狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座

1.臨床診療與試驗室診療

試驗室伎倆對狂犬病確實診非常必要。ＷＨＯ要求狂犬病病例統(tǒng)計上報資料要注明診療依據(jù)（是否包含試驗室診療？）。當前國際上公認狂犬病死亡率是100%，標準上不認可有狂犬病康復可能，即狂犬病發(fā)病率應與死亡率相等。沒有合格試驗室給出必定診療康復病例應從狂犬病病例統(tǒng)計數(shù)字中剔除?！翱袢』颊弑厮罒o疑，不死不算狂犬病”，要挑戰(zhàn)這個命題，必須提供確切、完整病史和權威試驗室診療資料?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第1頁2.人狂犬病生存期內(nèi)診療

生存期內(nèi)診療技術選擇主要伴隨病程不一樣而異。在病后最初幾天，檢測抗原普通是敏感。腦脊液及血清中病毒中和抗體經(jīng)常趨向于在病后7—10天出現(xiàn)。檢測抗原可用熒光抗體（FA）法檢驗狂犬病患者角膜印片或皮膚活組織，不過，F(xiàn)A陽性標本在發(fā)病后期更常見。皮膚活組織檢驗經(jīng)常從頸背部取含有末稍神經(jīng)帶有毛囊標本。角膜印片(切勿劃痕)取自伴有腦炎患者，用顯微鏡載波片輕輕觸及角膜中心部位。角膜印片及皮膚活組織標本質(zhì)量很主要，采取后應馬上冷凍，直至檢測。不過，用FA技術做生存期內(nèi)診療，其敏感性是有限。狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第2頁

人狂犬病生存期內(nèi)診療

已證實患者及自然感染和試驗感染動物角膜印片中存在狂犬病抗原。不過，角膜印片檢出率較低，陽性結果可必定是狂犬病，而陰性結果并不能排除是狂犬病可能。即使在臨床癥狀開始時，在皮膚活組織中可能檢出狂犬病抗原，但早期癥狀時僅有25-50%患者為陽性，伴隨病情進展陽性率也增加。頸背部皮膚活組織檢驗只有一些患者呈陽性結果，尤其是在臨床疾病早期。用FA檢驗皮膚活組織靈敏度普通高于檢驗角膜印片?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第3頁3.動物和人狂犬病死后診療

抗原檢測病毒分離病毒判定等。為了確保試驗室結果可信性，必需滿足若干條件：1.標本質(zhì)量要好；2.標本送達試驗室條件要好（符合GLP標準，取得一定級別資格認證）；3.取得結果等候時間要短；4.結果傳遞要快速?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第4頁二狂犬病診療試驗室安全辦法1.危險性

在普通試驗室條件，技術人員暴露于以下傳染危險：——野生狂犬病毒(即街毒)，當試驗室對接收到動物標本進行尸體解剖時或?qū)吮具M行加工時(懸液制備，離心)等，這一類操作是非常危險，必須在P3以上條件專業(yè)試驗室中進行?！囼炇疫m應病毒(即固定毒)，當接種試驗動物或操作感染細胞培養(yǎng)時，尤其是制備大量高濃度病毒時，主要傳染起源為手指被有感染玻璃或工具刺傷或割破；新糜爛皮膚或粘膜與感染物接觸也應認為是一個傳染危險。即使固定毒毒力已大為下降，歷史上僅有一例死于固定毒操作報道，但仍有一定危險性，所以操作固定毒仍須十分小心?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第5頁生物安全級別＆對工作人員要求

(BiologicalSafetyLevel,BSL)(Protection,P)

BSL-1：試驗人員在試驗程序方面受過特殊訓練，由受過微生物學或相關科學普通訓練科學工作者監(jiān)督試驗。

BSL-2：試驗人員均接收過病源處理方面特殊培訓，并由有資格科學工作者指導。

BSL-3：試驗人員應在處理致病性和可能使人致死病源方面受過專業(yè)訓練，并由對該病源工作有經(jīng)驗、有資格科學工作者監(jiān)督。

BSL-4：試驗室組員應在處理尤其危險傳染源方面受過特殊和全方面訓練，應了解標準和特殊操作中一級和二級遏制作用、遏制設備、試驗室設計性能。試驗由在相關病源方面受過訓練、并有工作經(jīng)驗、有資格科學工作者監(jiān)督?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第6頁2.對安全操作提議

