抗氧化酶活性等測定方法

抗氧化酶活性等測定方法葉綠體的提取一、試劑配置1、 PBS 提 取 液： 每 L 水 依 次 加 入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl（0.010×58.5=0.585g）、MgCl0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用時加入 ASA-Na198.1×0.002=0.3962g）;2、懸浮液：將 PBS 提取液中的 MES 換為238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；實際配制：PBS提取液2000ml(3個處理*2個品種*3個重復(fù)*20ml*3次=1080ml),懸浮液100ml（3個處理*2個品種*3個重復(fù)*1ml*3次=54ml）;80%Percol200ml;40%Percol200ml.（3個處理*2個品種*3個重復(fù)*3ml*3次=162ml）2二、提取步驟1、10g鮮樣加20ml提取PBS（50mMMESPH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mMNaCl，2mMMgCl2，2mMEDTA，0.5mMKH2PO4，2mMASA-Na，ASA-Na使用前現(xiàn)配現(xiàn)加）2、快速研磨，使葉片碎成綠豆粒大小， 4層紗布過濾，去除殘渣（注意過濾時不可用力擠壓，以免葉綠體膜破碎）3、濾液2000g3min，小心倒出上清液，將離心管放入離心機(jī)后，使離心機(jī)的加速很快上升到預(yù)定值 (水平轉(zhuǎn)頭，加速度調(diào)到9)，約經(jīng)30s后很快使其下降停止，整個離心持續(xù)大約2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面懸浮物；5、用1ml懸浮液（50mMHEPESpH7.6，含0.33mM山梨糖醇，10mMNaCl，2mMMgCl2，2mMEDTA，0.5mMKH2PO4，2mMASA-Na，ASA-Na使用前現(xiàn)配現(xiàn)加）將沉淀懸浮，在分散葉綠體時宜用毛筆輕輕刷，或者用手握住離心管在冰塊之間攪動，使葉綠體由于震動分散開來，不要用棉球吸濾，以防被膜壓破。葉綠體懸浮時要濃點，含葉綠素2mg.ml-1以上，這樣有利于保持活性。36、2000g1min;7、沉淀再用懸浮液懸浮 ;(懸浮液同5，可以不做)8、用Percol試劑進(jìn)行梯度離心（將3ml含有80%Percol（原液按100%算）鋪在10ml離心管下層，再把3ml40%Percol鋪在離心管中層，然后將1ml葉綠體懸浮液輕輕鋪在離心管上層）1500g2-3min（用水平離心頭的離心機(jī)，離心機(jī)加速要緩慢上升，加速度調(diào)到 1），下降也要緩慢下降，否則會破碎Percol的濃度梯度層的形成，取出會看到3層綠色帶，最上層為破碎的葉綠體，沉在地層的為粗顆粒，40-80%的Percol之間的界面有一層綠色層為完整的葉綠體;9、小心吸出，轉(zhuǎn)移到懸浮介質(zhì)中，使葉綠體濃度達(dá)到1mg.ml-1；（計算：取葉綠體懸浮液 0.1ml，加4.9ml80%的丙酮，搖勻后于 1000g離心2min，上清液置于 1cm的比色杯，在 625nm 上比色，按照公式計算：OD625nm×50/34.5=葉綠素mg/ml）10、測定葉綠體的完整性，完整率達(dá)到 85-95%；參考：TakedaK,OtauboT,KondaN.ParticipationofhydrogenperoxideintheinactivationofCalvin-cycleSHenzymeinso2-furmugatedspinachleaves.PlantandcellPhysiology,1982,23:1009-1018.4取上述制備的完整葉綠體進(jìn)行如下測定：1、用50mMPBS（保護(hù)酶或其他測定項目的緩沖液）稀釋2-5倍，用于測定SOD、POD、CAT、APX；2、用冷丙酮稀釋 2倍，取 0.5ML 提取液用于測定H2O2；（本試驗中用0.2mol/LHClO4稀釋）3、用5%的TCA稀釋2-5倍，取1.5ml用于測定MDA；4、用乙醇：丙酮：水=4.5：4.5：1稀釋，用于測定葉綠素；抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）活性測定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定（氮藍(lán)四唑光化還原法）1、試劑的配制1）0.05mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.8)：母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分別用蒸餾水定容到 1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分別取 A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸5餾水定容至1000ml。