基因診斷治療

基因診斷治療第1頁/共149頁基因診斷第2頁/共149頁概述幾乎所有的疾病均在一定程度上與基因有某種聯(lián)系，基因的改變，或是疾病發(fā)生的原因，或是疾病發(fā)生的結果，或是疾病發(fā)生時的伴隨現(xiàn)象，而這些現(xiàn)象的出現(xiàn)是有規(guī)律的。因此，可以通過檢測基因的改變來反映疾病的發(fā)生和發(fā)展，療效和預后。第3頁/共149頁

基因診斷主要內容

一、基因診斷概念

二、基因診斷常用技術

三、基因診斷策略

四、基因診斷在臨床的應用

1.在遺傳性疾病診斷中的應用

2.在傳染性疾病診斷中的應用

3.在腫瘤診斷中的應用

4.在法醫(yī)學上的應用

五、基因診斷存在的問題和發(fā)展前景

4第4頁/共149頁基因診斷的出現(xiàn)：1976年加州大學華裔科學家KanYW用核酸分子雜交首次對一例α珠蛋白生成障礙性貧血進行診斷。第5頁/共149頁

狹義:在基因（DNA或RNA)水平，用PCR、核酸雜交、基因重組、基因芯片等各種分子生物學技術檢測特定基因存在與否、結構變異和表達狀態(tài)的過程，對疾病作出診斷。

基因診斷的概念第6頁/共149頁核酸分子雜交技術PCR及其衍生技術限制性酶譜分析限制性片段長度多態(tài)性分析寡核苷酸探針雜交DNA芯片技術DNA測序技術二、基因診斷中常用的幾種技術

第7頁/共149頁(一)核酸分子雜交技術(1)方法:以已知順序核酸片段作為探針,經(jīng)放射性或非放射性物質標記后,再與未知的目的核酸片段進行雜交反應,分離已雜交和未雜交的標記核酸鏈,通過標記信號的檢測就可以對未知的目的核酸鏈進行定性、定量分析.第8頁/共149頁(2)幾種不同形式的核酸分子雜交

a.Southern印跡(southernblot)雜交:

用于DNA的檢測，可用于基因的限制性內切酶譜分析，基因突變分析等．b.Northern印跡(Northernblot)雜交:

用于RNA的檢測，能對組織細胞中的總RNA或mRNA進行定性和定量分析．c.斑點雜交（dotblot):

既可以檢測DNA也可以檢測RNA,用于特定基因及其表達的定性和定量分析．方法簡單、靈敏；但特異性低．

d.原位雜交（insituhybridization):

是細胞學技術與核酸雜交技術結合的一種核酸分析檢測技術．可分為DNA原位雜交和RNA原位雜交,用于檢測染色體中特定的基因位置，用于染色體疾病的診斷．

分類:①玻片原位雜交:如中期的染色體和組織切片.②膜上原位雜交:將菌落或噬菌斑影印在尼龍膜(如硝酸纖維膜)

第9頁/共149頁原位雜交的鏡像圖第10頁/共149頁(二)PCR技術在基因診斷中的應用（１）等位基因特異性寡聚核苷酸（allelespecificoligonnucleotide,ASO)探針斑點雜交：PCR-ASO該方法是診斷已知點的突變：需分別合成野生型和突變型探針．在基因診斷時，只需用PCR擴增受檢者目的DNA片段，再分別與上述探針雜交．雜交的結果有如下幾種情況：

①PCR擴增產(chǎn)物與正常探針雜交，不與突變探針雜交—不存在這種突變；②只與突變探針雜交--突變基因為純合子；③與正常探針和突變探針都可雜交--突變基因為雜合子；④與正常探針和突變探針都不能雜交--突變基因不屬于已發(fā)現(xiàn)的類型第11頁/共149頁ASO探針雜交檢測已知點突變受檢者基因組DNA或含突變位點的PCR擴增產(chǎn)物與標記的ASO探針雜交ASO1ASO2NormalHeteroHomo第12頁/共149頁（２）PCR-單鏈構象多態(tài)性（PCRsinglestrandconformationploymorphism,PCR-SSCP)分析

是一種基于單鏈DNA構象差別來檢測點突變的方法．DNA變性形成單鏈，在中性條件下長度相同的單鏈DNA,如果堿基組成和(或)排列順序不同,形成的構象就不同,這樣就形成了單鏈構象多態(tài)性.這些分子在非變性PAGE電泳中表現(xiàn)出不同的遷移率.

SSCP特別適于分析小于400bp的PCR產(chǎn)物。據(jù)認為SSCP可以區(qū)分1bp的差異

PCR-SSCP分析不能確定基因變異的內容，因此電泳后結果有差異后還需進行測序分析，確定變異性質

第13頁/共149頁PCR-SSCP分析原理示意第14頁/共149頁(3)PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCRrestrictionfragmentlengthpolymorphisms,PCR-RFLP）分析基因突變導致的基因堿基組成或(和)順序發(fā)生改變,會在基因結構中產(chǎn)生新的限制性內切酶位點或使原有的位點消失.用限制酶對不同個體基因組進行消化時，其電泳條帶的數(shù)目和大小就會產(chǎn)生改變，根據(jù)這些改變可以判斷出突變是否存在.第15頁/共149頁

限制性片段長度多態(tài)性

RFLPs(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)樣品一樣品二1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP為遺傳標記繪制了第一張人類遺傳圖譜第16頁/共149頁(4)PCR-變性梯度凝膠電泳分析技術

雙鏈DNA在一定濃度變性劑(尿素,甲酰胺)作用下,會變性而解鏈,導致DNA分子電泳遷移率變化.當在不同梯度濃度變性膠中電泳時,

DNA泳動到變性劑濃度能使DNA發(fā)生變性，DNA開始解鏈，從而不同的DNA片段會形成不同的遷移率條帶．優(yōu)點：可靠，檢出單堿基突變率可達９５％．缺點：富含高熔點GC區(qū)時，則難以檢測出突變．第17頁/共149頁18變性梯度凝膠電泳圖第18頁/共149頁熒光定量PCR(FQ-PCR)技術是一種目前國內外應用較為廣泛的定量PCR技術,是通過始點定量和熒光檢測系統(tǒng)實時監(jiān)測累計熒光強度而實現(xiàn),具有靈敏度高,特異性強等優(yōu)點.FQ-PCR技術的兩種定量形式:

①絕對定量:一般采用外標準品定量的制備來實現(xiàn)絕對定量.如合成目的基因;將PCR產(chǎn)物直接梯度稀釋;或將PCR產(chǎn)物克隆到載體上,抽取質粒,經(jīng)過測量濃度和拷貝數(shù)可準確定量.優(yōu)點:穩(wěn)定,準確.