操作全部潛在狂犬病感染材料均應在P2或P3生物安全試驗室內(nèi)進行。

對狂犬病試驗室診療安全性要求：

①一個封閉環(huán)境，專作狂犬病感染性工作②經(jīng)過緩沖更衣間并限制一定專業(yè)人員進入；③穿專用試驗室隔離無菌衣和鞋；④操作完成對操作臺進行消毒(當材料偶然地溢出時應馬上用3％雷蘇爾溶液或其它對應消毒劑消毒)；⑤每日應最少消毒地板一次；⑥全部用后剩下標本，尸解工具，試驗室材料在拿出試驗室前應進行高壓蒸氣消毒。在生物安全柜或隔離器內(nèi)打開動物顱蓋骨操作很困難，技術人員在操作這項工作時應帶面罩，護目鏡、手套和圍裙。因為與狂犬病相關病毒對人致病性還不很了解，全部操作可能含有這些病毒標本均應在生物安全柜內(nèi)進行。全部試驗室工作人員務必進行狂犬病疫苗暴露前免疫，這些人員中和抗體應定時檢驗，全部意外地暴露于感染時必需馬上匯報責任人。狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第7頁三狂犬病毒抗原檢測1.標本選擇在選擇、運輸標本前，實際操作取得標本人員與試驗室檢測人員事先取得聯(lián)絡共同選擇試驗方法是很主要?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第8頁1)標本取自個體生命期

Ａ．檢驗病毒和(或)抗原：樣品應放在干燥試管內(nèi)。樣品獲取可按下述方法進行。(1)用注射器或吸管吸入法采集唾液(不用棉拭)，CSF，皮膚活檢等樣品。(2)角膜涂片，用顯微鏡載玻片直接接觸角膜操作(不要用棉拭)，標識玻片，空氣干燥并用鋁錫紙單片包裹。Ｂ。檢測抗體：血液、CSF或血清采集于干燥試管內(nèi)，并低溫冰凍存放。

狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第9頁2)標本取自死亡后個體

送至試驗室標本方式依動物種類不一樣而不一樣。(1)小野生動物(包含蝙蝠)

送完整個體方便對動物品種進行準確判定。(2)家養(yǎng)食肉動物(狗、貓)或野生食肉動物

(狐貍、貉、浣熊、臭鼬、豺等)

僅送頭部。(3)更大動物(家養(yǎng)或野生食草動物)

打開頭蓋骨并取腦送至試驗室。狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第10頁標本取自死亡后個體（人）對人狂犬病在有可能進行全方面尸解時，把整個腦取出，或選擇一些部位切下(海馬角、腦干、皮質(zhì)、小腦)送至試驗室。在特殊情況下(困難野外條件，動物流行病學檢測)以及因宗教或傳統(tǒng)原因?qū)袢∪藷o法尸解時，能夠用塑料管或吸管穿進枕骨孔或眼窩后取出一些腦組織)?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第11頁

2.標本運輸

標本運輸必需嚴格遵照安全要求，包裝務必要有確保。1)

可靠診療要有一個保留良好標本；2)

運輸狂犬病標本服務人員應事先進行過抗狂犬病免疫并證實已得到完全保護。3)小動物軀體或較大動物切下頭部標本可用10％甲醛溶液處理過材料包裹，然后放入一個厚塑料袋內(nèi)扎緊。如僅取腦(大動物)則應把腦放人一個堅固塑料或金屬容器內(nèi)并密封，標本作好標識，外加第二層包裝并放人泡沫塑料盒中。遠距離運輸時可用干冰保冷。泡沫塑料盒用牢靠粘性帶仔細封固；把全部相關標本資料放在信封內(nèi)固定在盒上，再裝進一個紙板箱內(nèi)。箱上應清楚地標明“小心，有感染性生物材料，狂犬病診療用生物學標本”字樣。當無冷凍條件且標本較小時，能夠?qū)⑿K腦組織放進裝有80％甘油緩沖液小瓶內(nèi)，以保留其感染性。在無需保留標本感染性，準備用免疫熒光法檢測抗原時，則可將腦組織標本用10％甲醛固定(固定液內(nèi)應含有苦味酸)?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第12頁

3.標本獲取1)動物腦組織獲取1)將動物頭部放在解剖臺上用骨固定鉗于上頒骨處牢牢靠定住，用尖銳屠刀從眼部至顱骨底部作一中線切割。然后將顳肌從顱部切除，顱蓋骨用割刀和錘子等工具割掉。對大動物可用一外科骨鋸在眼部二側上方將頭蓋骨橫切，切除腦膜，將髓質(zhì)和腦神經(jīng)切割后，即可將腦取出放在一紙盤或大平皿內(nèi)。狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第13頁狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第14頁狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第15頁狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第16頁動物腦組織獲取2)特異性病毒包涵體在腦一些部位更豐富，尤其是海馬回，為了暴露海馬回，從一腦半球后面約半球間溝外側2cm處往下經(jīng)過灰質(zhì)和白質(zhì)直到側腦室作一縱切。海馬角像二分之一園柱形閃光體從腦室底部凸出，小腦和腦干也富有病毒包涵體。當標本保留不好時，通常腦干，髓質(zhì)和視神經(jīng)還能保持完好。在常規(guī)操作中，采集海馬角、一小塊腦干和一小塊皮質(zhì)放在平皿內(nèi)，在底部和上面標上標本序號。平皿馬上放置于通風柜內(nèi)處理或保留在4℃冷柜內(nèi)。狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第17頁狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第18頁2)唾液腺獲取為取出頜下腺，在復蓋于下頜骨間皮膚上作一切割，將皮膚往外側翻，兩側頜下腺位于頜骨后部邊緣表面。在下頜下淋巴結后面（這二種不要相混同）?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第19頁4.標本快速搜集技術在一些情況下可能難于或不可能尸解方便打開顱骨取腦,為降低這些困難已經(jīng)設計出簡便技術，即用塑料管插入顱骨采集一小塊腦組織體。第一個技術是用吸管經(jīng)過枕骨孔插入并往前推至一眼睛部位，則吸管中腦組織內(nèi)含有部分腦干，小腦，海馬回和皮質(zhì)。第二種技術為將吸管經(jīng)過眼窩后壁(用套管穿孔)并推至枕部，腦組織內(nèi)含有部分皮質(zhì)、海馬回、小腦?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第20頁狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第21頁1)材料