參考文獻(xiàn)：李合生主編：植物生理生化實驗原理和技術(shù) .高等教育出版社， 2000：267～268。2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637gMet用磷酸緩沖液（pH7.8）定容至1000ml。3）30μMEDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至 100ml。4）60μM核黃素溶液：取0.0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。5）2.25mM氮藍(lán)四唑(NBT)溶液：取0.1840gNBT用PBS定容至100ml，避光保存。（上述試劑先配好，放到4度冰箱，用之前臨時按下面的方法配，然后放在4度冰箱中，不要在最上層，避免見光，第一組樣品加好后拿出來加，加完后放回冰箱，第二組的樣品加好后再拿出來加）酶液制備：取0.2g（可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，加入1.6ml50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4℃、12000g下離心20min，上清液即為酶液。2、酶活性測定（1）反應(yīng)混合液配制(以60個樣為準(zhǔn))：分別取Met6溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml（加的量和前面的濃度要核對），磷酸緩沖液5.4ml，NBT溶液6ml，核黃素溶液6ml,混合后搖勻；SOD反應(yīng)混合液：3個處理*2個品種*3次重復(fù)*3ml*3次測定=162ml(實際配置200ml)（2）分別取3ml反應(yīng)混合液和30μl（可視情況調(diào)整，最好先做一個濃度梯度，看加多少合適，如果量太少，最好稀釋后再加，這樣精確 ）酶液于試管中（盡可能加到試管的底部，要靠著試管壁打下去先加酶液，后加反應(yīng)液，加好后搖一搖，看看試管上是不是有霧氣，最好拿紗布把試管下邊擦一下，免得霧氣擋住光線照過去）；3）將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000lux光照下反應(yīng)20min；（照光很重要，試管要選擇相同規(guī)格的，因為不同的試管透光率是不一樣的，試管架不要選擇遮光7的，這個最好分組做，同時幾組做相互之間會遮光，每一組一個重復(fù)，就是每一組中都要有所有的處理，且都要有一個最大管，處理多的話，把根和葉分開做，最大管放在中間）同時做兩支對照管，其中1支試管取3ml反應(yīng)混合液加入30μlPBS（不加酶液）照光后測定作為最大光還原管，另1支只加緩沖液置于暗中測定時用于調(diào)零。4）以不照光的對照管（只有緩沖液并置于暗處）調(diào)零后，避光測OD560(出現(xiàn)顏色即可測定)。5）酶活性計算：SOD活性單位以抑制NBT光化還原50％所需酶量（測的樣品值要在最大管的一半左右才合適，否則要調(diào)整酶量 ）為1個酶活單位（u）。SOD總活性＝[(Ack-AE)×V]/（1/2Ack×W×Vt）SOD比活力＝SOD總活性/蛋白質(zhì)含量SOD總活性以鮮重酶單位每克表示（u/gFW）；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；Ack為照光對照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml,1.6ml，加入PBS的體積)；Vt為測定時的酶液用8量（ml，30ul）；W為樣品鮮重（g，測定時應(yīng)換算為葉綠體的質(zhì)量mg）；蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。二、POD、CAT酶活性的測定粗酶液制備同SOD。1、過氧化物酶（POD）活性測定（愈創(chuàng)木酚法）（1）試劑配制：0.2mol/L 磷酸緩沖液(pH6.0)：分別取 A 母液(Na2HPO4)123ml和B母液(NaH2PO4)877ml混勻即為1000mlPBS(0.2M，pH6.0)；（2）反應(yīng)混合液配制（以 60個樣為準(zhǔn)）：取200mlPBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液體（原液）愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）加熱攪拌溶解，冷卻后加入0.112ml30％的H2O2，混勻后保存于冰箱中備用。