常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用

常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用第一頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第一節(jié)

分子雜交與印跡技術(shù)

Molecularhybridization

&blottingtechnology第二頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日核酸分子雜交

(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過程中，把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可在不同的分子之間形成雜化雙鏈的這種現(xiàn)象。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理雜交的原理實質(zhì)是核酸分子的變性與復(fù)性過程第三頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日復(fù)性RNADNA第四頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日（一）印跡技術(shù)1.具體步驟SouthernE1975年首次應(yīng)用

SouthernEM.DetectionofspecificsequencesamongDNAfragmentsseparatedbygelelectrophoresis.

JMolBiol，1975,98(3):503-517.原始文獻出處：第五頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日（一）印跡技術(shù)1.具體步驟

SouthernE1975年首次應(yīng)用瓊脂糖分離的DNA片段→變性為單鏈→將一張NC膜放在膠上，上面放吸水紙巾→利用毛細作用使膠中的DNA片段轉(zhuǎn)移到NC膜上，使之成為固相化分子。載有DNA單鏈分子的NC膜可在雜交液與另一種DNA或RNA分子（探針）雜交，具有互補序列的RNA或DNA結(jié)合到存在于NC膜的DNA分子上，經(jīng)檢測分析可顯現(xiàn)出雜交分子的區(qū)帶。第六頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日2.印跡(blotting)定義將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印跡）或直接放在固相化介質(zhì)上并加以檢測分析的技術(shù)。3.應(yīng)用廣泛用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)的檢測4.發(fā)展電轉(zhuǎn)移印跡技術(shù)、真空吸引轉(zhuǎn)移印跡等第七頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日（二）探針技術(shù)探針(probe)的概念

是帶有特殊可檢測標記（放射性核素、生物素或熒光染料）的核酸片段，它具有特定的序列，能夠與待測的核酸片段互補結(jié)合，因此可以用來檢測核酸樣品中是否存在某一特定的基因。探針的種類寡核苷酸探針基因組DNA探針cDNA探針RNA探針第八頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日將探針與固定在NC膜上的DNA或RNA進行結(jié)合反應(yīng)，探針的序列如與NC膜上的核酸序列相互補，就可結(jié)合到膜上的相應(yīng)區(qū)帶，經(jīng)放射自顯影或其他檢測手段就可判斷膜上是否有同源的核酸分子存在。探針技術(shù)的概念第九頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡技術(shù)

(Southernblotting)

（二）RNA印跡技術(shù)

(Northernblotting)

（三）蛋白質(zhì)的印跡分析

(Westernblotting)

第十頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日（一）SouthernblottingM12轉(zhuǎn)移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾玻璃板重物支持物500g12與探針同源雜交的基因DNA片段基因組DNADNA酶切片段內(nèi)切酶NC或尼龍膜NC膜或尼龍膜第十一頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日基因組DNA的定性與定量分析。如對在基因組中特異基因的定位及檢測等。重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。Southertblotting用途第十二頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日放射自顯影照片第十三頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日（二）RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)相同點：AlwineJC,etal.MethodfordetectionofspecificRNAsinagarosegelsbytransfertodiazobenzyloxymethyl-paper（重氮芐氧甲基紙）andhybridizationwithDNAprobes.ProcNatlAcadSciUSA,

