植物組織培養(yǎng)與器官培養(yǎng)

植物離體無性繁殖簡稱離體繁殖（invitropropagation)、微型繁殖（micropropagation)，是指利用離體培養(yǎng)技術(shù)將來自優(yōu)良植株的莖尖、腋芽、葉片、鱗片等器官、組織和細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，并在短期內(nèi)獲得大量遺傳性一致的植株的方法（技術(shù)）。用這種方法得到的植株群體稱單株無性系。(來自一個(gè)單株（或一個(gè)單芽），它們遺傳組成相同)近400種植物離體繁殖已獲成功。蘭花、無子西瓜、馬鈴薯、楊樹等已在種苗生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。當(dāng)前1頁，總共67頁。2023/3/141植物離體無性繁殖的意義（優(yōu)越性）繁殖速度快，經(jīng)濟(jì)效益高占用空間小，不受地區(qū)季節(jié)限制，便于工廠化育苗可以繁殖各種珍稀、涉危苗木離體繁殖周期：1～3個(gè)月繁殖系數(shù)：幾十～幾百倍又稱快繁離體繁殖是建立在體細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，是在人工控制的環(huán)境條件下，不會造成性狀分離，也不會退化，同時(shí)還可避免病蟲害的侵染。利于篩選突變體，為育種服務(wù)當(dāng)前2頁，總共67頁。2023/3/142手指玫瑰由根組織培養(yǎng)的蒲公英幼苗當(dāng)前3頁，總共67頁。2023/3/143植物離體無性繁殖的方式器官發(fā)生型(organogenesistype)胚狀體發(fā)生型(embryogenesistype)不定芽型（adventitiousbudtype)器官型(organtype)原球莖型(protocormtype)球莖芽型塊莖型鱗莖型孢子型根莖型

微枝扦插型

當(dāng)前4頁，總共67頁。2023/3/144器官發(fā)生型(organogenesistype)：誘導(dǎo)器官外植體產(chǎn)生愈傷組織，經(jīng)分化培養(yǎng)形成芽、根再生成植株的方式。技術(shù)關(guān)鍵：外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織要早期挑選，使其來源盡量一致。特點(diǎn)：繁殖速度快；培養(yǎng)經(jīng)愈傷組織階段再生成植株，遺傳性不穩(wěn)定，易產(chǎn)生變異。蘆薈、煙草、油菜等當(dāng)前5頁，總共67頁。2023/3/145無菌母株制備增殖、分化植株再生及鑒定煉苗和移植器官發(fā)生型基本程序培養(yǎng)基中激素配比激素種類及濃度基本培養(yǎng)基組成滲透壓逐步過渡培養(yǎng)基篩選材料滅菌當(dāng)前6頁，總共67頁。2023/3/146胚狀體發(fā)生型(embryogenesistype)：指植物器官、組織和細(xì)胞外植體經(jīng)培養(yǎng)脫分化形成胚狀體再成苗的方式。技術(shù)關(guān)鍵：提高不同外植體胚狀體發(fā)生及萌發(fā)率和提高胚狀體同步化率。特點(diǎn)：胚狀體發(fā)生數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整，繁殖系數(shù)高；遺傳性穩(wěn)定。甘蔗、胡蘿卜、石刁柏等當(dāng)前7頁，總共67頁。2023/3/147不定芽型（adventitiousbudtype)：選取具有頂芽和腋芽的短枝無菌培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽萌發(fā)成苗或增殖產(chǎn)生許多不定芽發(fā)育成苗，將新萌生的枝條再轉(zhuǎn)接繼代，重復(fù)芽到苗的增殖過程，最后使其生根形成植株的方式。技術(shù)關(guān)鍵：打破頂端優(yōu)勢，促使腋芽增殖并促其生根。特點(diǎn)：繁殖率高、保持物種的遺傳穩(wěn)定性，多用于林木的繁殖。FLash當(dāng)前8頁，總共67頁。2023/3/148器官型(organtype)指直接從莖、葉、鱗片等外植體上誘導(dǎo)不定芽或帶芽的休眠器官（如小鱗莖、小球莖、小塊莖）產(chǎn)生再生成植株的方式。技術(shù)關(guān)鍵：對培養(yǎng)基要求高，控制好激素濃度，避免愈傷組織發(fā)生。優(yōu)點(diǎn)：繁殖率高，速度較快；遺傳性穩(wěn)定。三倍體無籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、絲石竹等當(dāng)前9頁，總共67頁。2023/3/149原球莖型(protocormtype)蘭屬特有的方式，即外植體經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生原球莖，再直接長成植株。當(dāng)前10頁，總共67頁。2023/3/1410球莖芽型葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植觀葉海棠球莖芽型葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植觀葉海棠球莖芽型葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植觀葉海棠球莖芽型葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植觀葉海棠球莖芽型葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植觀葉海棠球莖芽型葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植觀葉海棠球莖芽型葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植觀葉海棠球莖芽型