POD反應(yīng)混合液：3個處理*2個品種*3次重復(fù)*3ml*3 次測定=162ml(實際配置 200ml, 0.076ml,0.112ml)（3）樣品測定：取3ml反應(yīng)液并加入30μl酶液，以PBS為對照調(diào)零，而后測定OD470值（測定40秒）。（邊加樣邊測定，9測定前等待5秒，動作要快，如果慢的話，要保證每個樣品從加好樣到開始記時的時間相差不大 ）4）酶活性計算：以每minOD值變化（升高）0.01為1個酶活性單位（u）。POD=（ A470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/gmin)A470：為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml，(1.6ml）；Vs為測定時取用酶液體積（ml，30ul）。2、過氧化氫酶（CAT）活性測定（1）試劑配制：0.15mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4)457.5ml和B母液(NaH2PO4)292.5ml混合后用蒸餾水定容至1000ml。2）反應(yīng)液配制：取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）搖勻即可。CAT反應(yīng)液：3個處理*2個品種*3次重復(fù)*3ml*3次測定=162ml(實際配置200ml,0.3092ml)3）樣品測定：取3ml反應(yīng)液加入0.1ml（可視情況調(diào)整）酶液，以PBS為對照調(diào)零，測定OD240（紫10外）（測定40s）。（4）酶活性計算：以每minOD值減少0.01為1個酶活性單位（u）。CAT=[ A240×Vt]/（W×Vs×0.01×t） (u/gmin)A240：為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml，1.6ml）；Vs為測定時取用酶液體積（ml,0.1ml）。三、抗壞血酸過氧化物酶（ APX）活性的測定（緩沖液為 K）1、試劑配制（按 50個樣計算）：1）0.05mol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖液（pH7.0）的配制：A）K2HPO4·3H2O：228.22×0.05×0.61=6.9607gB）KH2PO4：136.09×0.05×0.39=2.6538g，以上兩者混合起來用去離子水定容到1L。2）0.1mMEDTA-Na2：取0.01861gEDTA-Na2用PBS溶液定容到500ml（372.24g/M×0.1mM×500ml=0.01861g）；3）5mMAsA：取0.044g抗壞血酸用PBS溶液定容到50ml（現(xiàn)用現(xiàn)配，176.13g/M5mM×50ml=0.044g）；4）20mMH2O2：取0.2ml,30%H2O2用去離子水11稀 釋 到 100ml （ 30% H2O2 為550g×30%/(34.01g/M×0.5L)=9.703M）。實際配置0.1mM EDTA-Na2：3個處理*2個品種*3次重復(fù)*1.7ml*3次測定=91.8ml;（實際配置250ml,0.009305g）5mM的AsA:3個處理*2個品種*3次重復(fù)*0.1ml*3次測定=5.4ml;（實際配置50ml,0.044g）20mMH2O2:3個處理*2個品種*3次重復(fù)*0.1ml*3次測定=5.4ml;（實際配置50ml,0.1ml）2、酶活性的測定（以 2ml體系測定）1）取0.10ml酶液（可視情況調(diào)整），加入1.70ml含0.1mMEDTA-Na2的PBS（0.05mol/L，pH7.0），再加入0.10ml5mM的AsA，最后加入0.10ml20mMH2O2，立即在20℃下測定D290（紫外）值在40s內(nèi)（測定時間內(nèi)變化大可測定的時間短點， 否則長點）的變化，計算單位時間內(nèi)AsA減少量和酶活性（室溫下測定，緩沖液調(diào)零）。計算公式：12OD/△t×Vr×VTA×d×Vt×W△OD為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化（40秒吸光度－0秒吸光度）；△t為反應(yīng)時間（40秒）；Vr為反應(yīng)液體積2mL）；VT提取液體積（1.6mL）；A為消光系數(shù)2.8mM-1.cm-1）；d為比色杯厚度（1cm）；Vt測定液體積（0.1mL）；W為樣品鮮重（0.2g）。四、超氧陰離子自由基（ O2.