1977,74(12):5350-5354原始文獻出處名稱相對于Southernblotting轉(zhuǎn)移的是RNA轉(zhuǎn)移前無需酶切轉(zhuǎn)移效率較高變性方法不同點原理均為毛細作用。第十四頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日（二）RNA印跡技術(shù)Northernblotting用途檢測某一組織或細胞中已知的特異mRNA的表達水平。比較不同組織和細胞的同一基因的表達情況。第十五頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日Northernblotting結(jié)果第十六頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日由于基因組測序的完成及基因芯片技術(shù)的成熟以上兩種技術(shù)應(yīng)用的越來越少第十七頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日（三）蛋白質(zhì)的印跡技術(shù)(免疫印跡)首先將混合蛋白質(zhì)用PAGE按分子大小分開，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜或PVDF膜上，蛋白質(zhì)的位置可保持在膠中的原位上。與DNA和RNA印跡相似之處第十八頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移只有靠電轉(zhuǎn)移。蛋白質(zhì)的檢測以抗體作探針。用堿性磷酸酶（ALP）、辣根過氧化酶（HRP）標記第二抗體，底物顯色來檢測蛋白區(qū)帶的信號，底物亦可與化學(xué)發(fā)光劑結(jié)合以提高敏感度?；蛴猛凰貥擞浀诙贵w，放射自顯影法檢測蛋白區(qū)帶的信號。與DNA和RNA印跡不同之處第十九頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日Westernblotting應(yīng)用檢測樣品中的特異蛋白質(zhì)的存在。細胞中特異蛋白質(zhì)的定量分析。蛋白質(zhì)分子的相互作用研究。第二十頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第二十一頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第二十二頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第二十三頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日辣根過氧化酶（HRP）使試劑中的發(fā)光物（Luminol魯米諾）氧化并發(fā)光，而試劑中含有增強劑這使得發(fā)光增強了1000倍。經(jīng)HRP標記的抗體與膜上的蛋白直接（標記一抗）反應(yīng)。當加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑后，Luminol發(fā)生氧化降解，并發(fā)射波長為428nm的光，此光可經(jīng)X光膠片感光記錄下來。

第二十四頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日Westernblotting應(yīng)用SDSpurifiedrecombinanthumanCK2α(重組人酪蛋白激酶2α)

subunitanditsWesternblotting用已知的特異抗體檢測目的基因蛋白重組人酪蛋白激酶2α

第二十五頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日三種印跡技術(shù)的比較Westernblotting垂直槽Northernblotting水平槽Southernblotting水平槽第二十六頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日斑點印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)

其他印跡技術(shù)第二十七頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日斑點印跡(dotblotting)ADotblotisatechniqueinmolecularbiologyusedtodetectbiomolecules.Itrepresentsasimplificationofthenorthernblot,southernblot,orwesternblotmethods.Inadotblotthebiomoleculestobedetectedarenotfirstseparatedbyelectrophoresis.Instead,amixturecontainingthemoleculetobedetectedisapplieddirectlyonamembraneasadot.Thisisthenfollowedbydetectionbyeithernucleotideprobes(foranorthernblotandsouthernblot)orantibodies(forawesternblot).第二十八頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日Thetechniqueofferssignificantsavingsintime,aschromatographyorgelelectrophoresis,andthecomplexblottingproceduresforthegelarenotrequired.However,itoffersnoinformationonthesizeofthetargetbiomolecule.

Furthermore,iftwomoleculesofdifferentsizesaredetected,theywillstillappearasasingledot.

DotblotsthereforecanonlyconfirmthepresenceorabsenceofabiomoleculeorbiomoleculeswhichcanbedetectedbytheDNAprobesortheantibody.第二十九頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第三十頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日原位雜交(insituhybridization)Insituhybridization(ISH)isatypeofhybridizationthatusesalabeledcomplementaryDNAorRNAstrand(i.e.,probe)tolocalizeaspecificDNAorRNAsequenceinasectionoftissue,or,ifthetissueissmallenough,intheentiretissue.DNAISHcanbeusedtodeterminethestructureofchromosomes.FluorescentDNAISH(FISH)can,forexample,beusedinmedicaldiagnosticstoassesschromosomalintegrity.RNAISH(hybridizationhistochemistry)isusedtomeasureandlocalizemRNAsandothertranscriptswithintissuesectionsorwholemounts.第三十一頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日A：正常細胞，兩綠兩紅.B：一個t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信號，一綠一紅兩融合.D：一個t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信號，兩紅兩綠一融合，這由于異常染色體上面的BCR和ABL基因分離造成的.E：一個t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信號和一個額外的Ph染色體。一紅一綠三融合.第三十二頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日DNA芯片將多種已知序列的DNA排列在一定大小的固相支持物上用于檢測細胞或組織樣品中的核酸種類的技術(shù)。第三十三頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第三十四頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第二節(jié)

PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用

（PolymeraseChainReaction，PCR）聚合酶鏈反應(yīng)第三十五頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日

