微生物的培養(yǎng)基

微生物包括哪五類：病毒細菌放線菌真菌原生動物特點：結構都相當簡單,多數(shù)個體十分微小(<o.1mm)的生物的總稱。通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結構.且體內一般不含有葉綠素.不能進行光合作用.

原核

原生生物界真菌界病毒界真核當前1頁，總共38頁。當前2頁，總共38頁。病毒

當前3頁，總共38頁。SARS病毒禽流感病毒當前4頁，總共38頁。朊病毒（蛋白質病毒）當前5頁，總共38頁。真菌當前6頁，總共38頁。如圖是酵母菌電子顯微鏡下的形態(tài)結構酵母菌和霉菌青霉當前7頁，總共38頁。

了解有關培養(yǎng)基的基礎知識，進行無菌技術的操作，進行微生物的培養(yǎng)。

一、課題目標：

掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術，熟練、規(guī)范地進行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無菌技術的操作。二、課題重點和難點：三、技能目標：當前8頁，總共38頁。（2）按培養(yǎng)基的物理形態(tài)分：液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基一基礎知識:（3）按培養(yǎng)基的功能分：P12基礎培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基（1）按培養(yǎng)基的化學成分分：·天然培養(yǎng)基·合成培養(yǎng)基·半合成培養(yǎng)基閱讀課本P8第三段分別說出它們的優(yōu)點、缺點。當前9頁，總共38頁。各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都包括哪些成分？答：不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質。

注：另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質,例如:生長因子(即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。

當前10頁，總共38頁。當前11頁，總共38頁。二無菌技術：無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。閱讀P8---P9說出消毒和滅菌有何不同？1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(1)常用消毒的方法：當前12頁，總共38頁。1、灼燒滅菌:2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.(2)常用滅菌的方法：當前13頁，總共38頁。分類定義方法滅菌法殺滅一切微生物物理法：熱力、輻射、微波、等離子體化學法：醛類、烷化劑高效消毒法殺滅一切致病微生物紫外線、含氯劑、臭氧、復配劑等中效消毒法殺滅除芽孢外的致病微生物超聲波、碘類、醇類、酚類低效消毒法殺滅細菌繁殖體、親脂病毒單鏈季胺鹽、雙胍類、中草藥、金屬離子無菌技術：當前14頁，總共38頁。常

識1．無菌技術包括：（1）對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行

滅菌

；（3）為避免周圍微生物污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近

旁進行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與

周圍物品

相接觸。2．消毒方法：（1）日常生活經(jīng)常用到的是

煮沸消毒法；（2）對一些不耐高溫的液體，則使用

巴氏

消毒法（作簡要介紹）；（3）對接種室、接種箱或超凈工作臺首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強消毒效果，然后使用

紫外線進行物理消毒。（4）實驗操作者的雙手使用酒精進行消毒；（5）飲水水源用氯氣進行消毒。3．滅菌方法：（1）接種環(huán)、接種針、試管口等使用

灼燒

滅菌法；（2）玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是

干熱滅菌箱；（3）培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽

滅菌法，所用器械是

高壓蒸汽滅菌鍋。（4）表面滅菌和空氣滅菌等使用

紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。當前15頁，總共38頁。三、實驗操作1.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細菌）當前16頁，總共38頁?！狙a充】培養(yǎng)基的配制原則：①目的要明確：根據(jù)培養(yǎng)的微生物種類、培養(yǎng)的目的等確定培養(yǎng)基的類型和配制量。②營養(yǎng)要協(xié)調：培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物質的濃度和比例要適宜。例如：碳氮比4∶1時，谷氨酸棒狀桿菌大量繁殖而產生谷氨酸少；碳氮比為3∶1時，菌體繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。③pH要適宜：細菌培養(yǎng)基pH中性或偏堿性，霉菌培養(yǎng)基呈酸性。當前17頁，總共38頁。1．配制：計算、稱量、熔化2．調節(jié)pH：用3%的HCI/NaOH調節(jié)

pH7．0---7．23．分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。4．包扎：操作步驟:當前18頁，總共38頁。5．滅菌:

將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)皿用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內，在160～170℃下滅菌2h。

6．倒平板:

待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板。2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種.7．無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。當前19頁，總共38頁。倒平板:當前20頁，總共38頁。菌種的保存1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。

2、長期保存：甘油冷凍管藏法當前21頁，總共38頁。1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論

答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。注意:當前22頁，總共38頁。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。當前23頁，總共38頁。選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:

分離導入了目的基因的受體細胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基:

分離雜交瘤細胞當前24頁，總共38頁。2、純化大腸桿菌:接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法

平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面.

在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落.微生物的接種技術當前25頁，總共38頁。當前26頁，總共38頁。劃線后培養(yǎng)一段時間后當前27頁，總共38頁。微生物的恒溫培養(yǎng)當前28頁，總共38頁。微生物的恒溫培養(yǎng)當前29頁，總共38頁。問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。當前30頁，總共38頁。

2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。當前31頁，總共38頁。四、課題成果評價

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。（三）是否進行了及時細致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學生良好的科學態(tài)度與習慣。當前32頁，總共38頁。本課題知識小結:當前33頁，總共38頁?！镜淅馕觥?/p>

例1．關微生物營養(yǎng)物質的敘述中，正確的是:A.是碳源的物質不可能同時是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機物只提供無機鹽D.無機氮源也能提供能量

解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項，它的表達是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項，除水以外的無機物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機鹽；而NaCl則只能提供無機鹽。對于D選項，無機氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細菌提供能量和氮源。答案：D當前34頁，總共38頁。例2．下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是:A.防止雜菌污染B.消滅雜菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設備都必須滅菌D.滅菌必須在接種前答案：B

解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的，因為發(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯誤的，因為滅菌的目的是防止雜菌污染，但實際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因為與發(fā)酵有關的所有設備和物質都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會把所接菌種也殺死。當前35頁，總共38頁。編號成分含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例3．右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請據(jù)此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類型是

（2）若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中。如不想浪費此培養(yǎng)基，可再加入

.用于培養(yǎng)金黃色葡萄球菌.自養(yǎng)型微生物

含碳有機物

當前36頁，總共38頁。（3）若除去成分②，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)

。（4）表中營養(yǎng)成分共有