葉柄表面產(chǎn)生圓球形小突起——球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植唐菖蒲觀葉海棠當(dāng)前11頁，總共67頁。2023/3/1411塊莖型葉片或葉柄上形成粒狀芋塊，進(jìn)一步分化出芽和根塊莖芽可為繁殖系母體，不斷切割繁殖移栽，成活率高?；ㄈ~芋

當(dāng)前12頁，總共67頁。2023/3/1412鱗莖型鱗片近軸面或邊緣直接形成帶根的小鱗莖在試管內(nèi)形成小鱗莖需較長時(shí)間百合 郁金香當(dāng)前13頁，總共67頁。2023/3/1413孢子型

用成熟或未成熟的孢子進(jìn)行培養(yǎng)孢子繁殖最困難的是表面消毒，萌發(fā)時(shí)間較長地錢狼尾蕨當(dāng)前14頁，總共67頁。2023/3/1414根莖型

蕨類具有橫向的莖及直立的短根莖，為組織培養(yǎng)的最佳外植體根狀莖上產(chǎn)生蕨葉及根，繁殖速度較孢子型快腎蕨等當(dāng)前15頁，總共67頁。2023/3/1415微枝扦插型

帶芽的小插條在試管內(nèi)進(jìn)行無菌扦插為木本植物進(jìn)行快速繁殖的主要方式葡萄、楊樹當(dāng)前16頁，總共67頁。2023/3/14163.1.3培養(yǎng)基3.1.3.1無機(jī)鹽無機(jī)鹽培養(yǎng)基的組成大量元素(使用濃度大于0.5mmol/L)微量元素(使用濃度小于0.5mmol/L)當(dāng)前17頁，總共67頁。2023/3/14173.1.3.1無機(jī)鹽當(dāng)前18頁，總共67頁。2023/3/1418有機(jī)物氨基酸類重要的有機(jī)氮源維生素類以輔酶形式參與植物細(xì)胞代謝活動(dòng)，對生長、分化具有很好的促進(jìn)作用vb1，vb6糖類主要的碳源—蔗糖？天然有機(jī)添加物類CM（椰乳）、馬鈴薯汁、酵母提取液（YE）、番茄汁等當(dāng)前19頁，總共67頁。2023/3/1419蔗糖濃度分別為0、1%、5%當(dāng)前20頁，總共67頁。2023/3/14203.1.3.3調(diào)節(jié)物質(zhì)（一）生長素類促進(jìn)細(xì)胞伸長生長和分裂、誘導(dǎo)愈傷組織形成、促進(jìn)生根，與一定量的細(xì)胞分裂素配合可誘導(dǎo)不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長、胚狀體的產(chǎn)生等。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAAIAA為天然植物生長素，見光易分解，高溫高壓易受破壞；2,4-D有抑制芽形成的作用，一般用于細(xì)胞啟動(dòng)脫分化階段；誘導(dǎo)分化則用NAA、NBA或IAA。IBA誘導(dǎo)生根效果最好。當(dāng)前21頁，總共67頁。2023/3/1421（二）細(xì)胞分裂素類