PCR技術(shù)是1985年由美國科學(xué)家KaryBMullis建立的體外擴增基因片段的方法，它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點，是分子生物學(xué)技術(shù)中一項具有革命性的創(chuàng)舉。PCR方法被美國Science雜志評為1989年的十大科技成就之一，而TaqDNA聚合酶被評選為象征1989年的“年分子”(themoleculeofyear)。第三十六頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日TheNobelPrizeinChemistry1993"forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA-basedchemistry"MichaelSmithLaJolla,CA,USAKaryB.MullisUniversityofBritishColumbiaVancouver,Canada"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method""forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies"第三十七頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日5Primer15Primer2Cycle2Cycle15555

5

5TemplateDNA一、PCR技術(shù)的工作原理55555555第三十八頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日Cycle355

5555555

5

55555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。第三十九頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分第四十頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日PCR反應(yīng)循環(huán)變性95?C左右延伸適溫退火Tm-5?C經(jīng)過30個左右的循環(huán)后，PCR的擴增倍數(shù)為(1+x)n,x=75%,n為循環(huán)數(shù).第四十一頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日2.利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段。3.利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得具有一定同源性的基因片段。4.利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中隨機克隆基因。1.與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接從組織和細胞的mRNA獲得目的基因片段。二、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克隆第四十二頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日（二）基因的體外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）基因突變分析二、PCR技術(shù)的主要用途第四十三頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-PCR)（二）原位PCR技術(shù)(ISP)（三）實時PCR技術(shù)(realtimePCR)第四十四頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日RT-PCR技術(shù)AAnATTnT5′5′mRNA反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3′TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1雙鏈cDNA3′5′3′5′5′加熱變性加入特異性引物DNA聚合酶PCR擴增出大量的產(chǎn)物第四十五頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日原位PCR技術(shù)(ISP)原位PCR技術(shù)就是將PCR技術(shù)的高效擴增與原位雜交的細胞定位結(jié)合起來，從而在組織細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。

PCR技術(shù)是在DNA聚合酶的作用下，經(jīng)過模板的變性、退火和引物延伸三種循環(huán)，將引物引導(dǎo)下的特異性靶序列迅速地進行擴增，經(jīng)過擴增的靶序列（一般能擴增106倍），很容易在凝膠電泳或Southern印記雜交中顯示出來，因此，PCR技術(shù)具有靈敏度高，特異性強的優(yōu)勢，隨著熱循環(huán)自動化的提高與穩(wěn)定也使得PCR技術(shù)的操作簡便易行。但是，PCR技術(shù)是在液相中進行的，在擴增前，需將細胞破壞，從中提取核酸作為模板，因此很難將PCR的結(jié)果與組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來，同時，也很難判斷含特異性靶序列的細胞類型。第四十六頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日原位PCR技術(shù)成功地將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來，保持了兩項技術(shù)的優(yōu)勢又彌補了各自的不足。原位PCR技術(shù)的待檢標本一般先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細胞膜和核膜均具有一定的通透性，當進行PCR擴增時，各種成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進入細胞內(nèi)或細胞核內(nèi)，以固定在細胞內(nèi)或細胞核內(nèi)的RNA或DNA為模板，于原位進行擴增。擴增的產(chǎn)物一般分子較大，或互相交織，不易穿過細胞膜或在膜內(nèi)外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細胞內(nèi)單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數(shù)極擴增，擴增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術(shù)檢查。

第四十七頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日multidrugresistanceassociated-protein(mrp)genemultidrugresistanceassociated-protein(mrp)genemultidrugresistanceassociatedprotein第四十八頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日實時PCR技術(shù)(realtimePCR)常規(guī)PCR反應(yīng)中產(chǎn)物以指數(shù)形式增加，在比較不同來源樣品的DNA或cDNA含量時，產(chǎn)物的堆積將影響對檢測樣品中原有模板含量差異的準確判斷，因此只能作為半定量手段應(yīng)用。實時PCR(real-timePCR)技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。RealtimePCR常用的兩種方法分別為SYBRgreen（熒光染料摻入法）和Taqmanprobe（探針法）。

第四十九頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日SYBRgreen（熒光染料摻入法）在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