②相對定量:指在測定目的基因的同時測定一內源性管家基因(如β-actin,rRNA等),該管家基因主要是用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較,反映反應體系內是否存在PCR擴增的影響因素.(6)定量PCR(quantiativePCR,Q-PCR)

第19頁/共149頁(7）DNA序列測序1.1977年Sanger創(chuàng)建的鏈終止反應序列測序法用放射性同位素標記引物，用雙脫氧核苷酸隨機終止DNA鏈的延伸，產(chǎn)生長度不同的DNA片段，再用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離這些片段，放射自顯影讀出結果。第20頁/共149頁第21頁/共149頁222.自動測序法采用四色熒光標記代替了放射性同位素標記。

DNA測序測定是基因突變檢測的最直接，最準確的方法，它不僅可確定突變的部位，還可確定突變的性質第22頁/共149頁（8）DNA芯片技術DNA芯片（DNAchip)又稱為基因芯片，DNA微陣列（DNAmicroarray)該技術的基礎仍然是利用核酸分子雜交原理：首先將一系列預先設計好的核酸探針（oligosorcDNA)有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龍膜等固體支持物上，制成DNA微陣列。用熒光標記待測樣品（DNA,cDNA,RNA)與位于芯片上的核酸探針雜交后，通過激光共聚焦熒光掃描系統(tǒng)檢測雜交信號強度，再用特定的軟件對熒光信號進行綜合分析，就能獲得待測樣品的大量基因序列信息或表達信息。

第23頁/共149頁基因芯片技術第24頁/共149頁25

基因芯片按照用途分為：表達芯片，診斷芯片，指紋圖譜芯片，測序芯片，毒理芯片等。該技術可用于新基因鑒定，突變檢測，表達監(jiān)控和遺傳制圖等。第25頁/共149頁

基因表達的分析第26頁/共149頁三、遺傳病的基因診斷一.遺傳病基因診斷的策略1.直接策略：采用基因突變的診斷方法，直接檢測致病基因。該策略的前提是基因已被克隆.

2.間接策略：即通過檢測與致病基因連鎖

的遺傳標記進行基因診斷.第27頁/共149頁二、人類基因組上的DNA遺傳標記

限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs

)1985短串聯(lián)重復序列(shorttendemrepeats,STRs,mini-satellites)1990s單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotidepolymor-phismsSNPs)第28頁/共149頁短串聯(lián)重復序列STRs(shorttendemrepeats,Microsatellites)STR廣泛存在于人基因組，占約5%，基本單位是1bp-8bp的串聯(lián)重復，重復次數(shù)n=15-60，已知8000多個主要形式為：

(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，

(CGG)n，其中以

(CA)n，(GT)n為多見。1992年，Welssenbanch等以STR為標記的第二代連鎖圖取代了RFLP連鎖圖。第29頁/共149頁

主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。與RFLP與STR不同,它是直接以序列的變異作為標記,而不是以片段的長度差異作為標記.人類基因組圖譜的初步分析表明，共有3萬至3.5萬個基因。有300多萬個單核苷酸多態(tài)性,SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，3-4個相鄰的標記構成的單倍型（haplotype）就可有8-16種。

1996年，Lander報道了用單核苷酸多態(tài)性標記制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標記。單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidpolymorphism，SNP）第30頁/共149頁

SNP用作遺傳標記具有以下優(yōu)點：①SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計出來。②它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標記廣泛得多。③與串聯(lián)重復的微衛(wèi)星位點(STR)相比，SNP是高度穩(wěn)定的.尤其是處于編碼區(qū)的SNP(cSNP),而前者的高突變率容易引起對人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。④部分位于基因內部的SNP可能會直接影響產(chǎn)物蛋白質的結構或基因表達水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機制的候選改變位點。⑤易于進行自動化分析，縮短了研究時間.第31頁/共149頁四、基因診斷技術在臨床的應用32第32頁/共149頁血紅蛋白病的基因診斷

分為異常血紅蛋白病和地中海貧血,前者是由于珠蛋白的基因突變；后者是由于珠蛋白合成速率降低，a鏈和b鏈合成不平衡。（一）異常血紅蛋白病的基因診斷：

如鐮狀紅細胞貧血病:β鏈第六位氨基酸:GAA(谷)→GUA(纈)代替.

對該病的基因診斷應采用:

1)PCR-限制酶切,即用PCR從患者基因組擴增含突變位點的珠蛋白基因片段,再選適當?shù)膬惹忻赶疨CR產(chǎn)物,根據(jù)電泳圖譜上片段數(shù)量和大小做出判斷