促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化不定芽、解除頂端優(yōu)勢而促進(jìn)側(cè)芽增殖、抑制離體組織或器官衰老。 常用的有6-BA、KT、ZT6-BA當(dāng)前22頁，總共67頁。2023/3/1422BA分別為0,0.1,5mg/LNAA分別為0,0.1,5mg/L當(dāng)前23頁，總共67頁。2023/3/1423（三）赤霉素類

主要應(yīng)用GA3，促進(jìn)體細(xì)胞胚發(fā)育成小植株，GA3不耐熱，水溶解后不穩(wěn)定，應(yīng)采用過濾除菌，并用酒精溶解。脫落酸

抑制蛋白質(zhì)合成，抵消和抑制上述三種激素發(fā)揮作用；誘導(dǎo)休眠、促進(jìn)衰老和脫落。乙烯當(dāng)前24頁，總共67頁。2023/3/14243.1.3.4植物細(xì)胞工程培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基母液的配制大量元素一般配成10倍濃度的母液；微量元素和有機(jī)營養(yǎng)常配成100倍濃度的母液；混合定容時(shí)，注意藥劑的添加順序及稀釋度，以免沉淀；生長調(diào)節(jié)類物質(zhì)不溶于水,需用不同溶劑進(jìn)行溶解單獨(dú)配制的試劑：鐵鹽與EDTACaCl2

前P28當(dāng)前25頁，總共67頁。2023/3/1425以KNO3為例1L培養(yǎng)基需要量為19g。在配制母液時(shí)，增加10倍量，為190g。在母液中的濃度為190g/L，即0.19g/ml在配制培養(yǎng)基時(shí)，取10ml，10ml×0.19g/ml=19g回P26當(dāng)前26頁，總共67頁。2023/3/14263.1.3.4植物細(xì)胞工程培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基配制過程藥品按順序混合pH調(diào)整加熱溶解器皿水洗干燥分裝培養(yǎng)基加塞

冷卻高壓蒸汽滅菌

當(dāng)前27頁，總共67頁。2023/3/14273.1.3.5常用培養(yǎng)基到目前研制開發(fā)了數(shù)十種適宜不同植物、不同組織、不同細(xì)胞生長發(fā)育的培養(yǎng)基配方。但多數(shù)培養(yǎng)基配方是在幾種普遍應(yīng)用的培養(yǎng)基上演變而來的。這幾種常見的培養(yǎng)基為是：MS、ER、B5、N6、NT、White等，其配方如下：當(dāng)前28頁，總共67頁。2023/3/1428當(dāng)前29頁，總共67頁。2023/3/1429培養(yǎng)基分類根據(jù)培養(yǎng)基無機(jī)鹽含量的差異將其分為以下4類：①高無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基（植物器官、花藥、細(xì)胞及原生質(zhì)體培養(yǎng)）；-MS②較高硝酸鹽含量培養(yǎng)基（木本、十字花科和單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)）；-B5③中等無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基（花藥培養(yǎng)）；-H④低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基（生根）。-WHITE當(dāng)前30頁，總共67頁。2023/3/14303.1.4植物組織培養(yǎng)問題分析試管苗玻璃化現(xiàn)象（vitrification）是指組織培養(yǎng)過程中的特有的一種生理失調(diào)或生理病變，試管苗呈半透明狀外觀形態(tài)異常的現(xiàn)象。