第五十頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第五十一頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日1、靈敏度高：使用SYBR可使熒光效果增強到1000倍以上。2、通用性好，不需要設(shè)計探針，方法簡便，省時，價格低廉。3、通用型方法，在國內(nèi)外科研中普遍使用。4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測。5、專一性要求不高的定量PCR檢測。此方法適用于：第五十二頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日Taqmanprobe（探針法）PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

第五十三頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日探針法技術(shù)原理第五十四頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日1、具有高適應(yīng)性和可靠性，實驗結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性好，特異性更高。2、適用于擴增序列專一的體系的檢測。3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測。4、靶基因的特異序列較短，無論怎樣優(yōu)化引物設(shè)計條件都不能解決。5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴增，對特異性要求較高的定量。此方法適用于：第五十五頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第三節(jié)

核酸序列分析

Nucleicacidsequenceanalysis第五十六頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日核酸序列分析的基本原理化學(xué)裂解法(Maxam-Gilbert法)DNA鏈的末端合成終止法(Sanger法)第五十七頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日一、化學(xué)裂解法(Maxam-Gilbert法)基于某些化學(xué)試劑可以使DNA鏈在1個或2個堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)強度，使一個斷裂點僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標記DNA的5′末端，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。第五十八頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日(Sanger雙脫氧鏈終止法)HOPOPOPOCH2OOOOHOHOHOA,C,GorT1′3′OHαβγ5′雙脫氧核苷三磷酸脫去二、DNA鏈末端合成終止法Sanger1958年和1980年兩次獲Nobel獎第五十九頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第六十頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第六十一頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日TheNobelPrizeinChemistry1980"forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA""fortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids"PaulBergWalterGilbertFrederickSanger1/2oftheprize1/4oftheprize1/4oftheprizeStanfordUniversityStanford,CA,USAHarvardUniversity,BiologicalLaboratoriesCambridge,MA,USAMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom

第六十二頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日三、DNA自動測序用熒光替代放射性核素標記是實現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標記4種ddNTP，然后進行Sanger測序反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離。通過4種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出4種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。

第六十三頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日目前所用自動測序技術(shù)

同位素標記到熒光標記,平板電泳到毛細管電泳多色熒光標記毛細管電泳

單色熒光標記平板電泳同位素標記平板電泳ACGTACGT測序圖譜TA

TTGCATTGTC

TGCATTGT

C

T第六十四頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日DNA測序儀示意圖computeranalysis凝膠中DNA移動方向樣品槽激光器輸入光學(xué)系統(tǒng)成象透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機旋光鏡/棱鏡組件第六十五頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日DNA自動測序結(jié)果舉例第六十六頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日ABIPRISM310型DNA測序儀第六十七頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日目前所用測序技術(shù)的缺點1、測序的原理是DNA鏈終止法，這注定了一個反應(yīng)所測序列不可能太長，目前為1000個核苷酸左右。2、測序反應(yīng)費時費力科學(xué)家們完成第一個人類基因組測序整整花了13年的時間，耗費了30億美元的費用。3、測序準確度不高DNA聚合酶造成的堿基錯配，DNA序列判讀錯誤。4、測序基于PCR反應(yīng)，需要引物，并且有些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的難于進行PCR反應(yīng)的片段不能測序。第六十八頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日下一代測序技術(shù)下一代測序技術(shù)又稱為二代測序技術(shù)，其代表技術(shù)為羅氏公司(Roche)的454測序儀(RocheGSFLXsequencer),Illumina公司的Solexa基因組分析儀(IlluminaGenomeAnalyzer)和ABI的SOLiD測序儀(ABISOLiDsequencer)。第六十九頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第七十頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日特點測序策略主要基于循環(huán)芯片測序法（Cyclic-arraysequencing），即制備DNA文庫，單分子擴增，在固相載體上形成DNA簇陣列，并行地利用DNA聚合酶或者連接酶進行酶促反應(yīng)（模板變性、引物退火雜交、延伸或連接），同時讀取反應(yīng)產(chǎn)生的特異性熒光信號，最終得到超大量的DNA序列信息。高通量并行測序。例如，RocheGSFLXsequencer一次就可對上百萬條DNA分子同時進行序列測定，一次運行通量達到400Mb以上，而傳統(tǒng)測序（一代測序）一輪測序的通量僅為80Kb左右。單分子測序。傳統(tǒng)測序（一代測序）是對多個DNA分子的混合物進行測序，其測序結(jié)果是多個DNA分子綜合的序列信息；而二代測序先對單個DNA分子進行PCR以放大DNA分子數(shù)量（相當于單個DNA分子的克隆復(fù)制），再對這些DNA分子進行測序，就可以得到原來單個DNA分子的序列信息。