2)Southern印跡雜交分析第33頁/共149頁

HbA、HbS和HbC的密碼子及蛋白質區(qū)別

β珠蛋白基因的第6位密碼子有三種形式：正常紅細胞的基因βA、鐮狀紅細胞的基因βS和另一種相對常見的血紅蛋白C的基因βC。第34頁/共149頁設計一對引物進行PCR擴增，擴增序列中必須包括第5、6、7密碼子，擴增后用MstⅡ限制性內切酶對擴增產(chǎn)物進行水解，通過對水解片段的電泳分析或進行Southern雜交分析可以做出正確的診斷。限制性內切酶MstⅡ識別序列為CCTNAGG，N可以是任意核苷酸。因此β珠蛋白基因的第5、6密碼子和第7密碼子的第一個核苷酸序列是該內切酶的識別位點。但是在發(fā)生鐮狀突變后該酶切位點消失。第35頁/共149頁×MstⅡ酶切位點(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析第36頁/共149頁+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者酶切產(chǎn)物電泳分析第37頁/共149頁酶切產(chǎn)物Southern印跡雜交分析用寡核苷酸探針和PCR產(chǎn)物進行雜交檢測點突變被檢靶片段經(jīng)PCR擴增、酶切，并經(jīng)電泳分離后轉移到膜上，與經(jīng)標記寡核苷酸探針雜交探針為β珠蛋白基因5′端的基因片斷第38頁/共149頁圖示β珠蛋白基因純合子A（AA）、純合子S(SS)和雜合子AS個體的DNA雜交結果第39頁/共149頁PCR產(chǎn)物僅與完全互補的探針進行雜交含突變序列的產(chǎn)物僅與突變探針雜交PCR產(chǎn)物分別與經(jīng)標記的野生型和突變型靶基因序列的寡核苷酸探針雜交，根據(jù)有無雜交信號判斷被檢擴增片段中是否帶有突變點第40頁/共149頁

b-珠蛋白基因點突變

GAG(Glu)-->GTG(Val)

bAprobeACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCbSprobeACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC

HeterobAprobebSprobeHomoNormal第41頁/共149頁（二）α地貧的基因診斷：1.定性分析：PCR法直接擴增α1和α2，基因的3’端有差別，針對此可設計引物進行PCR，如有缺失，則不能擴增出產(chǎn)物。2.定量分析:α地貧的共同特點是α珠蛋白mRNA的量減少，因此可用RT-PCR定量分析mRNA的量以助診斷。第42頁/共149頁重型地貧:胎兒水腫綜合征

早產(chǎn)死胎或出生前后死亡

可導致嚴重產(chǎn)科并發(fā)癥

無理想治療方法第43頁/共149頁44α基因不同程度的缺失引起不同類型的α地貧，α基因缺失1～4個。正常Gene組用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一個αGene時可得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobeα地貧的Gene診斷

第44頁/共149頁以αGene為探針，Southernblot方法檢測αα/αααα/α-αα/--α-/----/--

正常缺1缺2缺3缺44514kb10kb第45頁/共149頁（三）β-地貧的基因診斷

1.DNA檢測與分析：①PCR-ASO探針法為主要方法：根據(jù)β-珠蛋白主要突變位點，設計2對引物，擴增可能發(fā)生突變的2個片段,再分別與相應野生型探針和突變探針進行斑點雜交。②PCR-RFLP連鎖分析法：檢測與β-珠蛋白基因連鎖的遺傳標記進行基因診斷,如β-珠蛋白5’端有一限制內切酶HgiAI的多態(tài)性位點,在中國人群的頻率為0.5③DNA芯片技術

2.RNA檢測與分析：RT-PCR定量分析mRNA的量以助診斷第46頁/共149頁杜氏肌營養(yǎng)不良癥的基因診斷

(Duchennemusculardystrophy,DMD)

DMD：是性連鎖隱性遺傳病,是由抗肌萎縮蛋白(dystrophin)基因突變(突變或缺失)。其突出特點為橫紋肌進行性萎縮，引起無力和攣縮。DMD患兒在5歲前發(fā)病，20歲左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，發(fā)病率在男性活嬰中約1/3500。第47頁/共149頁DMD是一種嚴重致死性疾?。╔R），臨床癥狀表現(xiàn)肌肉進行性萎縮和乏力。BMD臨床癥狀與DMD相似，但癥狀較輕。Gene定位Xp21，Gene2300kb,79個Exon，cDNA全長13974bp編碼3685Aa，分子量427kD。DMD/BMD70%左右為缺失型，基因很大，缺失可能發(fā)生在不同的部位。應用多重PCR擴增檢測，判斷缺失狀態(tài)。48第48頁/共149頁杜氏和貝氏肌營養(yǎng)不良癥的基因診斷

多重PCR檢測患者缺失凝膠電泳圖（9對引物）P1除外顯子1外其余均缺失；

P2外顯子8－19有小的缺失；P3外顯子44-50缺失；

P4外顯子45－52有小的缺失；B1空白對照；C1、C2正常對照。第49頁/共149頁臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結石。最終導致腎功能衰竭和尿毒癥。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質和疾病發(fā)病機理也尚未闡明，但已證實APKDGene與α珠蛋白基因3’端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列（3’HVR）緊密連鎖，因此，可以通過RFLP連鎖分析進行診斷。50成年型多囊腎病的基因診斷—APKD，AD第50頁/共149頁

以3’HVR為probe與PvuII酶切后的家系有關成員的Gene組DNA雜交——SouthernBlot雜交

Gene組DNAprobe（3'HVR）PvuII酶切

DNA片段

雜交結果51第51頁/共149頁結果1212345

5．7kb3．4kb2．3kb

52第52頁/共149頁結果分析

患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段,說明致病基因與3.4kb片段連鎖,并按孟德爾方式遺傳.II5不含3.4kb片段,產(chǎn)前診斷正常.53第53頁/共149頁甲型血友病的基因診斷54血友病是一種遺傳性凝血功能障礙的出血性疾病，由于正常凝血過程中血漿凝血的活力有缺陷所致?；颊叱Ｒ虺鲅恢够蚶^發(fā)病而夭折，治療主要靠替代療法，輸入缺乏的血漿因子。重型血友病甲和乙的男性發(fā)病率為1/5000~1/50000。為甲型血友病和乙型血友病。

