血液分子生物學(xué)癌干細(xì)胞和造血干細(xì)胞

◆惡性腫瘤具有無限增殖和侵襲性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為腫瘤形成是所有腫瘤細(xì)胞共同增殖的結(jié)果。◆然而，在白血病的研究中發(fā)現(xiàn)，白血病的形成和發(fā)展與正常造血系統(tǒng)有極大的相似之處（1997年JohnDick等定義了第一個(gè)腫瘤干細(xì)胞，急性髓細(xì)胞性白血?。ˋML)的白血病干細(xì)胞），由此提出了腫瘤形成的新模式——癌干細(xì)胞學(xué)說。為腫瘤發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)提供了一條新思路當(dāng)前1頁，總共46頁。

癌干細(xì)胞——在腫瘤中的一小部分具有無限增殖能力，并形成腫瘤能力的細(xì)胞，也稱腫瘤干細(xì)胞。癌干細(xì)胞

癌干細(xì)胞在癌組織中所占的比例很少，具有形成能力是癌干細(xì)胞的本質(zhì)特征。目前已經(jīng)在乳腺癌，腦瘤等實(shí)體瘤以及血液系統(tǒng)腫瘤中發(fā)現(xiàn)了癌干細(xì)胞。鑒定癌干細(xì)胞的方法通常是首先通過分子標(biāo)志將腫瘤細(xì)胞懸液用流式細(xì)胞儀分選為若干亞群，然后將不同的細(xì)胞亞群移植到裸鼠的體內(nèi)觀察其成瘤性，癌干細(xì)胞就存在于具有成瘤性的細(xì)胞亞群中。當(dāng)前2頁，總共46頁。

癌干細(xì)胞的特點(diǎn)自我更新性

是指一個(gè)細(xì)胞分裂為兩個(gè)細(xì)胞，但其中一個(gè)子代細(xì)胞仍然保持與親代細(xì)胞完全相同的未分化狀態(tài)；而另一個(gè)細(xì)胞則定向分化，這種分裂稱為不對(duì)稱分裂。癌干細(xì)胞通過自我更新維持著腫瘤的持續(xù)生長(zhǎng)。癌干細(xì)胞積累了所在腫瘤的基因突變，正是這些基因突變導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞的過度增殖，乃至轉(zhuǎn)移播散。.當(dāng)前3頁，總共46頁。當(dāng)前4頁，總共46頁。

2.高致瘤性

癌干細(xì)胞的致瘤性因腫瘤種類不同差別較大，主要從兩個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)：一是癌干細(xì)胞在體外克隆形成的能力;二是癌干細(xì)胞在免疫缺陷細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤形成。當(dāng)前5頁，總共46頁。

3.分化潛能具有多向分化潛能，能夠重建相應(yīng)組織所有的細(xì)胞成分。腫瘤干細(xì)胞能夠形成缺乏自我更新能力但具有分裂能力的子代細(xì)胞。腫瘤不能分化正常的成熟細(xì)胞，但能發(fā)生不同程度的有限的分化，從而形成組織病變學(xué)各異的腫瘤。當(dāng)前6頁，總共46頁。4.耐藥性

癌干細(xì)胞表達(dá)多種抗藥性蛋白，對(duì)許多化療藥物具有抗性，是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因。失敗當(dāng)前7頁，總共46頁。癌干細(xì)胞與干細(xì)胞的共性與區(qū)別共性1.都具有自我更新和增殖能力，但腫瘤干細(xì)胞不受正常機(jī)體內(nèi)環(huán)境的調(diào)控；2.都具有不同的表型和異質(zhì)性干細(xì)胞表面的特殊表型用于調(diào)控自身增殖和周圍細(xì)胞分化的功能；癌干細(xì)胞亞型不同，其生長(zhǎng)分化能力、侵襲能力和耐藥性也不同。當(dāng)前8頁，總共46頁。3.

相似的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，都具有端粒酶活性，在正常干細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，端粒酶活性和基因突變是正常干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的兩個(gè)必要條件。4.都具有多分化潛能,Gao等研究發(fā)現(xiàn)，CSC具有比腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的產(chǎn)生血管生成因子的能力，可促進(jìn)形成血管。提出CSC可能是導(dǎo)致抗腫瘤血管生成治療困難的一個(gè)原因。5.

