實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA

試驗(yàn)五

1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)

2.補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第1頁(yè)1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第2頁(yè)免疫標(biāo)識(shí)技術(shù)定義：

將抗原-抗體反應(yīng)與標(biāo)識(shí)技術(shù)相結(jié)合，用放射性同位素、酶或熒光素標(biāo)識(shí)已知抗體或抗原，經(jīng)過(guò)檢測(cè)標(biāo)識(shí)物，間接測(cè)定未知抗原或抗體。分類(lèi)：放射免疫測(cè)定法：131I，32P免疫熒光技術(shù)：FITC，PE免疫酶測(cè)定法：HRP，AP實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第3頁(yè)免疫酶測(cè)定法

(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶標(biāo)識(shí)抗原或抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。

辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶(AP)特點(diǎn)：高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)特異性高靈敏度：酶催化底物顯色高效性，pg水平微量檢測(cè)定性定量檢測(cè)：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值分類(lèi)：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：可溶性抗原或抗體酶免疫組化法：組織中或細(xì)胞表面抗原。實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第4頁(yè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶標(biāo)識(shí)抗原或抗體檢測(cè)液體（血液、細(xì)胞液）中未知抗體或抗原方法。1.定義2.分類(lèi)間接法（IndirectELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)識(shí)二抗檢測(cè)液相中未知抗體雙抗體夾心法（SandwichELISA)：將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)識(shí)一抗檢測(cè)液相中可溶性抗原競(jìng)爭(zhēng)法（CompetitiveELISA)：將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)識(shí)抗原或抗體檢測(cè)液相中可溶性抗原或抗體實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第5頁(yè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)3.原理（以間接性ELISA為例）：顯色實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第6頁(yè)試驗(yàn)內(nèi)容：

間接法測(cè)定溶血素——定性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第7頁(yè)試驗(yàn)材料脫纖維綿羊紅細(xì)胞——抗原兔抗綿羊紅細(xì)胞抗體（溶血素）——待測(cè)兔血清HRP標(biāo)識(shí)羊抗兔IgG——二抗包被緩沖液：0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液洗滌液：含0.05%Tween200.01MpH7.4PBS底物緩沖液：pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液底物溶液：OPD10mg，底物緩沖液25ml，30%H2O240μL酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第8頁(yè)試驗(yàn)方法1.抗原處理：脫纖維綿羊血加3mLN.S，混勻rpm，5min加3mLN.S，混勻rpm，5min取2mL壓積紅細(xì)胞加入2mL蒸餾水，震蕩破碎紅細(xì)胞用包被緩沖液稀釋成1：400備用2.包被抗原：取酶標(biāo)板，加入100μL/孔抗原稀釋液4℃，濕盒內(nèi)，18h實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第9頁(yè)取出包被好抗原酶標(biāo)板（4孔/組），甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次3.加待測(cè)血清標(biāo)識(shí)各孔，加入對(duì)應(yīng)液體100μL/孔1234陰性空白陽(yáng)性待測(cè)4.加二抗：37℃，濕盒內(nèi)，30min甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次各孔加入酶標(biāo)二抗100μL/孔37℃，濕盒內(nèi)，30min5.顯色：甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次加入底物溶液100μL/孔避光顯色，10min6.觀察結(jié)果試驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第10頁(yè)預(yù)期結(jié)果陽(yáng)性：顯色為黃色陰性：無(wú)色1234陰性陰性陽(yáng)性陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第11頁(yè)注意事項(xiàng)洗滌徹底，防止交叉污染。按次序加樣，孔底無(wú)氣泡。包被和溫育在濕盒內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第12頁(yè)2.補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)

（ComplementfixationTest,CFT）實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第13頁(yè)概念：補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)：是指在補(bǔ)體參加下，以綿羊紅細(xì)胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC抗體）作為指示系統(tǒng)抗原抗體反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第14頁(yè)補(bǔ)反中包含兩個(gè)系統(tǒng)五種成份：待檢系統(tǒng)：已知Ag或Ab、待檢Ab或Ag及僅供一組Ag-Ab系統(tǒng)反應(yīng)定量補(bǔ)體。指示系統(tǒng)：綿羊紅細(xì)胞和溶血素。原理：實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第15頁(yè)待測(cè)系統(tǒng)抗原+未知血清12補(bǔ)體12Step1抗原抗體復(fù)合物形成Step2補(bǔ)體結(jié)合和耗竭指示系統(tǒng)SRBC+抗SRBC抗體Step3SRBC裂解121：NoAb；

2：Ab實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第16頁(yè)AgY待測(cè)血清

YYYYYYYYAb陽(yáng)性NoAb陰性AgAgAg實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第17頁(yè)抗原：傷寒菌裂解產(chǎn)物待測(cè)血清：56℃，30min補(bǔ)體：豚鼠血清2%綿羊紅細(xì)胞溶血素材料：實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第18頁(yè)方法：12345試驗(yàn)管血清對(duì)照管抗原對(duì)照管補(bǔ)體對(duì)照管SRBC對(duì)照管待測(cè)血清0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.4mL0.8mL抗原補(bǔ)體N.S搖勻，37℃，水浴15min溶血素SRBC0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL………………………………………………搖勻，37℃，水浴15min（1份/2人）實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA第19頁(yè)預(yù)期結(jié)果：1．管內(nèi)液體混濁呈淺紅色為不溶血，管內(nèi)液體透明呈紅色為溶血。溶血不