基因打靶技術(shù)

基因打靶技術(shù)第一頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日基因打靶研究背景基因轉(zhuǎn)移技術(shù)顯微注射、電穿孔、磷酸鈣沉淀及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染等導(dǎo)入的外源基因在靶細(xì)胞基因組中整合的位點(diǎn)一般是隨機(jī)的可能導(dǎo)致下面幾種情況出現(xiàn)：①導(dǎo)入的外源基因整合入某一正常基因的中部，導(dǎo)致該正?；虮磉_(dá)的缺失；②導(dǎo)入的外源基因整合入細(xì)胞內(nèi)正常基因的側(cè)翼序列，影響了其周圍正?；虻幕钚?；③外源基因的導(dǎo)入有可能激活細(xì)胞內(nèi)的原癌基因；④導(dǎo)入的外源基因由于其整合位點(diǎn)的不適，而在細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)或表達(dá)難以控制。解決辦法：將外源基因?qū)腩A(yù)先確定的位點(diǎn)。

即對(duì)細(xì)胞內(nèi)靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)修飾——基因打靶，第二頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日什么是基因打靶？基因打靶（genetargeting）是指外源DNA與受體細(xì)胞染色體DNA上的同源序列之間發(fā)生重組，并整合在預(yù)定位點(diǎn)，改變細(xì)胞遺傳特性的方法

建立在胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ES細(xì)胞）與同源重組技術(shù)基礎(chǔ)之上的基因打靶技術(shù)是一種定向改變生物活體遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段第三頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日基因打靶原理生物界同源重組現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，為基因打靶奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，而胚胎干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，促進(jìn)了基因打靶的廣泛應(yīng)用。同源重組(Homologousrecombination)又稱一般性重組或非特異性重組(Generalrecombination)，是指相似的DNA交換遺傳信息的過(guò)程,外源DNA片段可與宿主基因組的相應(yīng)片段發(fā)生交換（即重組）。ES細(xì)胞是一類具有在體外培養(yǎng)條件下保持未分化狀態(tài)的增殖能力及分化為多種細(xì)胞類型的細(xì)胞。第四頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第五頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日基因打靶的原理第六頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日基因打靶的主要步驟重組基因載體的構(gòu)建導(dǎo)入受體細(xì)胞篩選檢測(cè)第七頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日基因打靶的主要步驟打靶載體的構(gòu)建基因打靶載體包括載體骨架、靶基因同源序列和突變序列及選擇性標(biāo)記基因等?；虼虬休d體：基因插入型載體(Gene-insertionvector)：插入型載體中與靶基因同源的區(qū)段中含有特異的酶切位點(diǎn)，線性化后，同源重組導(dǎo)致基因組序列的重復(fù)，從而干擾了目標(biāo)基因的功能?；蛑脫Q型載體(Gene—replacementvector)：置換型載體進(jìn)行線性化的酶切位點(diǎn)在引導(dǎo)序列和篩選基因外側(cè)，線性化后，同源重組使染色體DNA序列為打靶載體序列替換。大多數(shù)基因敲除突變都采用置換型載體進(jìn)行基因打靶。第八頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日基因打靶的主要步驟2、外源DNA導(dǎo)人的方式

外源DNA導(dǎo)人的方式主要有顯微注射法、電穿孔法、精子載體法和逆轉(zhuǎn)錄病毒法等。目前應(yīng)用最廣的是顯微注射法。顯微注射每次只能注射一個(gè)細(xì)胞；電穿孔法可同時(shí)使許多細(xì)胞得到轉(zhuǎn)染。Mansour等研究發(fā)現(xiàn)電穿孔可使1％的ES細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法利用某些病毒與組織細(xì)胞有特異的親合力，可用于時(shí)空特異性基因打靶，在人類疾病的基因治療方面具有較大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

第九頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日3.基因打靶的篩選方法（1）正負(fù)雙向選擇系統(tǒng)(positive-negative-selection,PNS)解決了定點(diǎn)整合與隨機(jī)整合的鑒別問(wèn)題。同源重組時(shí)，只有載體的同源區(qū)以內(nèi)部分發(fā)生重組，同源區(qū)以外部分將被切除。隨機(jī)整合時(shí)，是在載體的兩端將整個(gè)載體連入染色體內(nèi)。正選擇基因多為neo基因，位于同源區(qū)內(nèi)，其在隨機(jī)整合和同源重組中均可正常表達(dá)。負(fù)選擇基因常用HSV-tk基因，在靶基因同源區(qū)之外，位于載體的3’末端，在同源重組時(shí)，tk基因?qū)⒈磺谐鴣G失，在隨機(jī)整合時(shí)，所有的序列均保留（包括tk）。第十頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日3.基因打靶的篩選方法（1）正負(fù)雙向選擇系統(tǒng)(positive-negative-selection,PNS)

