹載玻片上，觀察。（3）菌絲埋片法：無菌小塊玻璃紙鋪于平板表面，涂布放線菌或霉菌孢子懸液，培養(yǎng)，取下玻璃紙置于載玻片上，觀察菌絲形態(tài)。光學(xué)顯微鏡樣品制備－－活體觀察特點：防止染色對細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，用于運動性、攝食特征、生長繁殖過程中形態(tài)改變等觀察

3/9/202331微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第31頁用途：微生物細(xì)致形態(tài)和結(jié)構(gòu)染色前需要對樣品固定.慣用固定方法：酒精火焰加熱、化學(xué)固定光學(xué)顯微樣品制備－－染色觀察3/9/202332微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第32頁1)、簡單染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢2）、革蘭氏染色法：涂片→固定→結(jié)晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脫色→番紅復(fù)染→水洗→干燥→觀察3/9/202333微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第33頁（二）、電子顯微鏡制樣樣品在進行電鏡觀察前必須進行固定和干燥，制樣時普通采取重金屬鹽染色或噴鍍，提升在電鏡下反差。3/9/202334微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第34頁※1、透射電鏡樣品制備負(fù)染技術(shù)投影技術(shù)超薄切片技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)3/9/202335微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第35頁負(fù)染法將樣品背景染色以凸現(xiàn)樣品，所以稱為負(fù)染法。普通是采取電子密度高，本身不會顯示任何結(jié)構(gòu)，又和樣品不起反應(yīng)物質(zhì)，如磷鎢酸鈉鹽將樣品包圍，同時染色劑還會進入觀察對象內(nèi)部，這么，既能顯示外形，又可在一定程度上反應(yīng)樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)。負(fù)染法原理3/9/202336微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第36頁負(fù)染色法觀察鞭毛用途：能夠觀察細(xì)菌細(xì)胞、病毒等。3/9/202337微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第37頁在真空條件下，用電子散射能力強重金屬原子來噴鍍樣品表面，這么在樣品和沒有噴鍍區(qū)域形成了較強反差，而沒有噴鍍部分成了樣品投影，依據(jù)投影了解樣品立體形狀、高度。投影法3/9/202338微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第38頁投影法觀察噬菌體用途：觀察細(xì)菌鞭毛或病毒顆粒3/9/202339微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第39頁這是最慣用方法，能夠觀察細(xì)胞或其它樣品內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)。樣品固定→脫水→包埋→切片。只有在20—100納米厚度切片用透射電子顯微鏡才能觀察，所以普通細(xì)菌樣品，一個細(xì)胞要分割成10片到50片。超薄切片法超薄切片法觀察一個厭氧弧菌3/9/202340微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第40頁樣品-196℃快速冷凍→加溫到-100℃→切割樣品→升華(真空)掉斷口處冰→重金屬噴鍍斷口表面→電子顯微鏡觀察冰凍蝕刻法3/9/202341微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第41頁冰凍蝕刻法制備酵母菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖優(yōu)點:能夠防止在固定、脫水和包埋過程中造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)人為改變而形成假象。3/9/202342微生物顯微鏡和顯微技術(shù)專家講座第42頁

2、、掃描電鏡樣品制備樣品先要經(jīng)過固定、脫水等處理，以免在真空條件下