①取樣試管、塑料或玻璃吸管、套管。②保留或運輸溶液：80％甘油PBS?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第22頁2)方法

(1)枕部路徑：①把動物頸部往前彎曲，切開枕部和第一頸椎間皮膚和肌肉；②割開寰椎一枕部韌帶，打開關節(jié)；③將取樣管經(jīng)過枕孔插入并推向一只眼，拔出吸管，里面含有腦組織柱狀體。

(2)后眼框路徑：①將眼球推向一邊，用套管在眼窩后壁穿孔；②將取樣管插人推向顱骨后部對側拔出，吸管內(nèi)即含有腦組織柱狀體。(3)腦柱體搜集：①用適當棉拭子或用橡皮球從管于清凈端吹氣將腦柱體從管子內(nèi)推在平皿內(nèi)；②如試驗診療需延期進行則將腦柱體放進裝有甘油溶液螺旋蓋小瓶中?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第23頁5.熒光抗體試驗

FluorescentAntibodyTest(FAT)該方法特點是：——耗時短，整個FAT操作需30分鐘，若加上涂片、固定，則需2-4小時。——與小鼠顱內(nèi)接種試驗MIT相比，符合率達99%?！锜晒怙@微鏡及高質(zhì)量熒光標識抗體?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第24頁狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第25頁狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第26頁狂犬病毒抗原熒光標識抗狂犬病毒抗體免疫熒光試驗檢測狂犬病毒抗原狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第27頁熒光抗體試驗檢測狂犬病毒抗原

FAT技術要求：——因為狂犬病毒多分布在動物腦海馬回及腦干處，所以適當取樣部位反抗原檢測很主要?！X樣品印片必須用丙酮固定5-10分鐘，因為丙酮可去除細胞膜表面脂類，方便抗體抵達細胞內(nèi)與狂犬病毒結合?！X樣品必須保留在含50%甘油生理鹽水中，印片染色前需用生理鹽水洗滌數(shù)次?！獰晒鈽俗R抗體需最大程度降低非特異性反應，所以制備特異性、高效價抗體是FAT關鍵。

狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第28頁熒光抗體試驗檢測狂犬病毒抗原操作要求：——印片不能太厚，不然易出現(xiàn)假陽性——一個切面最多可印4次，不然易出現(xiàn)假陰性——丙酮固定時間不宜太長——洗滌不宜過分——判讀結果應快速，以免熒光淬滅狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第29頁用抗狂犬病毒核蛋白

單克隆抗體制備熒光結合物我室當前采取抗狂犬病毒核蛋白單克隆抗體制備熒光結合物，經(jīng)法國巴斯德研究所屢次試驗，分別檢測了人、犬、貓、狐貍、臭鼬、蝙蝠等動物起源樣品，證實我們熒光抗體含有非特異性小、靈敏度高特點，質(zhì)量上不比法國產(chǎn)品差。我們用該方法檢測了我國廣西狗肉市場上出售食用狗腦組織，結果發(fā)覺在154份外觀健康犬中，有5份為狂犬病毒抗原陽性，而且經(jīng)過乳鼠顱內(nèi)接種，我們已分離到這5株狂犬病街毒株?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第30頁6.快速狂犬病酶免疫診療法

RapidRabiesEnzymeImmunodetection(RREID抗狂犬病毒單抗狂犬病毒樣品酶標抗狂犬病毒抗體狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第31頁6.快速狂犬病酶免疫診療法

技術特點：——本試劑盒操作方便、快速靈敏，適于大量樣本檢測?！驹噭┖兄忻笜税灏缓笮桉R上使用或保留于-20C備用?！庋塾^察：陽性對照顯黃顏色，陰性對照完全無色。全部顯黃色樣品，不論深淺均認為是陽性。這種肉眼觀察已足夠作出診療，非常經(jīng)濟，因為不需要昂貴酶標儀，也最適合于作現(xiàn)場流行病學調(diào)查。——酶標儀讀數(shù)：仔細擦凈平板底面，用450nm濾光片讀數(shù)。陽性對照光密度值（OD）必須大于1.0單位，陰性對照OD值須低于0.1單位，判定值（CUTOFF）確實定：陰性對照OD值0.008。OD值等于或大于CUTOFF標本均視為陽性?！栺R林固定樣品不宜作RREID?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第32頁狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第33頁7.各種抗原檢測方法比較：直接熒光抗體試驗（FAT）:最大優(yōu)點是快速、費用低且敏感性和特異性高。快速狂犬病酶免疫診療（RREID）試驗:也是一個快速診療方法，有非常好敏感性和特異性；與FAT一樣，即使標本運輸條件不太好，也不會過多影響結果。RREID也與腦標本快速搜集方法相適應。細胞培養(yǎng)感染試驗(RTCIT）:成神經(jīng)細胞瘤細胞對ＲＶ非常敏感和特異。能在二十四小時以內(nèi)得出結果，可替換小鼠分離病毒方法。但此法只適合在裝備很好、工作人員受過很好訓練試驗室中進行?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第34頁

四狂犬病毒分離和滴度測定

1.