有相似的表面標(biāo)志物，如造血干細(xì)胞和白血病細(xì)胞都表達(dá)CD34和CD90當(dāng)前9頁，總共46頁。CSC與干細(xì)胞區(qū)別：①CSC的自我更新信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)反饋機(jī)制已破壞。②缺乏分化成熟能力。

③傾向于累積復(fù)制的錯(cuò)誤，而干細(xì)胞能夠防止復(fù)制錯(cuò)誤的發(fā)展等。當(dāng)前10頁，總共46頁。新治療策略當(dāng)前11頁，總共46頁。治療思路1.削弱增殖能力2.促進(jìn)分化3.破壞微環(huán)境4.誘導(dǎo)凋亡5.增加對(duì)放療和化療的敏感性當(dāng)前12頁，總共46頁。抑制癌干細(xì)胞信號(hào)通路和相關(guān)酶的活性，削弱增殖能力。當(dāng)前13頁，總共46頁。誘導(dǎo)癌干細(xì)胞分化，消耗其分裂潛能，達(dá)到抑制腫瘤發(fā)展的目的。當(dāng)前14頁，總共46頁。破壞為癌干細(xì)胞提供養(yǎng)分和保護(hù)的微環(huán)境，抑制增殖和成瘤的能力。當(dāng)前15頁，總共46頁。用靶向性病毒載體攜帶促凋亡基因誘導(dǎo)癌干細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序，達(dá)到清除目的。當(dāng)前16頁，總共46頁。抑制抗性相關(guān)蛋白的表達(dá)，增加對(duì)放療和化療的敏感性，提高放化療的有效率。當(dāng)前17頁，總共46頁。癌干細(xì)胞的來源？癌干細(xì)胞是正常的成體干細(xì)胞甚至體細(xì)胞基因突變所致？

癌干細(xì)胞主要來源于細(xì)胞融合。

癌干細(xì)胞起源與病毒有關(guān)。

癌干細(xì)胞起源于殘留的靜止的胚胎干細(xì)胞。

尚未解決的科學(xué)問題當(dāng)前18頁，總共46頁。造血干細(xì)胞

一、造血干細(xì)胞的起源*造血干細(xì)胞（hemopoieticstemcell,HSC）是存在于造血組織和血液中的一群原始造血細(xì)胞，它不是組織固定細(xì)胞.*造血干細(xì)胞在人胚胎2周時(shí)可出現(xiàn)于卵黃囊.*第4周開始轉(zhuǎn)移至胚肝.*妊娠5個(gè)月后，骨髓開始造血.*出生后骨髓成為干細(xì)胞的主要來源.*在造血組織中，所占比例甚少，如在小鼠骨髓中105細(xì)胞中有10個(gè)，在脾中105細(xì)胞中只有0.2個(gè).當(dāng)前19頁，總共46頁。二、造血干細(xì)胞的形態(tài)干細(xì)胞是一種嗜堿性獨(dú)核細(xì)胞，其大小約為8μm，呈圓形，胞核為圓形或腎形，胞核較大，具有2個(gè)核仁，染色質(zhì)細(xì)而分散，胞漿呈淺藍(lán)色不帶顆粒，在形態(tài)上與小淋巴細(xì)胞極其相似，很難用形態(tài)學(xué)識(shí)別干細(xì)胞，較難與其它細(xì)胞相區(qū)別。造血干細(xì)胞可包括三級(jí)分化水平，即多能干細(xì)胞（pleuripotentstemcell），定向干細(xì)胞（Committedstemcell）及其成熟的子代細(xì)胞。

當(dāng)前20頁，總共46頁。造血干細(xì)胞生物學(xué)特征自我更新能力

多向分化能力靜止性不均一性（異質(zhì)性）

當(dāng)前21頁，總共46頁。

■造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志造血組織中造血干細(xì)胞的比例極低,數(shù)量極少且形態(tài)上無法與其他細(xì)胞相區(qū)別,故對(duì)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記的認(rèn)識(shí),有助于造血干細(xì)胞的分離、純化和研究。

近年來由于單克隆抗體技術(shù)的進(jìn)步，流式細(xì)胞儀（FACS）的應(yīng)用，以及對(duì)小鼠和人造血干細(xì)胞表面標(biāo)志的研究，取得了很大進(jìn)展，為造血細(xì)胞的分離純化及鑒定創(chuàng)造了條件。當(dāng)前22頁，總共46頁。CD34+*是原始造血干細(xì)胞的一種重要標(biāo)志。*CD34+細(xì)胞群,在體外與造血因子共同培養(yǎng),可獲得含各類血細(xì)胞的混合集落,由此證明骨髓中CD34+細(xì)胞為原始造血干細(xì)胞。*CD34+細(xì)胞占骨髓細(xì)胞的1%-4%。*在臍血,CD34+細(xì)胞占0.01%-0.09%。*隨著造血干細(xì)胞分化成熟,其表面CD34表達(dá)水平逐漸下降,成熟血細(xì)胞不表達(dá)CD34。

