如何正確設(shè)計(jì)從生物樣品中分離純化生物大分子

如何正確設(shè)計(jì)從生物樣品中分離純化生物大分子第1頁/共25頁如何正確設(shè)計(jì)從生物樣品中分離純化生物大分子第2頁/共25頁背景介紹：生物大分子

生物大分子指的是作為生物體內(nèi)主要活性成分的各種分子量達(dá)到上萬或更多的有機(jī)分子。常見的生物大分子包括蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類。實(shí)際上生物大分子的特點(diǎn)在于其表現(xiàn)出的各種生物活性和在生物新陳代謝中的作用。

生物大分子大多數(shù)是由簡單的組成結(jié)構(gòu)聚合而成的，例如蛋白質(zhì)的組成單位是氨基酸，核酸的組成單位是核苷酸等。第3頁/共25頁蛋白質(zhì)、核酸和多糖是3類主要的生物大分子，它們在分子結(jié)構(gòu)和生理功能上差別很大，然而，在以下幾個(gè)方面又顯出共性：在活細(xì)胞內(nèi)，生物大分子和相應(yīng)的生物小分子之間的互變，通常通過脫水縮合，或加水分解。蛋白質(zhì)鏈（或稱肽鏈）、核酸鏈和糖鏈都有方向性，盡管方向性的體現(xiàn)各不相同。蛋白質(zhì)、核酸和多糖分子都有各具特征的高級結(jié)構(gòu)，正確的高級結(jié)構(gòu)是生物大分子執(zhí)行其生物功能的必要前提。在活細(xì)胞中，生物大分子互相密切配合，共同參與生命過程，甚至很多情況下形成生命活動必不可少的復(fù)合大分子，如核蛋白、糖蛋白。第4頁/共25頁通用的技術(shù)路線設(shè)計(jì)方案1.確定要分離提純的生物大分子的目的和要求不論是學(xué)生學(xué)習(xí)簡單的分離提純方法，還是科研人員進(jìn)行研究、開發(fā)或者探索新物質(zhì)，一個(gè)明確的目的和要求都是必不可少的。本課題要求對生物大分子進(jìn)行分離提純，也即在了解生物大分子（即蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類）的前提下，進(jìn)行盡可能完善的提純，同時(shí)也應(yīng)注意滿足現(xiàn)實(shí)設(shè)備情況。第5頁/共25頁2.建立相應(yīng)可靠的分析測定方法分離提純最為重要的就是最終的“純度”，所以一套完善可靠地分析測定方法就是進(jìn)行工作的前提條件。沒有這雙“眼睛”，將無法得到最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.查閱文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)備性實(shí)驗(yàn)要進(jìn)行分離提純就必須掌握四種生物大分子的一般理化性質(zhì)以及需要提純的產(chǎn)物的一些特殊理化性質(zhì)，只有這樣才能進(jìn)行分離提純的工作。第6頁/共25頁4.生物材料的破碎和處理需要分離的生物大分子往往貯存在生物體內(nèi)，而根據(jù)生物種類的不同，如微生物、動物、植物等，有不同的生物材料處理方式，而處理方式的得當(dāng)與否，往往也決定著最終的提取率的高低甚至實(shí)驗(yàn)的可行性。5.分離純化方案的選擇和探索同樣的一類物質(zhì)往往有很多種方案可以進(jìn)行分離提純，但如何根據(jù)所需生物大分子的種類、它所處的生物環(huán)境、客觀因素等種種條件來選擇最好的一種分離純化方式，是整個(gè)實(shí)驗(yàn)最為困難的步驟。而在一些尖端領(lǐng)域，甚至需要研究人員自行探索新的方案，這無疑又大大加大了這一步的難度。所以可以說，這一步是整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中最為困難的一步，也應(yīng)是投入精力最多、選擇最仔細(xì)的一步。第7頁/共25頁6.生物大分子純度的檢測根據(jù)提純的生物大分子種類不同，選用相應(yīng)的檢測方式進(jìn)行檢測。

7.產(chǎn)物的濃縮、干燥與保存第8頁/共25頁常用的檢測方法

物理、化學(xué)方法：

比色法、氣相/液相色譜法、光譜法（紫外／可見、紅外和熒光等分光光度法）、電泳法、以及核磁共振等。但應(yīng)注意，如果實(shí)驗(yàn)對精確性要求較高則必須同時(shí)采用2-3種不同的純度鑒定法才能確定。生物學(xué)的測定法：

酶活測定、蛋白質(zhì)含量測定、免疫化學(xué)方法、放射性同位素示蹤法等；第9頁/共25頁實(shí)驗(yàn)需要了解的理化性質(zhì)

在水和各種有機(jī)溶劑中的溶解性。在不同溫度、pH值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性。固態(tài)時(shí)和凍干時(shí)的穩(wěn)定性。

物理性質(zhì)：分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數(shù)等。

化學(xué)性質(zhì)：對各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性。對其他生物分子的特殊親和力等。第10頁/共25頁各種生物大分子進(jìn)行分離提純的技術(shù)路線要點(diǎn)1.核酸的分離純化