第54頁/共149頁已知甲型血友病XR，獲得家系成員基因組DNA。

PCR142bpBcLI

142bp+99bp+43bp

電泳結果分析？55p1p2142bp99bp43bpBclIBclI-BclI+第55頁/共149頁問:1：Ⅱ2、Ⅲ1診斷；2：

Ⅲ1是男或是女發(fā)??？

56142bp99bp12123ⅠⅡIII1第56頁/共149頁結果分析1）先癥者II2具有99bp片段而發(fā)病，該片段來自母親。2）II2有142bp/99bp雜合子。142bp來自父親，為正常片段，99bp片段是來自母親而成為攜帶者。3）Ⅲ1為99bp片段如果是男性為患者（99bp片段來自母親）；女性為攜帶者（來自父母雙方）。57第57頁/共149頁58腫瘤的基因診斷腫瘤的發(fā)生涉及多個基因、多種因素、發(fā)生過程呈多階段性、發(fā)生的分子機制十分復雜,因此對不同的腫瘤要采用不同的基因診斷策略.第58頁/共149頁

一.通過檢測腫瘤染色體易位及融合基因診斷腫瘤淋巴造血系統(tǒng)腫瘤:

染色體易位及基因融合是較普遍的現(xiàn)象.如:淋巴瘤和淋巴結反應性增生.它是由于T細胞受體(TCR)基因和IgH基因重排,使原來相隔數(shù)百個堿基的IgH和TCR基因的V區(qū)和J區(qū)靠近在一起.用PCR擴增該區(qū)域片段,通過長度分析就能判斷是否發(fā)生了基因重排.

第59頁/共149頁二.通過檢測癌基因和抑癌基因診斷腫瘤

癌基因的激活及抑癌基因的失活與腫瘤的發(fā)生密切相關.大多人類腫瘤組織或細胞中都能檢測到癌基因和(或)抑癌基因的突變1.癌基因-ras與腫瘤:ras是腫瘤中最常被激活的癌基因.激活的分子機制主要是點突變,高發(fā)區(qū)是第12、13和61位密碼子.如90%的胰腺癌,50%的結直腸癌和1/3的肺腺癌都在是K-ras基因第12位密碼子突變.ras癌基因點突變檢測方法:

a.PCR-ASO法:檢測速度快，靈敏度高，檢測樣品量大等優(yōu)點；但點突變的檢出僅限于寡核苷酸探針的探測位點和突變類型。

b.PCR-SSCP法：根據(jù)PCR擴增的目標DNA片段在非變性凝膠電泳中遷移率，將突變基因檢測出來。該法檢測點突變更方便；缺點：不能檢測出突變的具體位點和具體類型。第60頁/共149頁

2.P53基因與腫瘤：p53基因是最常被失活的抑癌基因，失活的分子機制主要是基因突變，也有因為基因表達異常而使p53失活，約50%以上的惡性腫瘤有p53基因突變。突變類型：130?290密碼子間常發(fā)生點突變，也有少量的插入或缺失突變。

基因檢測方法：①PCR-SSCP:可檢出有無突變

②

PCR-RFLP:通過內切酶位點的消失或增加

檢測p53的基因突變。第61頁/共149頁三.通過檢測腫瘤相關病毒診斷腫瘤

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種病毒與腫瘤的發(fā)生有關，它們有DNA病毒，也有RNA病毒,其中逆轉錄病毒(retro-virus)對動物細胞的致瘤作用已得到公認.還發(fā)現(xiàn)一些與人腫瘤發(fā)生有關的病毒如:

Burkitt

淋巴瘤人類乳頭瘤病毒(HPV)宮頸癌通過檢測這些病毒的基因就可以幫助診斷相應的腫瘤.EB病毒第62頁/共149頁四.通過檢測腫瘤標記物基因或mRNA診斷腫瘤腫瘤標志物（tumormarker)是由腫瘤組織細胞產(chǎn)生的，與腫瘤形成和發(fā)展相關的物質，包括：腫瘤抗原，激素，酶和同工酶。僅存在腫瘤細胞中。

類型：基因標志：是指基因本身突變和異常表達，能反映癌前啟動階段的變化?；虮硇蜆酥荆夯虍a(chǎn)物表達和調控異常，表現(xiàn)為所編碼的表達產(chǎn)物合成紊亂，產(chǎn)生胚胎性抗原，一般出現(xiàn)較晚。

基因診斷方法：①基因變異導致腫瘤標記物的產(chǎn)生或含量改變，可選擇：PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-測序，PCR-SSCP等技術。②導致腫瘤標記物產(chǎn)生或含量改變分子機制不清楚，可用RT-PCR技術檢測腫瘤標記物mRNA的存在或含量的改變。如：端?；钚悦富钚员挥脕碜鳛槟[瘤標記物，在腫瘤細胞中該酶的活性增高。第63頁/共149頁感染性疾病的基因診斷

每種病原體都有各自特異的遺傳物質,可以是DNA,也可以是RNA.每種病原生物都有各自種屬特異的基因.一.病毒感染性疾病的診斷

a.乙型肝炎病毒:

目前采用免疫法檢測血清中病毒抗原.HBV基因組包含4個開放閱讀框,S、C、P和X區(qū),C區(qū)變異性小,是基因診斷采用的目標部位.在用PCR檢測時可擴增HBV的特異核苷酸序列,通過PCR產(chǎn)物的直接電泳分析、或內切酶譜分析、或點雜交、或Southern印跡等結果作出判斷.也可采用基因芯片技術.第64頁/共149頁PCR檢測HIV病毒攜帶者第65頁/共149頁

b.傳染性非典型肺炎(SARS):

是由新型變異冠狀病毒(SARS-CoV)感染引起.SARS-CoV基因組為正鏈單股RNA,有11個開放閱讀框,基因組的特異保守序列為編碼RNA聚合酶的序列.基因診斷方法:

①

采用RT-PCR技術擴增保守序列

②

DNA芯片二.診斷細菌感染性的疾病用PCR技術通過對致病細菌所含質粒的特異序列,設計引物,檢測引起的疾病的細菌類型.