無(wú)毒的丙氧鳥(niǎo)苷（GANC）毒性核苷酸殺死細(xì)胞篩選排除隨機(jī)整合的細(xì)胞株。同源重組時(shí)，G418和GANC都有抗性，隨機(jī)整合時(shí)對(duì)G418有抗性，但對(duì)GANC敏感，細(xì)胞將被殺死，無(wú)整合的將被G418殺死。

用G418作正篩選，選出含有neo基因的細(xì)胞株，再用丙氧鳥(niǎo)苷作負(fù)篩選淘汰含有tk基因的細(xì)胞株，保留未含有tk基因的同源重組細(xì)胞株。胸苷激酶蛋白（TK）第十一頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日2023/3/14蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第十二頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日基因打靶的篩選第十三頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日3.基因打靶的篩選方法（2）正相選擇法（positiveselectionmethod）主要程序：將標(biāo)記基因neor的啟動(dòng)子和起始密碼剪切掉，再嵌合入打靶載體中與靶位點(diǎn)同源的序列內(nèi)，將打靶載體轉(zhuǎn)染進(jìn)靶細(xì)胞，

可能出現(xiàn)下面幾種情況：①打靶載體不整合入靶細(xì)胞基因組，將隨傳代而丟失；②外源打靶序列隨機(jī)整合，由于neor基因缺失了其自身的啟動(dòng)子和起始密碼，整合位點(diǎn)周圍亦無(wú)啟動(dòng)子，使neor基因的表達(dá)受阻；③雖是隨機(jī)整合，但其整合位點(diǎn)側(cè)翼序列在其它基因的啟動(dòng)子能啟動(dòng)neor基因的表達(dá)；④外源打靶載體與靶位點(diǎn)發(fā)生了同源重組，則neor基因可借助靶基因自然存在的啟動(dòng)子和起始密碼的作用而呈現(xiàn)表達(dá)活性。

因此，如用G418篩選，則抗性細(xì)胞中將只包含后兩種可能情況，根據(jù)這兩種情況下基因組DNA酶切圖譜的不一致，用Southern印跡雜交即可檢測(cè)出同源重組的克隆。第十四頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日4.基因打靶的策略完全基因剔除(completeknotk-out)的策略大規(guī)模隨機(jī)基因剔除—基因捕獲(genetrapping)精細(xì)突變的引入條件性基因打靶打了就走策略(HitandRun法)“標(biāo)記和置換”法(TagandExchange)第十五頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日4.基因打靶的策略借助于陽(yáng)性選擇標(biāo)記基因通常被插入靶基因功能最關(guān)鍵的外顯子中，或通過(guò)同源重組刪除靶基因最重要的功能域，實(shí)行靶基因的完全剔除。陽(yáng)性選擇標(biāo)記基因常采用β-半乳糖苷酶基因（lacZ），將其以正確的讀框插入靶基因的外顯子中，除了剔除靶基因外，通過(guò)分析β-半乳搪苷酶的活性可以研究靶基因表達(dá)的時(shí)空順序。完全基因剔除(completeknotk-out)的策略第十六頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日4.基因打靶的策略可以建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的ES細(xì)胞庫(kù)，neo基因插入到ES細(xì)胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實(shí)現(xiàn)表達(dá)的ES克隆可以很容易地在含G418的選擇培養(yǎng)基中篩選出來(lái)。中靶基因的信息可以通過(guò)篩選標(biāo)記基因側(cè)翼cDNA或染色體組序列分析來(lái)獲得。

在單次實(shí)驗(yàn)中可以獲得數(shù)以百計(jì)的帶有單基因剔除的ES克隆。但此方法的缺點(diǎn)是只能剔除在ES細(xì)胞中表達(dá)的基因。第十七頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日4.基因打靶的策略這一方法包括兩次同源重組：第一步（Hit）用插入型載體進(jìn)行同源重組，這樣會(huì)在靶位點(diǎn)插入帶有突變的基因組序列以及載體骨架，載體骨架上帶有兩個(gè)篩選標(biāo)記（如正篩選標(biāo)記基因neo和負(fù)篩選標(biāo)記基因tk）。第二步（Run）利用tk抗性篩選，富集為數(shù)不多的發(fā)生了染色體內(nèi)重組的克隆。染色體內(nèi)重組去除了含有負(fù)篩選標(biāo)記基因的載體序列，由于負(fù)篩選標(biāo)記基因的消失，細(xì)胞就恢復(fù)了對(duì)負(fù)篩選藥物的抗性，因此，回復(fù)突變體可以在負(fù)選擇培養(yǎng)基中存活下來(lái)。第十八頁(yè)，共十