小鼠顱內(nèi)接種分離狂犬病毒法（MIT）：

——該方法敏感，適于不具備組織培養(yǎng)條件試驗室分離狂犬病毒街毒。——耗時較長，僅憑動物發(fā)病癥狀不足以確定為狂犬病毒，需配合免疫熒光法作特異性判定?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第35頁小鼠顱內(nèi)接種分離狂犬病毒法4-6只小白鼠(9-11g重)樣品，0.03ml/只4天后觀察小鼠發(fā)病情況狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第36頁細胞培養(yǎng)分離技術

Cell-cultureIsolationTechniques(CIT)——該方法敏感，配合免疫熒光法可進行特異性快速診療。——需在具備組織培養(yǎng)條件試驗室中進行。狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第37頁狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第38頁狂犬病毒抗原檢測與診療30%腦懸液樣品，5000rmp，30minN2a細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h后固定，加熒光標識抗狂犬病毒核蛋白抗體細胞無熒光，表明樣品中不含狂犬病毒細胞有熒光，表明樣品中含有狂犬病毒狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第39頁狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第40頁膠體金免疫層析法檢測狂犬病毒抗原

試紙有效性標志狂犬病毒陽性標志膠體金墊樣品插入端狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第41頁3.組織培養(yǎng)狂犬病毒快速滴定法待測RV樣品經(jīng)系列稀釋后，分別感染96孔細胞培養(yǎng)板中BSR細胞。該細胞在感染RV后會在細胞質(zhì)內(nèi)形成大量包涵體，其主要成份為RVNP。感染二十四小時后，經(jīng)抗RVNP熒光標識抗體特異性染色，可在熒光顯微鏡下觀察到熒光灶（FF,FluorescenceFocus）。通常在低倍顯微鏡(160X)下檢驗8個視野。滴度用Reed&Muench方法計算，用熒光灶單位(FFU/ml)

狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第42頁狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第43頁2)結果我們將同一份CVS毒種分裝保留于一70℃，在六個月時間內(nèi)重復測定6次，其滴度相當穩(wěn)定（對于病毒稀釋度1：103.5，t=0.445，P>0.05；對于病毒稀釋度1：104.2，t=0.353，P>0.05）。此CVS毒種在小鼠中毒力滴度為5.5LogLD50/ml(Sm=0.4LogLD50/ml),可用作毒力參考標準品。依據(jù)未知RV樣品與此參考樣品在組織培養(yǎng)中用熒光灶單位(FFU/ml)表示滴度比值，可直接換算出其在小鼠中LD50滴度?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第44頁狂犬病毒抗原檢測方法比較診療技術免疫熒光快速酶小鼠顱內(nèi)細胞培養(yǎng)膠體金試驗免疫診療接種分離技術免疫層析法所需時間2-3h3-4h5-10d20-24h5-10min特異性99.99%99.96%ND99.99%ND敏感性99.99%98.06%ND98.21%ND

狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第45頁狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第46頁狂犬病毒抗原檢測與診療各種方法對廣西狗肉市場狂犬病街毒檢測結果樣品例數(shù)MITRREIDIFAPCR（狗腦）陽性數(shù)陽性數(shù)陽性數(shù)陽性數(shù)1024*444*3份為狂躁型，1份為麻痹型狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第47頁五滅活疫苗效價測定1.

改良抗體結合試驗(ABT)在體外快速檢測滅活狂犬病疫苗效力基本原理：

將定量RV中和抗體與系列稀釋滅活狂犬病疫苗在試管中進行抗原抗體反應，疫苗中有效抗原成份會與對應中和抗體結合，即消耗掉部分(或全部)中和抗體。然后將剩下中和抗體用RFFIT方法在細胞培養(yǎng)中進行快速測定。疫苗中有效抗原成份含量越高，剩下中和抗體含量越低；經(jīng)與已知效力疫苗標準品所作對照進行比較，即可推算出待測疫苗效價?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第48頁改良抗體結合試驗(ABT)