第66頁/共149頁基因診斷方法在法醫(yī)學上的應用微衛(wèi)星核心區(qū)重復序列的拷貝數(shù)的差異是微衛(wèi)星DNA多態(tài)性的主要成因，微衛(wèi)星的側翼序列多是相對保守的非重復序列，因此可以設計特異性引物，用PCR技術檢測微衛(wèi)星DNA的多態(tài)性。人工合成很短的重復序列作為探針，與酶切的人體DNA作southernblot，同一個體的不同組織來源的DNA譜帶完全一致，而不同個體之間（除非同卵雙生）譜帶都不相同，如同人的指紋具有高度個體特異性一樣，這種southern印跡圖被稱為DNA指紋。第67頁/共149頁

PCR-STR技術在法醫(yī)學中的應用第68頁/共149頁基因診斷用于親子鑒定69第69頁/共149頁DNA指紋分析用于個體鑒定

第70頁/共149頁基因診斷意義

現(xiàn)證病人的診斷：爭取有效、針對性治療。產(chǎn)前診斷：意義更為重要，預防遺傳病患兒的出生71第71頁/共149頁基因診斷存在的問題與發(fā)展前景一.基因診斷技術應用存在的問題

1.理論問題目前找到的致病基因不多,由多基因及基因與環(huán)境互作所引發(fā)多種疾病的分子機制還不清楚

2.技術問題設備條件;操做人員;污染造成的假陽性.3.倫理問題二.發(fā)展前景第72頁/共149頁結束語

基因診斷利用分子生物學技術,從DNA/RNA水平檢測基因的存在、分析基因的結構變異和表達狀態(tài),從而對疾病作出診斷.基因診斷的基本技術是核酸分子雜交和PCR擴增.前者是最直接、最準確的基因診斷技術,后者則是應用前景最為廣闊的診斷技術.目前,基因診斷技術已廣泛地應用到遺傳病、腫瘤和感染性疾病的診斷.隨著醫(yī)學和分子生物學技術的不斷發(fā)展,基因診斷技術將會更加廣泛.第73頁/共149頁基因治療

GeneTherapy第74頁/共149頁基因治療（Genetherapy

）

基因治療（Genetherapy

）

：指應用DNA重組技術，將外源正?；驅氚屑毎约m正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達到治療的目的。為達到這一目的，實施相應的策略。第75頁/共149頁基因治療三要素1.合適的目的基因：補充缺損基因；矯正異常基因；其他具有治療作用的基因。2.合適的基因轉移方法。3.必須在體內正常表達：基因表達調控機制。第76頁/共149頁基因治療流程1.確定病因（致病基因）2.治療基因的獲得：DNA重組3.將治療基因導入基因治療靶細胞靶細胞：體細胞、生殖細胞（符合易培養(yǎng)、易取出和移植、壽命長等條件）導入方法：物理法、化學法、融合法、病毒載體法4.將治療基因修飾的靶細胞回輸體內5.觀察治療效果第77頁/共149頁本章內容提示基因治療(genetherapy)概念基因治療策略治療靶細胞：體細胞、生殖細胞的基因治療基因轉移方法靶細胞特點、靶細胞種類反義寡核苷酸技術自殺基因與旁觀者效應第78頁/共149頁一、基因治療策略策略：直接基因治療和間接基因治療1、直接基因治療：糾正突變基因

在原位修復缺陷的基因，以達到治療目的。為較理想的基因治療策略，由于存在某些問題，目前正在努力之中。（未實現(xiàn)）第79頁/共149頁2、間接療法：以正常的基因替代致病基因。

導入外源正?；?，代替有缺陷的基因。而對靶細胞而言，沒有去除或修復有缺陷的基因。用DNA重組技術設法修復患者細胞中有缺陷的基因，使細胞恢復正常功能而達到治療遺傳病的目的。

第80頁/共149頁途徑:

就基因轉移的受體細胞不同，基因治療有兩種途徑：

1、生殖細胞基因治療

2、體細胞基因治療第81頁/共149頁

1、生殖細胞基因治療將正?；蜣D移到患者生殖細胞（精細胞，卵細胞，早期胚胎）使其發(fā)育成正常個體。為理想的治療方法，從根本上治療遺傳病，使其有害基因不能在人群中散播。

第82頁/共149頁但還存在某些問題：1）靶細胞的遺傳修飾至今尚無實質性進展；2）基因轉移效率不高，只能用顯微注射方法；3）只適用于排卵周期短而次數(shù)多的動物，很難適用于人類。（但目前輔助生殖技術的發(fā)展較為有效的解決了獲取卵細胞的辦法。一次可獲取少者3-5個，多者十幾個。）第83頁/共149頁2．體細胞基因治療

somaticcellgenetherapy

將正?；蜣D移到體細胞，使之表達基因產(chǎn)物，以達到治療的目的。但有害基因能遺傳給后代。第84頁/共149頁

措施：（1）正?；蜣D移至體外培養(yǎng)的體細胞，有效表達后，再回輸?shù)襟w內。（2）正常基因導入靶細胞，定位整合到染色體上，準確的替換異?；?，是理想的措施。（3）隨機整合，非特定座位，只要有效的表達即可達到治療的目的。（4）體細胞基因治療理論上不必矯正所有的體細胞。第85頁/共149頁存在的問題

對特定座位基因轉移，目前還存在較大困難；隨機插入可能引起后代的基因突變。第86頁/共149頁二、基因治療的方法基因治療的關鍵性步驟

目的基因的獲得與轉移

第87頁/共149頁基因治療首先獲得目的基因通常從基因組中分離

基因克隆↓定位↓表達↓評價表達情況一）目的基因的獲得—

正常基因的分離與克隆第88頁/共149頁二）外源基因的轉移通過不同方法，將目的基因轉移至受體細胞。第89頁/共149頁1）物理方法（1）電穿孔法（electroporotion）將細胞置于高壓脈沖電場中，通過電壓使細胞產(chǎn)生可逆性的穿孔。周圍基質中的DNA可滲進細胞，進而表達。

瞬間細胞細胞膜核膜通透性增加

高壓脈沖

DNA滲入細胞第90頁/共149頁（2）顯微注射法（microinjection）利用顯微操作把目的基因直接注入靶細胞或細胞核

第91頁/共149頁例：轉基因動物的制備

重組基因DNA

微注射（體外）

小鼠受精卵回植假妊娠

仔鼠

動物模型：轉基因鼠

(每個鼠細胞中都含有外源基因，按孟德爾方式遺傳)第92頁/共149頁第93頁/共149頁clonesheepDolly體細胞提取核重組細胞回植Dolly卵細胞去核細胞第94頁/共149頁（3）微粒子轟擊法

