蛋白質(zhì)純化技術(shù)Lite

分子生物學(xué)圣經(jīng)—分子克隆實(shí)驗指南當(dāng)前1頁，總共81頁。為什么要純化蛋白質(zhì)？理論意義：深入研究某種蛋白質(zhì)的功能以及作用機(jī)制，如信號通路中的蛋白質(zhì)…應(yīng)用價值蛋白質(zhì)工程醫(yī)藥、工業(yè)、科研…作為藥物靶點(diǎn)…蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行者當(dāng)前2頁，總共81頁。蛋白質(zhì)工程中進(jìn)行蛋白質(zhì)純化的必要性首先，需要單一的蛋白質(zhì)作為實(shí)驗材料，研究其結(jié)構(gòu)與功能；其次，對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾改造時需要單一的蛋白質(zhì)作為原材料；最后，為了生產(chǎn)性能更優(yōu)良的蛋白質(zhì)，需要對設(shè)計改造過的蛋白質(zhì)進(jìn)行大量純化，從而開發(fā)出相關(guān)產(chǎn)品。當(dāng)前3頁，總共81頁。本章概要蛋白質(zhì)純化方法蛋白質(zhì)純化原則純化步驟蛋白質(zhì)的鑒定當(dāng)前4頁，總共81頁。一、蛋白純化方法蛋白質(zhì)純化的根據(jù)：

不同的蛋白質(zhì)，理化性質(zhì)不同。理化性質(zhì)不同的原因：氨基酸的數(shù)目和序列不同。當(dāng)前5頁，總共81頁。1.與蛋白質(zhì)分離純化相關(guān)的理化特性①分子大?、诜肿有螤睥蹘щ娞匦寓苋芙馓匦寓菖c配體特異性結(jié)合不同⑥吸附性質(zhì)⑦變性和復(fù)性當(dāng)前6頁，總共81頁。1.1分子大小蛋白質(zhì)分子大小主要取決于：

蛋白質(zhì)肽鏈的數(shù)目每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目。幾百~百萬Da常用方法透析超濾凝膠過濾離心當(dāng)前7頁，總共81頁。

透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。當(dāng)前8頁，總共81頁。當(dāng)前9頁，總共81頁。

超濾法

應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。當(dāng)前10頁，總共81頁。

超濾法

應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。當(dāng)前11頁，總共81頁。凝膠過濾是按照天然蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，又稱為分子篩層析或排阻層析。當(dāng)前12頁，總共81頁。當(dāng)前13頁，總共81頁。超速離心離心（centrifugation）：利用機(jī)械的快速旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，將不同密度的物質(zhì)分離開來的方法。超速離心法(ultracentrifugation)：~60萬g，6萬~8萬r/min。可用來測定蛋白質(zhì)分子量。當(dāng)前14頁，總共81頁。超速離心當(dāng)前15頁，總共81頁。1.2分子形狀形狀蛋白質(zhì)在離心通過溶液時，或通過膜、凝膠過濾填料顆?；螂娪灸z中時，都會受到分子形狀的影響。方法梯度離心電泳當(dāng)前16頁，總共81頁。1.3電荷原理蛋白質(zhì)的凈電荷與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pI以及環(huán)境pH值有關(guān)（pH>pI，－）方法電泳離子交換層析當(dāng)前17頁，總共81頁。當(dāng)前18頁，總共81頁。1.4溶解度原理蛋白質(zhì)分子表面親水性和疏水性帶電基團(tuán)不同，因此在溶劑中的溶解度不同。通過改變pH、離子強(qiáng)度或加入有機(jī)試劑，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的凝聚進(jìn)而形成沉淀。方法：沉淀法鹽析法（eg.硫酸銨）有機(jī)溶劑沉淀法（eg.丙酮）等電點(diǎn)沉淀法當(dāng)前19頁，總共81頁。蛋白質(zhì)在高濃度中性鹽溶液中會沉淀析出，稱為鹽析。鹽析原理：高濃度鹽離子破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化膜，影響蛋白質(zhì)分子表面所帶電荷，從而引起蛋白質(zhì)沉淀，但通常不會引起蛋白質(zhì)的變性。鹽析法當(dāng)前20頁，總共81頁。1.5配體特異性結(jié)合原理生物大分子的某些特定結(jié)構(gòu)區(qū)域能夠特異性識別其他分子并可逆結(jié)合，生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。方法將具有親和力的兩個分子中的一個固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性對另一個分子進(jìn)行分離純化。分類免疫親和層析生物親和層析金屬螯合親和層析當(dāng)前21頁，總共81頁。1.6吸附性質(zhì)原理