當(dāng)前23頁，總共46頁。單克隆CD34-細(xì)胞可重建所有的造血細(xì)胞系。CD34+細(xì)胞和CD34-細(xì)胞之間的關(guān)系為,二者可相互轉(zhuǎn)換,形成“干細(xì)胞循環(huán)”。IL-6可促進(jìn)CD34-細(xì)胞增殖,還能使CD34+細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為CD34-細(xì)胞,而SCF又可使CD34-細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD34+細(xì)胞。

此兩類細(xì)胞均可存在于骨髓或外周血中。目前認(rèn)為,最早期的HSC可能是CD34-細(xì)胞,其分化為CD34+HSC細(xì)胞,然后分化為造血祖細(xì)胞。

x當(dāng)前24頁，總共46頁。CD34+細(xì)胞選擇法親和柱層析，分離和免疫磁珠法。通過特異性識(shí)別、俘獲及洗脫分離得到CD34+細(xì)胞。（1）親和柱層析:將預(yù)分選的細(xì)胞與生物素化（biotinglated）的抗CD34抗原的單抗一起孵育，然后洗去未結(jié)合的抗體，通過抗生物素蛋白包被的聚丙酰胺柱的親和柱，使CD34+細(xì)胞留滯在柱內(nèi)的聚丙酰胺表面上，再經(jīng)機(jī)械搖動(dòng)，沖洗出CD34+細(xì)胞。

當(dāng)前25頁，總共46頁。（2）免疫磁珠分離法：CD34單抗標(biāo)記細(xì)胞后，與超順磁性微球連接、通過強(qiáng)磁場(chǎng)中的過濾柱時(shí)，陽性細(xì)胞被吸附，陰性細(xì)胞被濾掉。已研制出了納米微粒作為固相收集CD34+細(xì)胞。通過將采集物與抗CD34抗原的單抗結(jié)合，細(xì)胞特異地被超順磁鐵－葡聚糖納米（直徑50nm）微球結(jié)合，使CD34+細(xì)胞與納米微球形成復(fù)合物，再通過磁鐵誘導(dǎo)的強(qiáng)磁場(chǎng)過濾柱，分離出CD34+細(xì)胞。其CD34+細(xì)胞回收純度＞95％。當(dāng)前26頁，總共46頁。CD117+（Kit）干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（SCFR）。CD117+細(xì)胞占骨髓的1%-4%。50%-70%的CD117+骨髓細(xì)胞表達(dá)CD34。SCF通過與CD117結(jié)合發(fā)揮促進(jìn)HSC增殖分化的作用。在最早期的造血細(xì)胞表面,CD117密度較低。隨著分化發(fā)育而密度逐漸增加,至祖細(xì)胞階段CD117密度達(dá)最高。隨著向終未成熟血細(xì)胞分化,CD117表達(dá)又逐漸下降。

當(dāng)前27頁，總共46頁。CD38:也是干細(xì)胞的分化標(biāo)志之一。CD34+細(xì)胞可分為CD34+CD38-和CD34+CD38+兩個(gè)亞群,前者更為原始。CD38的表達(dá)可用于判斷HSC的分化程度，也可用于分離HSC。Thy-1＋(low)。其他譜系特征型標(biāo)志:HSC不表達(dá)CD3、CD4、CD14、CD16……、CD19、CD41等表面標(biāo)志，屬于譜系陰性（Lin-）細(xì)胞，據(jù)此可鑒別和分離HSC。當(dāng)前28頁，總共46頁。臍血來源干細(xì)胞的特點(diǎn)HSC主要來源于骨髓、成人外周血、臍血。臍血有如下特點(diǎn)：造血干細(xì)胞含量豐富，雖然CD34＋細(xì)胞數(shù)低于骨髓，但CD34＋CD38-細(xì)胞數(shù)高于骨髓，且臍血CD34＋CD38-細(xì)胞增殖分化能力高于骨髓，尤其是加入各種細(xì)胞因子后CFU-GEMM、BFU-E集落數(shù)明顯高于骨髓。淋巴系統(tǒng)抗原表達(dá)弱，淋巴細(xì)胞功能不成熟，這顯示出臍血干細(xì)胞移植(UCBT)后移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率可能較低。研究表明凍存10年的臍血HSC仍具有良好的回收率。當(dāng)前29頁，總共46頁。骨髓干細(xì)胞