第七十一頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日新型納米孔測序法新型納米孔測序法（nanoporesequencing）是采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動單個分子逐一通過納米孔來實現(xiàn)測序的。由于納米孔的直徑非常細小，僅允許單個核酸聚合物通過，因而可以在此基礎(chǔ)上使用多種方法來進行高通量檢測。此外，納米級別的孔徑保證了檢測具有良好的持續(xù)性，所以測序的準確度非常高。對于長達1,000個堿基的單鏈DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根本無需進行擴增或標記就可以使用納米孔測序法進行檢測，這使得便宜、快速地進行DNA測序成為可能。如果對現(xiàn)有納米孔測序法進行進一步發(fā)展和改進，那么它將有望成為第三代測序技術(shù)（也可稱為下、下一代測序技術(shù)），從而幫助人們實現(xiàn)24小時內(nèi)只花費1,000美元完成二倍體哺乳動物基因組測序這一目標。

第七十二頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日基因文庫

GeneLibrary第四節(jié)第七十三頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日基因組DNA文庫

(genomicDNAlibrary)cDNA文庫

(cDNAlibrary)

基因文庫(genelibrary)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。第七十四頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。

用于構(gòu)建基因組文庫的載體有噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。第七十五頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細胞的基因表達信息。

二、cDNA文庫第七十六頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第七十七頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第五節(jié)

生物芯片技術(shù)Biologicalchiptechnology第七十八頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標記樣品進行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，通過計算機系統(tǒng)對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)第七十九頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第八十頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日

將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)第八十一頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日Theworld'shighest-densityproteinmicroarray,carrying22,000humanproteins

第八十二頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第六節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy第八十三頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)各種親和分析（標簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）酵母雙雜交熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)第八十四頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日標簽融合蛋白結(jié)合實驗是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。（一）標簽蛋白沉淀標簽融合蛋白結(jié)合實驗主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。第八十五頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日方法原理該方法利用一種帶有特定標簽（tag）的純化融合蛋白作為釣餌，在體外與待檢測的純化蛋白溫育，然后用可結(jié)合蛋白標簽的瓊脂糖珠將融合蛋白沉淀回收，洗脫液經(jīng)電泳分離并染色。如果兩種蛋白有直接的結(jié)合，待檢測蛋白將與融合蛋白同時被瓊脂糖珠沉淀（pull-down），在電泳膠中見到相應(yīng)條帶。第八十六頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日標簽融合蛋白沉淀實驗流程示意圖第八十七頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日GSTpull-downassay其基本原理是將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上，作為與目的蛋白親和的支撐物，充當一種“誘餌蛋白”。目的蛋白溶液過柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白)。洗脫結(jié)合物后通過SDS電泳分析，從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白?！罢T餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。此方法簡單易行，操作方便。第八十八頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日Schematicofpull-downassayusingbacterialexpressionofbaitproteinandcell-freeexpressionforthepreyprotein.

第八十九頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日（二）免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將抗原（常為靶蛋白）從混合體系沉淀下來，初步分離靶蛋白的一種方法。免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。

第九十頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日原理當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。

第九十一頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日實驗流程示意圖第九十二頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日

實驗流程為：

（1）轉(zhuǎn)染后24-48h可收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min,細胞裂解液于4°C，最大轉(zhuǎn)速離心30min后取上清；

（2）取少量裂解液以備Westernblot分析，剩余裂解液加1μg相應(yīng)的抗體加入到細胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜；

（3）取10μlproteinA瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3次，每次3,000rpm離心3min；

（4）將預(yù)處理過的10μlproteinA瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與proteinA瓊脂糖珠偶連；

（5）免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C以3,000rpm速度離心3min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；

（6）SDS,Westernblotting或質(zhì)譜儀分析。第九十三頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日優(yōu)缺點優(yōu)點為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點為：（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；（3）必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性。