玻璃化苗絕大多數(shù)為來自莖尖或莖段培養(yǎng)物的不定芽。通常玻璃化苗恢復(fù)正常的比例很低，在繼代培養(yǎng)中仍然形成玻璃化苗。當(dāng)前31頁，總共67頁。2023/3/1431玻璃化的解決方法增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢；減少培養(yǎng)基中NH4+濃度；增加光照；增加容器通風(fēng)，最好進(jìn)行CO2施肥，這對減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生；降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。當(dāng)前32頁，總共67頁。2023/3/14323.1.4.2褐變問題成因酶促----酚氧化成醌及聚合非酶促----醌聚合時(shí)段初代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)當(dāng)前33頁，總共67頁。2023/3/1433①選擇合適的外植體一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。②合適的培養(yǎng)條件無機(jī)鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。③使用抗氧化劑在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。④材料預(yù)處理和細(xì)胞篩選⑤使用吸附劑0.1%-0.5%的活性炭、PVP對防止褐變也有較為明顯的效果。⑥連續(xù)轉(zhuǎn)移對容易褐變的材料可間隔12~24h的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7-l0d后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大為減輕。減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法當(dāng)前34頁，總共67頁。2023/3/14343.1.4.3微生物污染問題原因消毒不徹底外植體消毒問題培養(yǎng)基及器皿消毒問題環(huán)境消毒問題無菌操作不過關(guān)當(dāng)前35頁，總共67頁。2023/3/1435外植體消毒問題外植體取材外植體(expant)是指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織。來源：當(dāng)前36頁，總共67頁。2023/3/1436外植體消毒問題外植體滅菌的過程：流水沖洗10~20min表面消毒無菌水沖洗4~5次瀝水待用Flash當(dāng)前37頁，總共67頁。2023/3/1437常用消毒劑消毒滅菌效果比較消毒劑使用濃度%去除的難易消毒時(shí)間min效果次氯酸鈣次氯酸鈉漂白粉溴水過氧化氫升汞酒精抗生素硝酸銀9~102飽和溶液1~210~120.1~170~754~5(mg/L)1易易易易最易較難易中較難5~305~305~302~105~152~100.2~230~605~30很好很好很好很好好最好好較好好當(dāng)前38頁，總共67頁。2023/3/1438容器容積（mL）121℃下所需的最少滅菌時(shí)間(min）20~5075250~500100015002000152025303540培養(yǎng)基及器皿消毒滅菌問題培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所需的最少時(shí)間當(dāng)前39頁，總共67頁。2023/3/1439培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基組成中若含有遇熱易分解物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、維生素、尿素、酶等，則必須用過濾法除菌。過濾除菌時(shí)，使用孔徑為0.22~0.45μm或更小的細(xì)菌濾膜。過濾除菌可利用抽濾裝置或注射過濾器進(jìn)行，所用器皿均應(yīng)經(jīng)過高壓消毒滅菌，滅菌溫度不超過121℃。當(dāng)前40頁，總共67頁。2023/3/1440器皿消毒滅菌手術(shù)刀鑷子平皿干熱滅菌150-160℃，2h當(dāng)前41頁，總共67頁。2023/3/1441環(huán)境消毒問題當(dāng)前42頁，總共67頁。2023/3/1442無菌操作問題