在體外快速檢測滅活狂犬病疫苗效力實例：我們對6批滅活狂犬病疫苗用ABT方法測定4次，并與用NIH試驗結果進行比較，兩種方法所得結果差異均無顯著意義(t＝1.39,P>0.05)，即這兩種方法結果基本相符。ABT與NIH效力試驗結果有很好相關性，而且愈加緊速、經(jīng)濟，重復性愈加好。該方法在大多數(shù)情況下可取代NIH效力試驗?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第49頁改良抗體結合試驗(ABT)應用改良ABT相對于NIH試驗有許多顯著優(yōu)點,在德國等國已作為常規(guī)方法，在狂犬病疫苗生產(chǎn)和科研中已普遍使用了約二十年，基本取代了NIH效力試驗。此方法已載入WHO1996年版《狂犬病試驗室技術手冊》（第四版）。WHO推薦將此方法用于疫苗生產(chǎn)過程質(zhì)量控制。不過在《歐洲藥典》中，此方法僅是推薦用于RV糖蛋白濃度檢測方法之一。當然RV糖蛋白濃度與疫苗效力直接相關?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第50頁2.簡化NIH小鼠試驗法

簡化NIH小鼠試驗法標準上與傳統(tǒng)NIH法沒有區(qū)分。

此方法關鍵:將常規(guī)測定三個稀釋度簡化為一個稀釋度，而且此稀釋度只用10只小鼠。

此方法關鍵:正確選定稀釋度。此稀釋度應為假定該疫苗剛好到達2.5IU/劑最低合格要求時50％終點稀釋度(即ED50,又稱50%有效劑量)。按此稀釋度接種10只小鼠，以有8只小鼠存活（得到保護）為合格標準。

狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第51頁稀釋度計算公式此稀釋度可由以下公式計算決定：

D=Dm+log10(n)-log10(N)–log10(v)其中，D＝待測疫苗最小ED50（用慣用對數(shù)表示）。Dm＝參考品疫苗平均ED50（用慣用對數(shù)表示）。n＝待測疫苗效力最低合格要求（IU/ml）。N＝參考品疫苗效力（IU/ml）。v=單劑待測疫苗體積(ml)國外文件上通常采取上述公式。如參考國內(nèi)《規(guī)程》上表述方式（不用對數(shù)），則上式可改寫為更直觀形式：

D=(Dm×n)／(N×v)

狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第52頁稀釋度計算舉例：某參考品疫苗效力N=2IU/ml，其ED50平均值是16倍稀釋，用慣用對數(shù)表示為1.2，即Dm=1.2；單劑待測疫苗體積v=2ml,對其效力最低合格要求是2.5IU/劑，所以n=2.5IU/2ml=1.25IU/ml。按公式計算：D=1.2+log10(1.25)-log10(2)–log10(2)=0.7100.7=5即ED50

為5倍稀釋。如不用對數(shù)而直接計算，結果也相同：D=(16×1.25)／(2×2)=5。將待測疫苗按1:5稀釋接種10只小鼠，試驗結果如有8只以上小鼠存活，則表明該待測疫苗效力大于1.25IU/mlx2ml=2.5IU，即必定該待測疫苗到達最低合格要求?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第53頁五狂犬病毒核酸檢測

1．直接檢測法：用已知互補于選定基因區(qū)一小段核酸序列作探針，進行直接分子雜交檢測目標基因是否存在。

2．間接檢測法：在進行分子雜交檢測目標基因是否存在以前，事先對目標基因進行擴增，再作分子雜交檢測。因為狂犬病毒轉錄和復制產(chǎn)生是RNA，所以擴增第一步必須將病毒RNA進行逆轉錄，成為互補鏈DNA，然后再將該DNA用多聚酶鏈反應(PCR)進行擴增?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第54頁狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第55頁1.基因擴增(PCR)及檢測

PCR技術于1990年首次用于檢測狂犬病毒RNA，近幾年來狂犬病毒分子流行病學研究進展都與該技術應用相關。對原始樣品中微量病毒RNA經(jīng)逆轉錄(RT)產(chǎn)生cDNA后，再經(jīng)PCR進行放大。對放大產(chǎn)物可依據(jù)診療或分型不一樣需要分別用不一樣方法進行分析，如凝膠電泳、斑點雜交、限制性片段長度分析(RFLP)、直接測序等。與傳統(tǒng)病毒分離或免疫學檢測法相比，PCR在敏感性、特異性、尤其是在能提供準確序列資料等方面都要優(yōu)越得多，所以有希望更廣泛地用于狂犬病常規(guī)檢測及分子流行病學研究。

狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第56頁PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電流電泳圖譜狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第57頁狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第58頁狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第59頁RVPCR目標基因在選擇RV基因組中目標基因時，為診療目標應選基因組上保守區(qū)。為分型及判別變異株應選易變區(qū)。

N基因:高度保守且大量轉錄，適合用于常規(guī)檢測，可檢出大樣品中含量很低各種狂犬病毒。

L基因:其內(nèi)若干區(qū)段也極穩(wěn)定，但轉錄量較低，需采取尤其敏感檢測方法。

G和L基因間間隔序列又稱偽基因:是進化上某個蛋白編碼基因殘跡。它最易發(fā)生突變，更能代表病毒自然進化，是最好進化“時鐘”。對偽基因比較尤其適合用于區(qū)分親緣關系相近毒株。