造血干細(xì)胞

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞

多能前體細(xì)胞

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞：缺乏特異的表面標(biāo)記物,目前報(bào)告的基質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原有Stro1,CD13,CD49,CD29,CD44,CD71,CD90,CD106和CD124.由于缺乏特異的表面標(biāo)記物,在不同的實(shí)驗(yàn)室有不同的技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分離.獲得的細(xì)胞功能一致性有待研究,因此對(duì)其多能性有不同的發(fā)現(xiàn),如一些報(bào)告認(rèn)為基質(zhì)干細(xì)胞在體外能分化為神經(jīng)細(xì)胞,而有的試驗(yàn)則認(rèn)為不能分化為神經(jīng)細(xì)胞.

當(dāng)前30頁，總共46頁。骨髓干細(xì)胞

造血干細(xì)胞

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞

多能前體細(xì)胞

多能前體細(xì)胞：多能前體細(xì)胞能夠在小鼠、大鼠及人的骨髓或其他組織細(xì)胞培養(yǎng)中獲得.和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞一樣,它在體外貼壁生長(zhǎng),但是和基質(zhì)干細(xì)胞不同的是,多能前體細(xì)胞在體外在相對(duì)差的營(yíng)養(yǎng)條件下無限期地生長(zhǎng)。在體外,特異性的生長(zhǎng)因子能夠誘導(dǎo)多能前體細(xì)胞分化為外中內(nèi)各胚層細(xì)胞,在體內(nèi),多能前體細(xì)胞也顯示了其廣泛的分化潛能.

當(dāng)前31頁，總共46頁。骨髓干細(xì)胞的可塑性

造血干細(xì)胞不僅能重建造血細(xì)胞,而且能分化心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、消化道上皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞等。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在恰當(dāng)?shù)拇碳は履苻D(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、星形細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。骨髓多能前體細(xì)胞,其表達(dá)胚胎干細(xì)胞的遺傳標(biāo)志,體外培養(yǎng)條件類似于胚胎干細(xì)胞,且能高度擴(kuò)增。在體外它不僅能分化成基質(zhì)細(xì)胞,而且能分化為內(nèi)臟中胚層、神經(jīng)外胚層細(xì)胞和肝細(xì)胞等內(nèi)胚層細(xì)胞。

當(dāng)前32頁，總共46頁。骨髓干細(xì)胞可塑性機(jī)制

局部環(huán)境有關(guān):①對(duì)造血系統(tǒng)被破壞的小鼠進(jìn)行肌細(xì)胞移植后,小鼠造血功能恢復(fù),是由于肌肉組織內(nèi)的造血干細(xì)胞的作用引起。②肝損害的小鼠進(jìn)行骨髓移植后,肝臟再生的原因是骨髓中的卵圓細(xì)胞在肝內(nèi)轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞。成體許多組織內(nèi)余存一種稀有數(shù)量的原始干細(xì)胞,其類似于胚胎干細(xì)胞,始終保持著胚胎干細(xì)胞的特性,在不同的條件刺激下能分化為內(nèi)胚層、中胚層、外胚層多種組織細(xì)胞.當(dāng)前33頁，總共46頁。骨髓干細(xì)胞可塑性機(jī)制干細(xì)胞可以經(jīng)歷轉(zhuǎn)分化的過程,細(xì)胞的基因信息可以重組,經(jīng)過基因重組,細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)化為多種不同的細(xì)胞。如從視網(wǎng)膜中提取少突膠質(zhì)細(xì)胞,在體外無血清,低密度的培養(yǎng)條件下,獲得神經(jīng)干細(xì)胞的功能和特征。細(xì)胞融合是最近對(duì)干細(xì)胞可塑性的又一種解釋。如將小鼠骨髓干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞,或小鼠神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞共培養(yǎng)后,獲得的融合細(xì)胞表現(xiàn)胚胎干細(xì)胞的功能和特征.

當(dāng)前34頁，總共46頁。造血干細(xì)胞移植概況

自1993年以來，自體外周血干細(xì)胞移植（autologousperipheralbloodstemcelltransplantation;APBSCT）的數(shù)量超過了自體骨髓移植（ABMT）。近幾年，隨著對(duì)臍血研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)人類臍血中含有大量的造血干/祖細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞抗原性弱，功能相對(duì)不成熟，移植后發(fā)生急性移植物抗宿主?。℅VHD）的危險(xiǎn)性低等，已成為造血干細(xì)胞移植的又一方法，即臍血干細(xì)胞移植（cordbloodstemcelltransplantation,CBSCT）。當(dāng)前35頁，總共46頁。造血干細(xì)胞移植種類及特點(diǎn)

一、移植種類（一）根據(jù)造血干細(xì)胞來源分類

1、骨髓移植（bonemarrowtransplantation,BMT）.