分離純化原則：

保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性

意義：遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸的—級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。具體原則：溫度不要過高；控制pH值范圍(pH值5-9);保持一定離子強(qiáng)度;減少物理因素對核酸的機(jī)械剪切力。

防止核酸生物降解

DNA酶抑制劑：金屬離子螯合劑；陰離子型表面活性劑

RNA酶抑制劑：皂土；DEPC(二乙基焦碳酸鹽)；肝素；復(fù)合硅酸鹽；RNase阻抑蛋白；氧釩核糖核苷復(fù)合物

②分離純化的步驟：

取材：核酸在細(xì)胞內(nèi)部，所以需要破碎細(xì)胞才能取得核酸，常用方法如下：高速組織搗碎機(jī)搗碎；玻璃勻漿器勻漿；超聲波處理法；液氮研磨法；化學(xué)處理法(SDS、LDS，吐溫80等）；生化法（溶菌酶、纖維素酶等）第11頁/共25頁

除雜：

肝糖元、淀粉及粘多糖：取材前盡量減少組織中多糖的含量，如先使動物饑餓數(shù)天然后殺死；加入淀粉酶；在濃磷酸鹽存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液；以鈣鹽沉淀DNA，再以草酸鉀處理，使之形成DNA鉀鹽回收，然后用離子交換法吸附DNA。

蛋白質(zhì)的除去：加入去污劑如SDS；氯仿-戊醇或辛醇對提取液搖蕩抽提；苯酚水溶液抽提；加入濃鹽溶液如NaCl。

不同類型核酸的分離：（1）從DNA中除去RNA：核糖核酸酸酶選擇地破壞RNA；鈣鹽分步沉淀；活性炭吸附。（2）從RNA中除去DNA：苯酚水溶液抽提；加入脫氧核糖核酸酶處理。

同類核酸的分離：（1）RNA混合物的分離：多應(yīng)用柱層析、梯度離心及逆流分溶等方法。（2）DNA混合物的分離：常用磷酸鈣、ECTEOLA-纖維素、DEAE-纖維素和甲基化白蛋白柱層析，逆流分溶，梯度離心等方法。第12頁/共25頁

濃縮：常用沉淀的方法。其好處是：改變核酸的溶解緩沖液；重新調(diào)整核酸的濃度；去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。常用方法如下：

鹽溶液沉淀：如MgCl2；NaAc；KAc等。

有機(jī)溶劑沉淀：如乙醇；異丙醇；聚乙二醇（PEG）；精胺等。低溫長時(shí)間沉淀，易導(dǎo)致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實(shí)驗(yàn)。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA樣品足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

測定：一般選用紫外分光光度法或溴乙錠熒光法測定核酸的含量。

保存：對DNA和RNA有不同的保存方式：

對DNA：DNA樣品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；長期保存樣品中可加入1滴氯仿。對RNA：RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存；長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中；在RNA溶液中，加1滴0.2mol/L氧釩核糖核苷復(fù)合物凍貯于-70℃,可保存數(shù)年。第13頁/共25頁2.脂質(zhì)的分離純化：

注意：組織破碎的方法會影響提取的脂質(zhì)的濃度，因此分析的時(shí)候必須將各種破碎方法進(jìn)行比較。

操作方法：按照Folchmethod法進(jìn)行操作：

先配制氯仿/甲醇=2/1（v/v），取組織按1：20的量和氯仿/甲醇一起組織均漿，分層后在室溫下在搖床中搖動15-20分鐘。均漿通過濾紙過濾或者離心獲得液體。在離心獲得的液體中加入0.2倍體積的水或者0.9%的生理鹽水，渦旋幾秒鐘混均，然后2000rpm離心得到兩相溶液，如果需要的話用甲醇/水（1/1）的將兩相界面洗一到兩次，洗的過程不要讓甲醇/水與下層混合。通過離心和虹吸去掉上層后，下層氯仿相含有脂質(zhì)，如果體積在2-3ml以下則通過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或在氮?dú)庀聺饪s。二氯甲烷可以替代氯仿，結(jié)果表明二氯甲烷/甲醇能夠取代氯仿/甲醇，因此能夠避免氯仿帶來的健康、安全和管理問題。第14頁/共25頁3.糖類的分離純化

單、雙糖：常見的單、雙糖一般采用合成的方式。制備如下：脫脂→去雜→濃縮→再次去雜→脫色→濃縮→冷卻→結(jié)晶（→進(jìn)一步純化）。

多糖的分離純化：

脫脂：由于多糖被脂質(zhì)包圍，通常用醇或醚回流脫脂。

提?。?/p>

熱水浸提法微波輔助提取法超聲輔助法索氏提取法醇提法其它方法（如稀堿液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等）第15頁/共25頁

除雜：

除蛋白質(zhì)：沙維積法（Sevag法）；三氟三氯乙烷法；三氯醋酸法；酶解法；鹽酸法；其它方法（如加入5%ZnSO4溶液和飽和Ba（OH）2溶液，振蕩后離心去蛋白，但此方法不夠徹底）。