評價(jià)下列操作正確與否當(dāng)前43頁，總共67頁。2023/3/1443評價(jià)下列操作正確與否當(dāng)前44頁，總共67頁。2023/3/1444評價(jià)下列操作正確與否當(dāng)前45頁，總共67頁。2023/3/1445評價(jià)下列操作正確與否當(dāng)前46頁，總共67頁。2023/3/1446無菌操作無菌操作前的準(zhǔn)備工作無菌操作臺的使用操作所用器械應(yīng)浸泡在95%酒精中，用前需放在耐熱器皿中加入少量酒精后進(jìn)行灼燒，每次使用后都要滅菌。無菌操作步驟外植體的適當(dāng)切割的注意事項(xiàng)繼代培養(yǎng)的材料(液體材料、固體材料）當(dāng)前47頁，總共67頁。2023/3/14473.1.4.4其他問題培養(yǎng)條件控制激素水平光照：時(shí)間，強(qiáng)度和光質(zhì)。溫度：適溫有利于細(xì)胞分裂與分化，而在一定范圍內(nèi)降低培養(yǎng)溫度可以使細(xì)胞的質(zhì)量增加；培養(yǎng)基晝夜變溫可能有利于器官的發(fā)生。pH通常使用的pH值的范圍是5.5－6.5。pH<4或>7，培養(yǎng)物不能正常生長。氣體當(dāng)前48頁，總共67頁。2023/3/1448激素水平的控制生長素應(yīng)用的濃度范圍為0.1~15mg/L。在細(xì)胞脫分化過程中，啟動(dòng)細(xì)胞分裂形成愈傷組織，以2,4-D最為有效。細(xì)胞脫分化需要高濃度的2,4-D，當(dāng)胚性細(xì)胞形成轉(zhuǎn)入再分化時(shí)，則需較低的2,4-D濃度。使用濃度范圍為0.1~10mg/L。細(xì)胞分裂素既可誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，又可調(diào)節(jié)細(xì)胞分化。當(dāng)前49頁，總共67頁。2023/3/144916h/d24h/d0h/d光照時(shí)間的影響當(dāng)前50頁，總共67頁。2023/3/1450液體振蕩培養(yǎng)的愈傷組織生長與振蕩頻率的關(guān)系當(dāng)前51頁，總共67頁。2023/3/14513.2植物胚胎培養(yǎng)Flash當(dāng)前52頁，總共67頁。2023/3/1452概念花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)范疇花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)范疇也稱小孢子培養(yǎng)花藥及花粉培養(yǎng)把發(fā)育到一定階段的花藥接種在人工培養(yǎng)基上，使其發(fā)育和分化成植株的過程從花藥中分離出花粉粒使之成為分散或游離的狀態(tài)，通過培養(yǎng)使其脫分化并發(fā)育成植株的過程當(dāng)前53頁，總共67頁。2023/3/1453獲得單倍體植株花藥培養(yǎng)的基本程序：Flash選處于生殖生長高峰期的花藥，需低溫預(yù)處理（3～10℃，2～10天），光照先弱后強(qiáng)?；ㄋ幣囵B(yǎng)目的及程序當(dāng)前54頁，總共67頁。2023/3/1454花粉或小孢子的分離花粉或小孢子培養(yǎng)目的及方法目的：獲得單倍體植株當(dāng)前55頁，總共67頁。2023/3/1455花藥看護(hù)培養(yǎng)花粉懸浮培養(yǎng)固液雙層培養(yǎng)花粉培養(yǎng)方法當(dāng)前56頁，總共67頁。2023/3/1456當(dāng)前57頁，總共67頁。2023/3/14573.3毛狀根培養(yǎng)定義：毛狀根(hairyroots)是（雙子葉）植株或組織、器官經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacteriumrhizogenes）感染后，形成的類似頭發(fā)一樣的根組織。又稱發(fā)狀根。

1934年，Hildebrand

報(bào)道了發(fā)根農(nóng)桿菌感染蘋果樹產(chǎn)生發(fā)根。當(dāng)前58頁，總共67頁。2023/3/1458毛狀根的特性特性：毛狀根可以不依賴激素快速生長，根多叢生，多分枝，多根毛，無向地性。生理生化和遺傳穩(wěn)定。為什么可以不依賴激素？發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒上的T-DNA片斷整合進(jìn)植物細(xì)胞核基因組中。T-DNA上有生長素合成基因tms1和tms2能夠指導(dǎo)IAA的合成。當(dāng)前59頁，總共67頁。2023/3/14593.3.1毛狀根的誘導(dǎo)3.3.1.1外植體接種法---共培養(yǎng)3.3.1.2莖稈接種法3.3.1.3原生質(zhì)體-農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法當(dāng)前60頁，總共67頁。2023/3/1460生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素青蒿：為雙子葉植物藥菊科植物青蒿素：倍半萜內(nèi)酯類化合物功效：治療瘧疾當(dāng)前61頁，總共67頁。2023/3/14611.Bioreactor,2.Concentricdraughtcylinder,3.Stainlessstellmesh,4.Airoutlet