-）產(chǎn)生速率的測定（羥胺氧化法）1、試劑的配制1）1mM鹽酸羥胺溶液：稱取0.02085g鹽酸羥胺用蒸餾水定容至300ml；2）17mM對氨基苯磺酸溶液：稱取1.1776g對氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=1：3配制）加熱溶解后定容至400ml；3）7mMα-萘胺溶液：稱取0.4008gα-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3：1配制）定容至400ml。實際配置PBS（0.05M，pH7.8）:3個處理*2個品種*3次重復(fù)*0.5ml*3次測定=27ml;（實際配置100ml）1mM鹽酸羥胺溶液:3個處理*2個品種*3次重復(fù)13*1ml*3次測定=54ml;（實際配置100ml,0.00695g）17mM對氨基苯磺酸:3個處理*2個品種*3次重復(fù)*1ml*3次測定=54ml;（實際配置100ml,0.2944g）7mMα-萘胺溶液：3個處理*2個品種*3次重復(fù)*1ml*3次測定=54ml;（實際配置100ml,0.1004g）2、O2.-含量的測定1）樣品液提取方法同SOD測定；2）取0.5ml提取液（酶液）（可視情況調(diào)整用量）中加入0.5mlPBS（0.05M，pH7.8），1ml1mM鹽酸羥胺溶液后搖勻。3）在25℃下保溫1小時；4）依次先加入1ml17mM對氨基苯磺酸，再加入1ml7mMα-萘胺，混合后快速搖勻；5）在25℃下保溫20min后在3000×g下離心3min后馬上進(jìn)行測定（或置于冰箱待測）；6）以對照管調(diào)零（用水調(diào)零），取粉紅色水相液測定OD530值（測定）；7）O2.-含量的計算：由測得的OD530，查NO2-標(biāo)準(zhǔn)曲線得到[NO2-]；根據(jù)羥胺與O2.-的反應(yīng)式：NH2OH14＋2O2.-＋H+NO2-＋H222O計算[O2.-]，即O＋H[NO2-]×2=[O2.-]；再根據(jù)樣品與羥胺反應(yīng)的時間和樣品中的蛋白質(zhì)含量，求得O2.-產(chǎn)生速率（以nmolmin-1mg-1蛋白表示，也可以nmolmin-1g-1鮮重表示）。.-產(chǎn)生速率=（C×V）/（t×W）（nmolmin-1-1O2g鮮重）C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的濃度(umol/L)；V為測定時所取提取液用量(葉綠體稀釋后的體積)；t為反應(yīng)時間(60min)；W為樣品鮮重(葉綠體實際質(zhì)量g)參考文獻(xiàn)：王愛國，羅廣華．植物生理學(xué)通訊， 1990，（6）：55～57五、可溶性蛋白含量的測定（考馬斯亮藍(lán)染色法）1、試劑的配制1）考馬斯亮藍(lán)溶液配制：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)，溶于50ml90％乙醇中，加入100ml85％（W/V）的磷酸，再用蒸餾水定容到1Ｌ。在過夜后過濾并貯于棕色瓶中，常溫下可在暗中保存一個月。（2）100μg/ml牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取25mgBSA加水溶解后定容至100ml，再從中吸取40ml用蒸餾水定容至100ml（也可取10mgBSA定容至100ml即為100μg/ml標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液）。實際配置150.05M，pH7.8磷酸緩沖液：3個處理*2個品種*3次重復(fù)*0.08ml*3次測定=0.3456ml;（實際配置100ml,）考馬斯亮藍(lán)溶液 :3個處理*2個品種*3 次重復(fù)*2.9ml*3次測定=156.6ml;（實際配置200ml，20mg）2、樣品可溶性蛋白含量的測定1）樣品可溶性蛋白含量測定：取20μl提取液（酶液）加入80μl，0.05M，pH7.8磷酸緩沖液（即稀釋成0.1ml提取液），再加入2.9ml考馬斯亮藍(lán)溶液，反應(yīng)2min后測OD595（以100μl緩沖液加2.9ml考馬斯亮藍(lán)為對照調(diào)零）。（2）蛋白質(zhì)含量計算：可溶性蛋白質(zhì)含量（mg/g）=(C×VT)/(W×VS×1000)C為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的蛋白質(zhì)含量（μg）；VT為提取液總體積（稀釋后的體積ml）；VS為測定時所用提取液體積（ml，20μl）；W為樣品鮮重（g）。