G蛋白:是誘生中和抗體主要抗原且不如N蛋白穩(wěn)定。N蛋白雖不能誘生中和抗體，但與免疫保護反應也有一定關系。為了解不一樣毒株抗原特征和交叉保護分子基礎，常需要對G基因和N基因進行序列比較分析?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第60頁2.以基因擴增對狂犬病毒進行分型和起源判定以PCR為基礎一個簡便實用狂犬病毒分型方法是限制性片段長度多形性分析(RFLP)。比如，用3種限制性內(nèi)切酶即能方便地判別基因1、4、5和6型：一套引物可使樣品中N基因PCR產(chǎn)物為長約1．5Kb片段，對產(chǎn)物分別用3種限制酶消化：1)只有PstI選擇性地切割6型(1個切點)；2)只有4型不被PvuI切割(其余均為1個切點)；3)DdeI可將1型切成2段，將5型切成多段。另一套覆蓋G-L引物可經(jīng)PCR放大在狂犬病毒及相關病毒中最多變偽基因，可用于對關系極近及極遠毒株定型。對放大產(chǎn)物用5種限制酶可區(qū)分6種主要疫苗株(PV、ERA、SADB9、HEP、CVS和PM株)，并可與當前流行野毒株作比較。若用免疫學方法，需用8種抗N和6種抗G單抗才能完成一樣判別任務?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第61頁

狂犬病潛伏期到底能有多長？

PCR技術應用于狂犬病毒起源判定

一個精彩例證：

美國CDCSmith等對從美國3名狂犬病死者分離毒株判定。死者均為移民，其一移民時間已達6年。因為在美國感染狂犬病機會極少，而且PCR／序列分析結果直接證實分離株分別與死者起源國家狗中流行毒株相同，所以該作者以迄今最令人信服方式證實了狂犬病潛伏期可長達6年以上?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第62頁3.狂犬病毒G基因序列測定和系統(tǒng)樹進化分析

1981年Anilionist等報道了狂犬病毒G基因序列，隨即幾年里，又對幾株狂犬病毒部分或全部基因進行測定。由此，經(jīng)過序列分析，對各毒株之間相互關系有了深入了解，明確了狂犬病毒分類分子基礎。逐步將狂犬病毒核酸、氨基酸序列與已知生物學和免疫學特征聯(lián)絡起來。能夠推測或確定病毒抗原決定簇，和病毒致病力相關分子基礎，以及病毒感染、復制和變異等主要功效性氨基酸區(qū)域。這對研制狂犬病毒新型疫苗和抑制狂犬病毒感染和復制有著主要指導作用，從而更有利于對狂犬病毒預防和和亞洲不一樣地域、不一樣起源RV街毒株Ｇ基因全序列，確定決定其毒力、免疫原性和致病性主要功效區(qū)，進行了序列系統(tǒng)進化比較分析，探討我國及周連地域RV遺傳變異規(guī)律?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第63頁我所與法國巴斯德研究所

一項合作研究實例：

(1)RT-PCR及測序引物

參考文件和PV株序列，并用Oligo4.0軟件進行校驗，最終選取引物為：N（55-73）5’ATG-TAA-CAC-CTC-TAC-AAT-GG3’PA(3000-3019)5’TGG-TGT-ATC-AAC-ATG-RAY-TC3’PB(4077-4096)5’ACC-CAT-GTY-CCR-TCC-ATA-AG3’PC(3894-3913)5’GAT-TAC-ACY-ATY-TGG-ATG-CC3’PD(5516-5536)5’GAG-TTN-AGR-TTG-TAR-TCA-GAG3’P15’CTC-ATG-TGA-ACG-GGG-TGT3’狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第64頁(2)病毒RNA提取及RT-PCR于四日齡乳鼠腦內(nèi)接種狂犬病病毒，注射量為0.02ml/只。待小鼠出現(xiàn)顯著癥狀時，取腦進行熒光抗體檢測（IFA）。對陽性鼠腦，采取TRIzol?Reagent(GIBCOBRL)提取總RNA。用N與PC為引物，采取AMVReverseTranscriptase(Promega)逆轉錄合成cDNA。在0.5mlEp管中依次加入35.5μl滅菌水、1μldNTP、5μl10×Buffer、3μlMgCl2、1μlPA(1ulPC)、1μlPB(1ulPD)、1μlcDNA，短暫離心后100℃水浴1min，再加入0.5μlDNA聚合酶，50μl液體石蠟，短暫離心后置于PCR儀：經(jīng)94℃1min，58℃50s，72℃90s共循環(huán)40次，72℃保溫10min后冷卻至4℃。10000r/min離心5min后取下層水相轉入1.5mlEp管，取5μl用于電泳判定，余下-20℃保留用于純化。狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第65頁(3)產(chǎn)物純化采取Wizaed?PCRPrepsDNAPurificationSystem(Promega)純化PCR產(chǎn)物。(4)電泳判定、cDNA序列測定取5μl未純化產(chǎn)物或1μl純化產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖電泳。測序由大連寶生物有限企業(yè)完成。(5)序列分析序列比較排序采取CLUSTER以及GENEDOC軟件處理。狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第66頁聚類分析(進化系統(tǒng)樹構建)狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第67頁2)結果和討論：用計算機分析四株病毒糖蛋白基因（G基因）開放讀碼框架（ORF），四株病毒G基因編碼區(qū)均從起始密碼ATG開始，除終止密碼廣西-4株為TAA外均為TGA，從ATG到終止密碼全長共1575個核苷酸殘基。(1)與其它狂犬病毒GP基因核苷酸序列同源性比較(2)狂犬病毒G基因不一樣區(qū)段比較(3)疫苗評價(4)聚類分析(進化系統(tǒng)樹構建)狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第68頁五、狂犬病毒抗體檢測