蛋白質(zhì)可吸附在不同材料的表面，如金屬、陶瓷、塑料等。方法疏水層析當(dāng)前22頁，總共81頁。1.7變性和復(fù)性原理變性：蛋白質(zhì)在一定的理化條件下會失去原有的空間結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及部分理化特性。復(fù)性：當(dāng)變性條件去除后恢復(fù)原有的空間結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能。方法如，利用尿素的變性和復(fù)性方法，從包涵體中純化原核表達(dá)蛋白當(dāng)前23頁，總共81頁。2.分離方法在實(shí)驗操作上，分為：沉淀法離心法電泳法超濾法相分配法層析法當(dāng)前24頁，總共81頁。當(dāng)前25頁，總共81頁。*不可能有一套統(tǒng)一的方法適用于分離純化所有的蛋白質(zhì)，*但每一種蛋白質(zhì)可能都有一套適合的分離純化程序，*而且所用的主要技術(shù)手段都基本相同。Note當(dāng)前26頁，總共81頁。二、蛋白質(zhì)純化的總原則和純化步驟總原則以合理的效率、速度、收率和純度，將目標(biāo)蛋白從細(xì)胞的全部其他成分，特別是從雜蛋白中分離出來，同時仍保留其生物學(xué)活性和化學(xué)完整性。當(dāng)前27頁，總共81頁。二、蛋白質(zhì)純化的總原則和純化步驟步驟選擇實(shí)驗材料，實(shí)驗材料預(yù)處理蛋白質(zhì)的提取蛋白質(zhì)的粗分級蛋白質(zhì)的細(xì)分級蛋白質(zhì)的鑒定當(dāng)前28頁，總共81頁。蛋白質(zhì)純化的前期準(zhǔn)備關(guān)于蛋白質(zhì)我們已知什么？最好的來源？蛋白質(zhì)純度要求？活性要求？純化蛋白的量？如何進(jìn)行鑒定？純化時間長短？最終花費(fèi)？純化方案？當(dāng)前29頁，總共81頁。1、選擇實(shí)驗材料及預(yù)處理選擇實(shí)驗材料物種的選擇組織的選擇實(shí)驗材料預(yù)處理液體材料過濾離心固體材料洗滌：自來水—蒸餾水—提取緩沖液材料破碎：當(dāng)前30頁，總共81頁。材料破碎機(jī)械剪碎研磨反復(fù)凍融法超聲破碎法高壓勻漿法酶解法當(dāng)前31頁，總共81頁。2、蛋白質(zhì)的提取①提取分離原則盡可能多地提取目的蛋白，同時避免活性丟失（溫度過高、pH、有機(jī)試劑、金屬離子、蛋白酶等因素）選擇合適的pH、選擇合適的離子強(qiáng)度當(dāng)前32頁，總共81頁。2、蛋白質(zhì)的提?、谔崛∫撼煞值拇_定pH緩沖液：Tris-HCl,Tris-Gly,Gly-HCl,檸檬酸-檸檬酸鈉…離子：動物NaCl,植物KCl還原劑:DTT…蛋白酶抑制劑：EDTA,PMSF…金屬離子螯合劑:EDTA,EGTA…去污劑:SDS,CHAPS,TritonX-100,Tween-20甘油③溫度0~4℃當(dāng)前33頁，總共81頁。3、蛋白質(zhì)的粗分級（粗提）使用蛋白質(zhì)提取緩沖液提取實(shí)驗材料后，蛋白提取液中目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度往往較低，采取一些簡單的方法使目標(biāo)蛋白質(zhì)濃縮，同時去除大量的雜質(zhì)。常用的實(shí)驗技術(shù)：沉淀法（鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀）、超速離心、透析、超濾…當(dāng)前34頁，總共81頁。4、蛋白質(zhì)的細(xì)分級粗分級只是使蛋白質(zhì)得到濃縮和初步分離純化，多數(shù)情況下還要根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、分子形狀、分子表面特征或分子帶電狀況進(jìn)一步純化。常用的實(shí)驗技術(shù)：層析當(dāng)前35頁，總共81頁。4.1.層析（chromatography）固定相：凝膠流動相：緩沖液原理：當(dāng)前36頁，總共81頁。凝膠介質(zhì)PharmaciaBioGelAagaroseBioGelPacrylamideBio-RadSephadexglucose(dextrose)SepharoseagaroseSephacrylglucose+acrylamideSephacelcellulose當(dāng)前37頁，總共81頁。