過氧化氫（H2O2）含量的測定一、試劑配制：1、0.2mol/LHClO4：取10.05gHClO4溶解于0.5L的水中；2、4mol/LKOH：取112gKOH溶解于0.5L的水中；163、0.1 mol/L ，pH 6.5 的磷酸緩沖液：Na2HPO4·12H2O5.6407g+NaH2PO4·2H2O5.3433g用去離子水定容到500ml；4、顯色液：100mL、0.1mol/L、pH6.5的磷酸緩沖液+25μLN,N-二甲基苯胺+10mg4-氨基氨替吡啉；5、過氧化物酶溶液（250U/mL）二、測定步驟：稱取植株根和葉片組織各0.5g，分別置于研缽中，加入1.6mL預(yù)冷至4℃的0.2mol/LHClO4，冰浴勻漿，于10000×g離心5min（4℃），取上清液，加4mol/LKOH調(diào)pH值為7.5后，再于10000×g離心5min（4℃），取上清液1mL，加0.4mL顯色液和0.1mL過氧化物酶溶液（250U/mL），用島津UV-1601分光光度計測定波長550nm（可見）處光密度值的變化，H2O2含量以μmol/gFW表示。（用什么調(diào)零？）三、計算方法：（要做標(biāo)線？）參考：過氧化氫（ H2O2）含量的測定參照 Uchida等(2002)方法并加以改進(jìn)。還原型谷胱苷肽 GSH2． 試劑配制（1）1mMGSH標(biāo)準(zhǔn)液10mL（現(xiàn)用現(xiàn)配）：稱3.0733mgGSH,加蒸餾水至10mL。(不要)（2）5％磺基水楊酸500mL：25g溶于500mL水中。173）6mMDTNB：稱取0.118905gDTNB溶于50mLPBS（0.1M，pH7.5）中。4）2mMNADPH：18.1mgNADPH溶于10mLPBS中。5）1mMGSSG標(biāo)準(zhǔn)液10mL：6.126mgGSSG加PBS至10mL。(不要)實際配置0.1MPBS(pH7.5):3個處理*2個品種*3次重復(fù)*0.5ml*3次測定=27ml;（實際配置50ml）6mMDTNB: 3個處理*2個品種*3次重復(fù)*0.2ml*3次測定=10.8ml;（實際配置50ml，實際用量0.1189g）2mM NADPH: 3個處理*2 個品種*3 次重復(fù)*0.1ml*3 次測定=5.4ml;（實際配置 50ml,實際用量18.1mg）(1U)GRⅢ:3個處理*2個品種*3次重復(fù)*0.1ml*3次測定=5.4ml;（實際配置50ml,實際用量10ml）5％磺基水楊酸： 3個處理*2個品種*3次重復(fù)18*0.01ml*3次測定=0.54ml;（實際配置10ml）(實際用量0.5g/10ml)0.5mMPBS:3個處理*2個品種*3次重復(fù)*1.5ml*3次測定=81ml;（實際配置100ml）乙醚（二乙醚）:3個處理*2個品種*3次重復(fù)*10ml*3次測定=540ml;（實際配置1000ml）PBSBuffer0.5mM:3個處理*2個品種*3次重復(fù)*1.5ml*3次測定=81ml;（實際配置150ml）2-乙烯吡啶:3個處理*2個品種*3次重復(fù)*0.2ml*3次測定=10.8ml;（實際用量20ml）乙醚:3個處理*2個品種*3次重復(fù)*10ml*3次測定=540ml;（實際用量1000ml）1．標(biāo)線制作：配制濃度為0，0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM的標(biāo)準(zhǔn)GSH溶液（吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液各0.1mL）加入0.5mL0.1M磷酸鈉Buffer（pH7.5）(含5mMEDTA)，0.2mL196mMDTNB,0.1mL2mMNADPH,0.1mL(1U)GR Ⅲ（谷胱甘肽還原酶）(sigma),從0.1mLGSH啟動反應(yīng)，測定650s的A412（OD412），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以PBS代替DTNB作空白。3． GSH（還原型谷胱甘肽）及GSSH（氧化型谷胱甘肽）（1）取1g新鮮葉片，加入10μL（可以取0.2g鮮樣，加1.6ml提取液）5％磺基水楊酸，研磨后在14000g離心10分鐘，取1mL上清液，加入1.5mL,0.5mMPBS（pH7.5）中，再用5mL乙醚（二乙醚）抽取二次（雜質(zhì)會融到乙醚層中，而乙醚處于整個反應(yīng)體系得上層，你直接用槍吸取上層乙醚丟棄即可，反復(fù)進(jìn)行兩次即為抽取兩次），此提取液用于分析總谷胱苷肽含量。各取1mL上清液，加入1.5mLPBSBuffer0.5mM(pH7.5),0.2mL2-乙烯吡啶（原裝試劑濃度）混合至乳膠狀，在25℃反應(yīng)1小時，再用5mL乙醚（原裝試劑濃度）抽提2次，此提取液用于分析GSSG『GSSG－氧20化型谷胱甘肽， GSH－還原型谷胱甘肽不能夠直接測出，需測出氧化型和還原型谷胱甘肽含量，即總的谷胱甘肽含量，然后減去氧化型谷胱甘