WHO狂犬病教授委員會認為大于或等于0.5IU/ml抗體水平表示能得到有效保護。1992年第八屆WHO狂犬病教授委員會必定并推薦將小鼠中和試驗(MNT)和RFFIT作為檢測RV中和抗體兩項基本方法，這兩種方法應作為其它方法基準和參考。MNT是從上世紀30年代就開始采取經(jīng)典方法。自上世紀70年代初開始，RFFIT逐步成為國際上最廣泛接收對MNT替換方法。WHO教授委員會提議在可能時盡可能用RFFIT代替MNT，因前者更加快速、價廉，且靈敏度與MNT相同。狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第69頁小鼠中和試驗

（Mouseneutralizingtest,MNT）

原理：

將一定量預先滴定好攻擊病毒，與待滴定系列稀釋血清孵育。試驗中需設已知滴度參考血清。然后將病毒/血清混和物經(jīng)腦內(nèi)注射初成年小白鼠，計算死亡率和保護50%動物血清稀釋度。

特點：——可定量檢測狂犬病毒中和抗體效價?！鑼ｉT技術培訓，操作較繁瑣?！?4天出結果，耗時長，不利于快速診療。——需較多試驗小鼠，成本高。——動物間個體差會影響試驗結果。狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第70頁小鼠中和試驗

三倍系列稀釋待測血清預先滴定過中和用狂犬病毒（設已知國際單位標準血清對照）CVS鼠腦懸液（稀釋成30-300LD50））

等量混合37℃保溫1小時后

37℃中和1小時重復滴定LD50

顱內(nèi)接種10-12克小白鼠

觀察并統(tǒng)計小鼠發(fā)病及死亡情況

依據(jù)試驗結果計算中和指數(shù)及中和抗體含量狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第71頁2.快速熒光灶抑制試驗

（RFFIT）

RapidFluorescentFocusInhibitionTest基本試驗過程：

將固定劑量CVS病毒與系列稀釋待測血清(包含已知滴度參考血清)一起在96孔細胞培養(yǎng)板中溫育(體外中和反應)。病毒最適劑量在預試驗中預先確定，為經(jīng)二十四小時溫育后能使80%細胞感染(產(chǎn)生熒光包含體)最高稀釋度。中和反應結束后在每孔中加入等量敏感細胞(BSR)懸液。再經(jīng)二十四小時溫育后,細胞單層用丙酮固定,用熒光標識抗NP抗體染色,以檢測未被中和病毒存在(熒光灶FFU)。與病毒對照組比較,計算每種待測血清使固定量CVS病毒FFU/ml降低50%稀釋度，然后與已知滴度參考血清比較，計算每種待測血清中和抗體滴度?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第72頁快速熒光灶抑制試驗三倍系列稀釋待測血清預先滴定過中和用狂犬病毒（設已知國際單位標準血清對照）CVS病毒懸液（稀釋成30-100FFD50））

等量混合37℃保溫1小時后

37℃中和1小時復滴定TCID50

接種96孔已形成單層BSR細胞

CO2孵箱37℃培養(yǎng)24小時

固定并用熒光抗體染色，熒光鏡觀察，統(tǒng)計每孔熒光灶數(shù)量，計算血清抗體效價狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第73頁狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第74頁

病毒最適攻擊量確實定：

二十四小時能使80%細胞被感染最高稀釋度。

狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第75頁MNT和RFFIT檢測RV中和抗體含量變異范圍：