層析裝置（Chromatographicequipment）蠕動泵層析柱檢測器記錄儀部分收集器當(dāng)前38頁，總共81頁。①②③當(dāng)前39頁，總共81頁。當(dāng)前40頁，總共81頁。4.1.層析（chromatography）分子篩層析（Gelfiltration）離子交換層析（Ionexchange）疏水作用層析（Hydrophobicinteraction）親和層析（Affinity）當(dāng)前41頁，總共81頁。4.1.1分子篩層析（Gelfiltration）原理也稱為凝膠過濾、排阻層析。是以多孔凝膠材料為支持物，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液流經(jīng)此支持物時，分子大小不同的蛋白質(zhì)所受到的阻滯作用不同而先后流出，從而達(dá)到分離純化的目的。凝膠介質(zhì)葡聚糖（glucose）瓊脂糖（agarose）聚丙烯酰胺（acrylamide）纖維素（cellulose）當(dāng)前42頁，總共81頁。分子篩層析

GelfiltrationchromatographyHydrophilicNospontaneousbindingtoproteins.ChemicallyandphysicallystableRigidtoallowahighlinearflow-rate親水對蛋白質(zhì)親和力低物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定流速穩(wěn)定當(dāng)前43頁，總共81頁。分子篩層析

Gelfiltrationchromatography當(dāng)前44頁，總共81頁。分子篩層析

Gelfiltrationchromatography>>當(dāng)前45頁，總共81頁。分子篩層析

Gelfiltrationchromatography>>當(dāng)前46頁，總共81頁。4.1.2離子交換層析（Ionexchange）原理在一定的pH條件下，不同的蛋白質(zhì)帶有的電荷的種類和數(shù)量不同，因此它們與帶電的凝膠顆粒間的電荷相互作用不同。利用蛋白質(zhì)和帶電凝膠之間作用力的差別，把蛋白質(zhì)分開的層析方法。當(dāng)前47頁，總共81頁。4.1.2離子交換層析（Ionexchange）種類陽離子交換柱：凝膠帶負(fù)電荷，蛋白質(zhì)帶正電荷陰離子交換柱：凝膠帶正電荷，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷介質(zhì)惰性支持物：瓊脂糖，葡聚糖…帶電基團(tuán)：羧甲基—帶負(fù)電；二乙基氨基—帶正電平衡離子：負(fù)電基團(tuán)：H+或Na+

正電基團(tuán)：OH-或Cl-當(dāng)前48頁，總共81頁。離子交換層析（Ionexchange）陽離子交換：陰離子先，陽離子后陰離子交換：陽離子先，陰離子后當(dāng)前49頁，總共81頁。4.1.3親和層析（Affinitychromatography）原理利用蛋白質(zhì)與配體專一性識別并結(jié)合的特性而分離蛋白質(zhì)的一種層析方法。將配體固定于支持物上，當(dāng)混合樣品流過此支持物時，只有目標(biāo)蛋白能與配體專一性結(jié)合。先用緩沖液洗脫雜蛋白，然后改變洗脫條件，將目標(biāo)蛋白洗脫下來。當(dāng)前50頁，總共81頁。親和層析（Affinitychromatography）當(dāng)前51頁，總共81頁。His-親合示意圖（金屬螯合層析）固相載體鎳柱（Ni-NTA）PETexpressionsystem當(dāng)前52頁，總共81頁。4.1.4疏水作用層析原理蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)與介質(zhì)疏水配體的可逆相互作用方法高離子強(qiáng)度下待分離的樣品吸附在疏水介質(zhì)上，然后降低離子強(qiáng)度選擇性將樣品解吸，疏水弱的物質(zhì)先洗脫，疏水強(qiáng)的物質(zhì)后洗脫。當(dāng)前53頁，總共81頁。4.2.電泳（Electrophoresis