第九十四頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日GSTpull-downassay與Co-immumoprecipitation聯(lián)合應(yīng)用舉例第九十五頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日（三）酵母雙雜交技術(shù)（yeasttwo-hybridsystem）酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得到。它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。

該技術(shù)既可用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用。第九十六頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日1989年美國紐約州立大學(xué)的Fields和Song首先描述了酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem)。該系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。真核生物基因轉(zhuǎn)錄需要反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，真核生物轉(zhuǎn)錄因子含有兩個不同的結(jié)構(gòu)域：轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNAbindingdomain)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)(activationdomain)1酵母雙雜交系統(tǒng)的建立第九十七頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響,單獨存在時沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者通過共價或非共價鍵連接建立起來的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個完整的激活特定基因表達的激活因子的功能。第九十八頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日Gal4為酵母半乳糖苷酶基因gal1的轉(zhuǎn)錄激活因子，天然的Gal4分子是由一條由881個氨基酸殘基組成的多肽鏈。兩個結(jié)構(gòu)域中的DNA-BD由位于N-末端的1～147位多肽構(gòu)成，能識別位于Gal4效應(yīng)基因的上游激活序列(upstreamactivationsequence，UAS)。此外，在其N-端還具有一段核定位序列。AD由位于C-末端的768～881位多肽構(gòu)成。

當Gal4的兩個結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要它們在空間上充分接近，則能恢復(fù)Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。第九十九頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日Fields和Song將兩個融合蛋白分別構(gòu)建在穿梭質(zhì)粒上，一個是將Gal4的DNA-BD與酵母蛋白SNF1融合；另一個是將Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。其中，SNF1是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一個結(jié)合蛋白，這兩種蛋白是已知可以相互作用的。第一百頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日當兩種穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有Gal4結(jié)合位點的報告基因LacZ的酵母菌株后，通過SNFl與SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD與Gal4的AD靠近,形成一個大的復(fù)合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。Gal4的DNA-BD可識別位于Gal4效應(yīng)基因的UAS，并可與之結(jié)合；Gal4的AD則可與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中其他成分結(jié)合，激活UAS下游報告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄。第一百零一頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日酵母轉(zhuǎn)錄因子（Gal4）與BD-fusion

誘餌（bait）與AD-fusion

獵物或靶蛋白（preyortargetprotein）報告基因（reportergene）

LacZ（編碼β-半乳糖苷酶）第一百零二頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日2酵母雙雜交系統(tǒng)的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterlacZreportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZreportergeneGAL4UASPromoterlacZreportergeneXDNA-BDX-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的顯色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下會產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，所以可以輕易的檢測出LacZ基因的表達。

第一百零三頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日第一百零四頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日

表達“誘餌”和“獵物”蛋白；檢驗這兩種蛋白表達后能否激活酵母中的報告基因。3酵母雙雜交系統(tǒng)的基本策略第一百零五頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日4酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點（1）高敏感性①采用高拷貝和強啟動子的表達載體，使融合蛋白過量表達；②激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，之后又與啟動子結(jié)合，此三元復(fù)合體使融合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定；③通過mRNA使信號放大；④檢測的結(jié)果是基因表達產(chǎn)物的累積效應(yīng)，可檢測存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時的相互作用。第一百零六頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日（2）真實性檢測在活細胞內(nèi)進行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細胞內(nèi)的真實情況。（3）簡潔性融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。（4）廣泛性采用不同組織器官細胞類型和分化時期的材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析不同亞細胞部位和功能的蛋白質(zhì)，適用于部分細胞質(zhì)、細胞核及膜結(jié)合蛋白。第一百零七頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日

分析已知蛋白之間的相互作用對蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測蛋白質(zhì)進行點突變或缺失突變再進行雙雜交。

用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白。分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫，再根據(jù)篩的已知基因推測新基因功能。繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜在藥物設(shè)計中的應(yīng)用5酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀第一百零八頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日例如：利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì)將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-文庫載體，并從載體中進一步克隆得到隨機插入的cDNA片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。

第一百零九頁，共一百二十三頁，2022年，8月28日電泳遷移率變動測定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或稱凝膠遷移變動實驗(gelshiftassay)