利用亞微粒的鎢和金能吸附DNA，并將其包裹起來形成微粒，通過物理途徑獲得高速度，微粒瞬間既可進入靶細胞，達到轉移目的基因的目的，而不損傷靶細胞。該方法可使目的基因在皮膚、肝、胰、胃及乳腺等細胞中表達。第95頁/共149頁2）化學法磷酸鈣沉淀法：目的基因與磷酸鈣等物質混合，形成沉淀的DNA微細顆粒，易通過細胞膜進入細胞內，并整合到受體細胞基因組中，在適當條件下得以表達。第96頁/共149頁磷酸鈣+DNA→混合微細顆?！?/p>

沉淀反應20~30min

↓

細胞在沉淀物中暴露5~24h

方法簡單，但轉化效率低。第97頁/共149頁3）脂質體法（liposome）應用人工制備的類似細胞膜的膜性結構——脂質體，包裝外源基因，再與靶細胞融合，外源DNA導入靶細胞，使其表達。

DNA細胞融合轉化細胞

PEG

仙苔病毒DNA脂膜第98頁/共149頁4）同源重組法

同源重組（homologusrecombination）:外源基因和染色體上的基因在同源序列間發(fā)生重組而插入染色體。

是將外源基因定位導入細胞的染色體上。

單交換

雙交換

第99頁/共149頁通過同源重組定點插入珠蛋白基因XbaIBstXIXbaIδβ△βneoXbaIBstXIδΔββneo正?；蜃粠в兄榈鞍谆虻馁|粒

C重組后，插入外源基因片段帶有——neo基因（新霉素抗性基因），重組后的細胞在含有neo的培養(yǎng)基中生長，沒有插入新基因的細胞死亡，將有重組的細胞篩選出來。第100頁/共149頁5）病毒介導基因內轉移（Viralmediatedtransfer）是通過病毒為載體（vector），將外源基因通過重組技術與病毒重組，然后去感染受體細胞感染細胞重組病毒第101頁/共149頁

逆轉錄病毒(RNA)

常用的病毒載體

DNA病毒

1)逆轉錄病毒（retrovirus）

目前應用最多、最成功.病毒感染細胞后，其基因組RNA經(jīng)逆轉錄產(chǎn)生雙鏈DNA拷貝，插入宿主染色體形成前病毒（provirus），前病毒轉錄產(chǎn)生的正鏈既是病毒RNA，再與前病毒編碼的外殼蛋白包裝成新的病毒顆粒。第102頁/共149頁第103頁/共149頁例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因組結構：

LTRLTRψgagpolenvU3RU5U3RU5

U3=增強子，R=啟動子，U5=轉錄起始位點。

Ψ=病毒包裝信號，gag=核心抗原，pol=逆轉錄酶，env=外殼蛋白。第104頁/共149頁逆轉錄病毒載體優(yōu)點：①高效感染宿主細胞，轉染率可達100%②病毒基因和所載的外源基因都可能表達③宿主范圍廣，可同時感染大量細胞并長期存留第105頁/共149頁缺點

①病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；②病毒隨機插入靶細胞基因組中，因病毒具有強大的啟動子和增強子，能使插入點附近的基因過度表達或失活，插入的外源基因可能不適當?shù)谋磉_；第106頁/共149頁③逆轉錄病毒有致癌作用，可能使受體細胞癌變。

根據(jù)逆轉錄病毒的缺點，人們有目的地將其改造，保留其優(yōu)點，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和ψ包裝信號。第107頁/共149頁6）受體載體轉移法將含有目的基因的重組質粒和某些細胞表面受體能識別的特異性多肽（配體）形成復合物，通過細胞內吞途徑達到轉移基因的目的。重組質粒配體細胞膜復合物第108頁/共149頁三）靶細胞的選擇靶細胞是指接受外源Gene的體細胞選擇靶細胞的原則是：1）必須較堅固，便于體外培養(yǎng)和進行遺傳技術操作；2）易于由人體分離又便于輸回體內3）具有增殖優(yōu)勢，生命周期長（能存活幾月至幾年，或整個生命周期）4）易于受外源遺傳物質轉化。第109頁/共149頁常見的靶細胞外周血T淋巴細胞上皮細胞內皮皮膚成纖維細胞造血干細胞——β地中海貧血、嚴重復合免疫缺陷病等基因治療肝C——家族性高膽固醇血癥、低密度脂蛋白病的基因治療肌細胞第110頁/共149頁三、Gene治療的現(xiàn)狀與前景體細胞Gene治療臨床實驗已經(jīng)開始，生殖細胞Gene治療正在完善。進行基因治療必須具備下列條件：第111頁/共149頁具備下列條件選擇適當?shù)募膊。宄膊〉陌l(fā)病機理，Gene的結構和功能。被糾正的基因已克隆，并清楚Gene表達與調控機制與條件。選擇適當?shù)氖荏w細胞并在體外有效表達。安全有效的基因轉移方法，以及供利用的動物模型。第112頁/共149頁腫瘤基因治療臨床實踐

第113頁/共149頁

腫瘤基因治療是應用基因轉移的技術將外源基因導入宿主細胞，直接修復或糾正腫瘤相關基因的結構與功能缺陷，或者通過增強宿主的免疫防御功能殺傷腫瘤細胞，因此，腫瘤的基因治療也是生物治療的重要組成部分。第114頁/共149頁目前腫瘤基因治療仍處于早期階段，盡管其在體外或動物實驗上有許多理想結果，但在臨床實踐中的應用還面臨許多困難，具體問題體現(xiàn)在：如何選擇更有效的目的基因？如何確保載體的安全性？如何將帶有治療作用的載體高效率的轉移到人體內？如何保持這些重組載體在人體內長期和穩(wěn)定的高效表達出預定的基因產(chǎn)物？如何有效地將基因治療與其他治療方法的聯(lián)合應用？如何更有效的減輕人體對重組載體的免疫作用？這些都是當前基因治療實踐中所遇到的重大困難，并成為目前腫瘤基因治療研究的熱點。第115頁/共149頁