除色素：活性炭除色素；弱堿性樹脂DEAE纖維素或DuoliteA－7來吸附色素（針對植物色素）；氧化脫色（糖和色素時(shí)結(jié)合，易被DEAE纖維素吸附，不能被水洗脫的）；依次用丙酮、無水乙醚和無水乙醇洗滌多糖；用4:1的氯仿-正丁醇除色素

除低聚糖等小分子雜質(zhì)：逆向流水透析法。

純化：分部沉淀法鹽析法季銨鹽沉淀法柱層析制備性區(qū)域電泳膜分離法金屬絡(luò)合物法其它方法（如超過濾法、活性炭柱色譜、LKB柱色譜系統(tǒng)等）第16頁/共25頁c.黏多糖（酸性黏多糖）的分離純化：

定義：粘多糖是一類廣泛存在于動物體內(nèi)的含糖醛酸和氨基糖殘基的復(fù)合多糖

提?。吼ざ嗵谴蠖嗯c蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，首先常用酶降解部分蛋白或用堿使多糖-蛋白質(zhì)間的鍵斷裂，促進(jìn)提取時(shí)的溶解。然后用普通蛋白沉淀法沉淀蛋白。

分離：采用有機(jī)溶劑分離法、季銨化合物沉淀法或離子交換層析法即可。

多糖的分析鑒定：

含量的測定：測定方法：硫酸－苯酚法、硫酸－蒽酮法、比色定量法、分光光度法、紙色譜法、離子交換色譜法、yaphe法、薄層色譜法、酶法、原子吸收法、HPLC法、凝膠電泳法、親和電泳法、連續(xù)流動分析法檢測法、次亞碘酸鹽定量法、蒽酮－硫酸法（總糖）、DNS法（還原法）、磷鉬比色法、鄰鉀苯胺比色法等.每種方法只對某些多糖的測量效果好.比色法、分光光度法、離子交換色譜法、酶法和電泳法等可同時(shí)用于多糖的定性定量分析。第17頁/共25頁

純度鑒定：多糖是高分子化合物，其純品微觀上是不均一的，通常所說的多糖純品實(shí)質(zhì)上是一定分子量范圍的均一組分.多糖純度鑒定的常用方法：超離心、高壓電泳、凝膠層析、HLPC法等.現(xiàn)在應(yīng)用較多的是HLPC法，旋光度測定也是純度測定的一種方法。

分子量的測定：多糖分子量的測定是研究多糖性質(zhì)的一項(xiàng)重要工作.常用方法：滲透壓法、蒸氣壓滲透劑法、端基法、粘度法、光散射法、凝膠色譜法、超過率法、沉淀法、凝膠電泳法、HPLC法、超離心分析法、分子篩色譜法、GPC法、MALDI－TOF－MS法.

結(jié)構(gòu)測定：

多糖一級結(jié)構(gòu)測定：多糖的一級結(jié)構(gòu)分析，主要是分析組成多糖的單糖類型、數(shù)目、連接方式及苷建構(gòu)型.常用化學(xué)法和儀器分析法。多糖高級結(jié)構(gòu)測定：目前研究多糖的二級結(jié)構(gòu)常用的手段是NMR技術(shù)。近年來，以精確三維結(jié)構(gòu)知識為基礎(chǔ)揭示重要生命活動的規(guī)律已達(dá)到前所未有的深度和廣度。第18頁/共25頁4.蛋白質(zhì)的分離純化（1）基本原理：一是利用混合物中幾個(gè)組分分配系數(shù)的差異，把它們分配到兩個(gè)或幾個(gè)相中，如鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于某一物相（大多數(shù)是液相）中，通過物理力場的作用，使各組分分配于不同的區(qū)域，從而達(dá)到分離的目的，如電泳、離心、超濾等。關(guān)鍵技術(shù)是電泳、層析和高速與超速離心。純化蛋白質(zhì)大分子涉及純度和產(chǎn)率實(shí)際中兩者不能兼得，視目的而取舍。第19頁/共25頁（2）前處理：

定義：把蛋白質(zhì)從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。選擇適當(dāng)?shù)姆椒ǎ扑榻M織和細(xì)胞：

動物組織和細(xì)胞：用電動搗碎機(jī)或勻漿器破碎或用超聲波處理法破碎；

植物組織和細(xì)胞：使用石英砂和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理。

細(xì)菌細(xì)胞：常用方法有超聲波振蕩，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。如果蛋白質(zhì)主要集中在某一亞細(xì)胞，例如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶性的細(xì)胞漿等。用差速離心方法分離，收集亞細(xì)胞組分材料。如果蛋白質(zhì)是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合，必須用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚。第20頁/共25頁（3）粗分級：

定義：選用一套適當(dāng)方法，把蛋白質(zhì)混合物提取液中，所要的蛋白質(zhì)與其他雜蛋白質(zhì)分離開來。

方法：鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級分離等方法。（4）細(xì)分級：

定義：樣品的進(jìn)一步提純。

方法：

層析法：凝膠過濾，離子交換層析，吸附層析以及親和層析等。

電泳法：包括區(qū)帶電泳、等電聚焦等（5）進(jìn)一步分離純化

沉淀法