）電泳就是帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動。當(dāng)前54頁，總共81頁。蛋白質(zhì)常用電泳技術(shù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）等電聚焦電泳（Isoelectricfocusing-IEF）雙向電泳（TwoDimensionalElectrophoresis

）當(dāng)前55頁，總共81頁。4.2.1SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS：1、覆蓋蛋白質(zhì)表面電荷，消除電荷差異2、改變蛋白質(zhì)分子構(gòu)象，消除形狀差異當(dāng)前56頁，總共81頁。電泳法測目標(biāo)蛋白的分子量當(dāng)前57頁，總共81頁。不連續(xù)PAGE分離蛋白質(zhì)的原理在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，所帶電荷、分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)在凝膠中能夠被分離。原理電荷效應(yīng)濃縮效應(yīng)快慢離子效應(yīng)凝膠濃度差效應(yīng)分子篩效應(yīng)當(dāng)前58頁，總共81頁。4.2.3等電聚焦電泳（Isoelectricfocusing—IEF）當(dāng)前59頁，總共81頁。等電聚焦（Isoelectricfocusing）當(dāng)前60頁，總共81頁。4.2.4雙向電泳第一向：等電聚焦（pI）第二向：SDS(MW)雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中蛋白質(zhì)多肽鏈分離純化和鑒定的主要實(shí)驗技術(shù)之一。當(dāng)前61頁，總共81頁。①Isoelectricfocusing②SDSgelelectrophoresis當(dāng)前62頁，總共81頁。TwoDimensionalElectrophoresisofE.coliProteins

-morethan2,000proteinswerevisualized當(dāng)前63頁，總共81頁。蛋白質(zhì)純化策略方案設(shè)計篇

Proteinpurificationstrategy當(dāng)前64頁，總共81頁。三、純化方案設(shè)計原則確定純化目標(biāo)purity,activityandquantity充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation確定活性測定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants盡量減少純化步驟extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically當(dāng)前65頁，總共81頁。確定純化目標(biāo)當(dāng)前66頁，總共81頁。三、純化方案設(shè)計原則確定目標(biāo)purity,activityandquantity充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation確定活性測定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants盡量減少純化步驟extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically當(dāng)前67頁，總共81頁。三、純化方案設(shè)計原則確定目標(biāo)purity,activityandquantity充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation確定活性測定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants盡量減少純化步驟extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically當(dāng)前68頁，總共81頁。嚴(yán)格依據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特殊生物學(xué)性質(zhì)，來設(shè)計活性檢測方案常見檢測方法:酶學(xué)檢測enzymaticassays.配體檢測ligand-bindingassays免疫檢測immunologicalassays活性測定方法的要求：快速、簡便、特異和定量確定活性檢測方法當(dāng)前69頁，總共81頁。三、純化方案設(shè)計原則確定目標(biāo)purity,activityandquantity充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation確定活性測定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants盡量減少純化步驟extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically當(dāng)前70頁，總共81頁。盡量減少純化步驟純化步驟越多，樣品損失越大（產(chǎn)量、活性）當(dāng)前71頁，總共81頁。減少每步操作時間toavoidlengthyprocedureswhichrisklosingactivity/reducingrecovery減少添加物additivesmayneedtoberemovedinanextrapurificationstepormayinterferewithactivityassays早期除去降解物（如蛋白酶）forexample,proteases每步使用不同的純化方法totakeadvantageofsamplecharacteristicswhichcanbe