目的基因成功轉移入靶細胞是基因治療最重要的環(huán)節(jié)。目前臨床上腫瘤基因治療方式可分為間接體內（回體法）(exvivo)和直接體內（invivo）兩種。所謂間接體內法就是將靶細胞由患者體內取出，于體外完成基因轉移后再回輸患者體內，此種方法的優(yōu)點為靶細胞明確、轉染效率高；而直接體內法是將目的基因插入載體，經(jīng)修飾后直接注入腫瘤部位或通過血液循環(huán)注入體內，在體內完成向靶細胞的基因轉移，具有一定盲目性,轉染效率低，但較前者簡便、費用低，已被越來越多的臨床研究所選用。第116頁/共149頁

腫瘤基因治療基因轉移方法較多，可分為物理、化學和生物三大類。前兩種是非病毒方法，包括裸露DNA直接注射、多價陽離子-DNA復合物轉化，電轉化，脂質體共轉化和受體介導的轉化等。第三種方法為病毒方法，指通過攜帶有目的基因的病毒感染靶細胞并表達出目的基因的方法。一、基因轉移的方式及所采用的載體第117頁/共149頁二、腫瘤基因治療的靶向性和目的基因調控的研究腫瘤基因治療中目的基因有選擇的進入腫瘤細胞等靶細胞（靶向性基因治療），是治療成功的關鍵。近年來，人們對這些方面進行了廣泛研究，并提出了許多方案。如通過改進給藥途徑和方式，或通過修飾載體和基因，均可望提高腫瘤基因治療的定向性和可控性。第118頁/共149頁1、給藥途徑：

腫瘤基因治療給藥途徑中，最多見的是向腫瘤組織直接注射，或者在超聲或CT導向下定位注射。這種方法簡單易行，常用于體表的晚期腫瘤。但由于使用時很難達到瘤內均勻分布，雖然有所謂旁觀者效應的存在，仍可能使療效受一定影響。對于盆腹腔腫瘤可以采取腹腔注射的方法。而肺癌基因治療則可采取氣管內給藥的方式。第119頁/共149頁2、載體構建

構建出能特異結合進入靶細胞的載體是實現(xiàn)腫瘤基因治療定向性的主要工作，具體研究成果有：（1）利用某些病毒能選擇性感染人體特異組織的性能，選擇和構建特異性載體。如EB病毒和B淋巴細胞和鼻咽上皮細胞等。Kenney等以EB病毒為基礎，構建出表達胞苷脫氨酶基因的載體，結果顯示有無復制能力的載體均可感染EB病毒受體CD21陽性的細胞。（2）利用腫瘤細胞表達的一些相對特異的受體來構建載體。如研究發(fā)現(xiàn)VEGF在黑色素瘤、大腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達升高，Li等據(jù)此設計了含VEGF受體結合區(qū)的多肽，并將之與目的基因相連，可以介導目的基因在表達VEGF受體的細胞特異性轉導。

第120頁/共149頁3、目的基因的調控對目的基因的修飾，主要是為了能在局部選擇性的攻擊腫瘤細胞，即通過構建含有細胞特異性啟動子序列的重組載體來調控目的基因定向表達于腫瘤細胞。如AFP啟動子對肝腫瘤細胞的選擇性等。第121頁/共149頁三、腫瘤基因治療的常用方法1、抑癌基因的導入：

目前對抑癌基因研究較多的是p53基因。1990年Baker等首先觀察到p53導入腫瘤細胞后，腫瘤細胞出現(xiàn)了明顯的凋亡。Roth于1993年應用載有野生型p53的重組逆轉錄或腺病毒載體進行人體肺癌的實驗治療，出現(xiàn)了8%的部分緩解率，64%病情穩(wěn)定的效果。美國已從1995年起進行了重組腺病毒p53制品的臨床試驗。

第122頁/共149頁2、癌基因的反義核酸導入治療針對癌細胞癌基因異常活化而設計的反義核酸技術可有效調節(jié)腫瘤細胞中基因表達。具體應用方法有二：一是利用質粒載體或病毒載體轉化或轉染腫瘤細胞，在細胞內轉錄出能與目的基因正義RNA相互補的反義RNA，從而阻斷目的基因蛋白質的表達；二是體外人工合成反義寡核苷酸。由于第二種方法相對簡單，故多數(shù)反義核酸基因治療研究均采用了這種技術。反義核酸基因治療在靶基因選擇上，可以分為癌基因、抑癌基因、生長因子及其受體細胞信號傳導系統(tǒng)、細胞周期調控物質、酶類及其它。反義核酸基因治療不但在體外實驗和動物模型上取得了顯著效果，臨床試驗亦顯示出良好效果。第123頁/共149頁3、免疫基因療法：

由于在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中存在著機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的免疫耐受狀態(tài)，而這種狀態(tài)可能源于腫瘤細胞本身的免疫性不強（如MHC表達不足），也可源于抗原遞呈細胞（APC）不能提供足夠的共刺激信號（如B7），或者機體免疫因子分泌不足等。因此可以通過以下三種方法糾正機體腫瘤免疫的耐受狀態(tài)。第124頁/共149頁