MNT：67%~149%

RFFIT：68%~146%

狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第76頁MNT和RFFIT

檢測2種抗RV血清參考品結果

參考品RFFIT(IU/ml)MNT(IU/ml）

A13.414.0

20.219.5

12.713.9

15.518.0

（GMT）15.216.2

B40.552.2

70.042.2

52.360.0

66.247.3

（GMT）56.050.0狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第77頁微量RFFIT方法建立我所在八年前已開始建立起微量RFFIT方法，并對該方法重復性、特異性和靈敏度與MNT進行了比較，共檢測了數(shù)百份人畜血清樣品。該方法有希望在狂犬病臨床診療、疫苗質(zhì)量控制和流行病學調(diào)查等項工作中取得廣泛應用?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第78頁A.試驗方法1)攻擊病毒制備和滴定：(1)通常采取毒株為固定狂犬病毒CVS株,在BHK/BSR細胞中制備。(2)細胞上清分裝安瓶,儲存在-80℃。(3)最適攻擊劑量為二十四小時溫育后能使80%細胞感染(產(chǎn)生熒光包含體)最高病毒稀釋度(預試驗確定，參見前述組織培養(yǎng)狂犬病毒快速滴定法)?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第79頁2)血清病毒中和反應：(1)待檢血清經(jīng)56℃30分鐘滅活。(2)在96孔板上設置“未感染細胞對照”和“病毒對照”孔。(3)每個血清稀釋度設2個孔。(4)除病毒對照孔外,每個孔加入100lD-MEM培養(yǎng)基。(5)直接在孔中進行待檢血清和參考血清系列3倍稀釋:(每孔已加入100l培養(yǎng)基)將50l血清加入第一排孔,依次從1/3到1/81稀釋。在“病毒對照”孔,加入100l培養(yǎng)基。(6)在含稀釋血清每個孔內(nèi),加入50l預先滴定病毒懸液。在“未感染細胞對照”孔內(nèi),加入50l培養(yǎng)基。在“病毒對照孔”,對病毒懸液進行4次2倍稀釋,從1/2到1/16。(7)在37℃5%恒濕溫箱中保溫1小時?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第80頁3)加入細胞：(1)用胰酶消化細胞,制備濃度為1x106細胞/ml細胞懸液.每孔加入50l細胞懸液(5x104細胞)。(2)在37℃5%CO2恒濕溫箱中溫育二十四小時?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第81頁

4)固定和染色：

(1)用與盛有漂白粉溶液大瓶相連真空裝置抽吸去各孔中上清液。(2)用PBS浸泡各孔3次,每次5分鐘(抽吸上清液)。(3)以80%丙酮浸洗各孔,重復一次(在-20’C放置5分鐘)。抽干各孔,空氣干燥。(4)每孔加入40l抗NP抗體熒光結合物(預先1:20)稀釋),在37’C濕盒中保溫30分鐘。(5)吸出結合物,以PBS洗2次，第一次1分鐘,第二次5分鐘。(6)空氣干燥,每孔加1滴甘油。(7)螢光顯微鏡下觀察?？袢〉膶嶒炇覚z測與診斷技術專家講座第82頁

B.結果觀察1)統(tǒng)計每孔螢光數(shù)(FF)。2)與病毒對照組比較,對每種待測血清計算FF數(shù)降低50%稀釋度。3)與參考血清比較,計算每種待測血清滴度。狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第83頁

C.計算實例:

血清X1/27:15%參考血清:10IU/ml1/81:20%1/81:60%1/243:70%

(50-15)/(60-15)xLog3+Log27(50-20)/(70-20)xLog3+Log81=0.371+1.4314=1.80=0.286+1.9=2.194101.8=63102.194=156.5X/10=63/156.5X=4.03IU/ml狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第84頁用MNT和RFFIT測定2種抗RV中和血清參考品結果

參考品RFFIT(IU/ml)MNT(IU/ml）

A13.414.0

20.219.5

12.713.9

15.518.0

（GMT）15.216.2

B40.552.2

70.042.2

52.360.0

66.247.3

（GMT）56.050.0狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第85頁RFFIT特點：——可定量檢測狂犬病毒中和抗體效價?！臅r較短，可用于準確定量快速診療。——重復性好。——需專門技術培訓，操作較繁瑣。——需熒光顯微鏡。狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第86頁3.酶免疫吸附法（ELISA）：酶免疫吸附法是七十年代建立方法，當前世界上用于檢測狂犬病毒抗體酶免疫法基本上是采取間接ELISA法，其吸附抗原有全病毒顆粒、純化狂犬病毒糖蛋白以及純化狂犬病毒核衣殼蛋白（RNP），并以過氧化物酶標識抗抗體作為標識抗體，即可檢測人及不一樣動物血清中抗狂犬病毒抗體。狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第87頁各種檢測狂犬病毒抗體ELISA法抗原抗體比較酶免疫吸附法吸附抗原所檢測抗體間接ELISA純化狂犬病毒糖蛋白抗狂犬病毒糖蛋白抗體（中和抗體）間接ELISA純化全病毒顆?？箍袢《究贵w（含中和抗體）間接ELISA粗制狂犬病毒抗吸附抗原抗體（含中和抗體）間接ELISA純化狂犬病毒核衣殼蛋白抗狂犬病毒核衣殼蛋白夾心間接ELISA狂犬病毒抗原抗狂犬病毒抗原抗體（含中和抗體）

狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第88頁酶免疫吸附法抗狂犬病毒單抗包被狂犬病毒抗原待檢人血清中抗狂犬病毒抗體酶標抗人IgG抗體顯色底物狂犬病的實驗室檢測與診斷技術專家講座第89頁ELISA特點：——ELISA只需簡單試驗室設備，尤其適合檢測大量血清樣品，且在很短時間內(nèi)即可出結果?！狤LISA法與MNT有很好相關性，在小鼠喂養(yǎng)及