(1)將某些細胞因子（如IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、INF-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF等）的基因轉染到機體免疫細胞（如TIL、LAK細胞及細胞毒淋巴細胞）中，以提高機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的識別和反應能力，這實質上是免疫治療加上基因轉染技術。這些細胞因子的基因治療在一定程度上克服了細胞因子注射療法需反復多次應用、副作用嚴重等缺點，療效也有提高。腫瘤免疫細胞因子基因治療因其簡單、有效、安全，已成為腫瘤免疫基因治療研究的最常用方法。第125頁/共149頁（2）由于腫瘤細胞存在功能性MHCI類抗原和（或）共刺激信號表達不足，可以將一些與免疫識別有關的基因（如HLA、B7等）轉染到體外培養(yǎng)的腫瘤細胞，經(jīng)照射后再植入腫瘤患者體內；或者將表達HLA-B7的病毒載體或質粒DNA與脂質體復合物直接注射到瘤體內，以增強腫瘤細胞對機體免疫系統(tǒng)的免疫原性，誘導宿主的免疫反應。（3）制備腫瘤DNA瘤苗，即將編碼特異抗原的基因直接注入人體，通過其在機體內的表達從而可以激發(fā)機體對編碼抗原的免疫反應。如應用癌胚抗原（CEA）制備的腫瘤DNA瘤苗在實驗中顯示出一定的效果。第126頁/共149頁4、自殺基因療法將某些細菌及病毒中特有的藥物敏感基因轉導入腫瘤細胞，使腫瘤細胞產(chǎn)生某些酶類，將原來無毒的抗病毒藥物或化療前體藥物代謝轉化成細胞毒性產(chǎn)物而殺傷宿主細胞，這種使腫瘤細胞自殺的基因稱為自殺基因。目前腫瘤基因治療中廣泛應用并舉有較好臨床前景的自殺基因主要有：單純皰疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）和細菌胞嘧啶脫氨酶基因（CD）。

第127頁/共149頁胞嘧啶脫氨酶（cytosinedeaminase）可將無害的5－氟胞嘧啶轉變?yōu)榧毎舅?－氟胞嘧啶。此病毒可感染正常細胞和癌細胞，但將該酶基因連接到一種“分子開關”后，則只能在腫瘤細胞中表達。Sikora等設計一個“嵌合小基因（chimericminigene）”，即將酶基因連接到erbB2基因啟動子的下游，此啟動子活性增強，使erbB2在乳腺癌細胞中過度表達。此時，藥物5－FC注入細胞后即轉變?yōu)?－FU而致癌細胞死亡。而當5－FC給予含有此嵌合基因卻無erbB2表達的細胞時，亦無藥物前體活性。這一基因治療的新策略，可有可能使人對腫瘤等不同疾病進行基因治療。第128頁/共149頁自殺基因療法可以實現(xiàn)選擇性原位轉導和特異性殺傷，避免了應用exvivo技術基因療法中步驟繁多、技術要求高、難度大的靶細胞獲取及培養(yǎng)、目的基因轉導、篩選及回輸?shù)冗^程，從而使其成為較早進入臨床的基因治療方法之一。第129頁/共149頁5、抗腫瘤血管形成基因治療：

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，腫瘤血管形成起重要作用，因此，抗血管形成治療成為腫瘤治療極有潛力的方法。血管生成抑制劑Angiostatin和Endostatin在腫瘤動物模型中已有明確療效，但長期連續(xù)給予蛋白質藥物價格昂貴，抗血管生成基因治療則在較大程度上解決了這一問題。近年來抗血管生成基因治療研究主要包括：（1）針對血管形成生長因子及其受體的基因治療；（2）血管形成抑制因子基因治療；（3）針對腫瘤血管內皮細胞的自殺基因治療等。這些方法雖然尚未進入臨床，但可以相信其會有較廣泛的臨床應用前景。第130頁/共149頁6、耐藥基因基因治療多藥耐受基因（MDR）是研究較廣泛的一組耐藥基因，可將細胞內的藥物包括化療藥物泵出細胞外，細胞可因此對化療藥物產(chǎn)生耐受。利用MDR的這種作用可設計出兩種基因治療的方法：一種是應用反義RNA技術，以抑制異?；罨腗DR基因，從而達到逆轉腫瘤細胞化療耐藥的作用；另一種是將MDR基因導入造血干細胞，獲表達后可使骨髓細胞產(chǎn)生對化療藥物的抗性，抵御化療藥物的損害，從而達到增加化療藥物劑量，進而提高化療療效的目的。第131頁/共149頁

10余年來所進行的腫瘤基因臨床試驗已表明，基因治療不僅作為一個新的生物醫(yī)學概念而為人們所接受，而且作為一種新的治療手段和方法已被廣大研究人員和臨床工作者所實踐。到目前為止所進行的不少研究表明，基因治療實驗是安全的、有效和易于操作的。

第132頁/共149頁四、腫瘤基因治療存在的問題和發(fā)展方向

隨著人類基因組計劃的完成，腫瘤相關基因的揭示，腫瘤發(fā)病分子機理的深入闡明，DNA轉移技術的革新，以及對于在體內重組載體表達的調控技術的提高，腫瘤的基因治療必將在腫瘤的治療中起重要作用，基因治療在現(xiàn)代臨床醫(yī)學中具有廣闊的前景。

第133頁/共149頁1.進行基因治療需解決的關鍵問題有哪些？2.基因治療技術路線3.外源基因導入宿主細胞有哪些方法？4.腫瘤的基因治療目前有哪些具體策略？第134頁/共149頁基因治療實例1、復合免疫缺陷綜合征的基因治療（人類Gene治療成功例子）ADA缺乏癥-——致死性疾病，患者由于腺苷酸脫氨酶（ADA）缺乏。第135頁/共149頁ADA-Gene+vector（逆轉錄病毒）

重組分子患者TLyCIL-2刺激C分裂導入細胞生長分裂

10天

Gene表達

回輸患兒體內

1~2月治療一次,10個月患兒體內ADA水平達正常人的25%

第136頁/共149頁2、乙型血友病XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3~q27.2。臨床表現(xiàn)，易出血，凝血時間長，輕傷、小手術后常出血不止。發(fā)病率為1/30000。例如：我國學者薛京倫實施的FⅨ的基因治療。第137頁/共149頁逆轉錄病毒載體

+FⅨcDNA

重組體

5`LTRFⅨneoSVPSOLTR3`①導入倉鼠細胞（CHO）→FⅨ表達；②導入乙型血友病患者皮膚成纖維細胞（體外培養(yǎng)）→FⅨ表達；③91年，導入乙型血友病患者皮膚成纖維細胞（體外培養(yǎng)）→回植病人皮下→FⅨ基因表達，F(xiàn)Ⅸ基表達水平達正常人的5