2、外周血干細(xì)胞（peripheralbloodstemcelltransplantation,PBSCT）。

3、臍血干細(xì)胞移植（cordbloodstemcelltransplantation,CBSCT）。（二）根據(jù)供者來源不同分類

1、同基因造血干細(xì)胞移植（syngeneicHSCT,syn–HSCT）。

2、異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneicHSCT,allo–HSCT）。

3、自體造血干細(xì)胞移植（autologousHSCT,AHSCT）.

當(dāng)前36頁，總共46頁。造血干細(xì)胞移植種類及特點(diǎn)（三）二者結(jié)合分類

1、同基因骨髓移植（Syn–BMT）

2、同基因外周血干細(xì)胞移植（Syn–PBSCT）

3、異基因骨髓移植（allo–BMT）

4、異基因外周血干細(xì)胞移植（allo–PBSCT）

5、自體骨髓移植（ABMT）

6、自體外周血干細(xì)胞移植（APBSCT）

7、臍血干細(xì)胞移植（CBSCT）（四）根據(jù)預(yù)處理強(qiáng)度分

1、清髓性異基因造血干細(xì)胞移植

2、非清髓性異基因造血干細(xì)胞移植

當(dāng)前37頁，總共46頁。造血干細(xì)胞移植種類及特點(diǎn)二、各類造血干細(xì)胞移植特點(diǎn)（一）同基因造血干細(xì)胞移植

1、供者為同卵孿生同胞，不存在HLA（humanleukocyteantigen）差異。

2、易于植入，不存在排斥及移植物抗宿主病（GVHD），亦無移植物抗白血病效應(yīng)（GVL）。

3、不需進(jìn)行移植細(xì)胞的體外凈化。

4、移植并發(fā)癥較少，安全性高，移植費(fèi)用較低。

5、移植后惡性疾病復(fù)發(fā)率較異基因造血干細(xì)胞移植為高。

6、移植適應(yīng)癥較廣泛。

當(dāng)前38頁，總共46頁。造血干細(xì)胞移植種類及特點(diǎn)（二）異基因造血干細(xì)胞移植

1、需要有HLA相同的同胞或非血緣關(guān)系志愿者作為供者，理論上同胞兄妹間有1/4的機(jī)會(huì)相配，非同胞兄妹間約1/10萬-1/20萬。

2、供受者之間存在不同程度的免疫學(xué)差異，移植后可發(fā)生排斥反應(yīng)及移植抗宿主反應(yīng)GVHD。

3、供者干細(xì)胞為正常細(xì)胞，移植適應(yīng)癥廣泛。

當(dāng)前39頁，總共46頁。4、移植物中無殘留病變細(xì)胞，不需體外凈化，移植后有抗白血病效應(yīng)，因而移植療效確切，腫瘤性疾病的復(fù)發(fā)率低，效果最好。

5、移植相關(guān)并發(fā)癥、死亡率較高，移植費(fèi)用較高。

6、移植成活后，因GVHD的影響，生存質(zhì)量較自體移植差。

當(dāng)前40頁，總共46頁。造血干細(xì)胞移植種類及特點(diǎn)（三）自體造血干細(xì)胞移植AHSCT

1、供者為患者本人，不受供髓來源限制。

2、是否適宜進(jìn)行AHSCT，受患者自身病情限制，移植適應(yīng)癥較窄。

3、因移植物中可能有殘留病變細(xì)胞，移植后病情復(fù)發(fā)率較高。

4、需考慮進(jìn)行體外凈化處理移植物，以改善療效。

5、移植相關(guān)并發(fā)癥、相關(guān)死亡率較低，適宜移植患者的年齡范圍較大，移植費(fèi)用較低。

6、無GVHD，移植成功后生存質(zhì)量較好。當(dāng)前41頁，總共46頁。造血干細(xì)胞移植種類及特點(diǎn)（四）外周血干細(xì)胞移植

1、外周血中造血干細(xì)胞收集比較方便，用血細(xì)胞分離機(jī)進(jìn)行分離、采集，采集方法可重復(fù)，供體無需麻醉，可免于多部位骨髓穿刺的痛苦和不便，供者易于接受。

2、因從外周血進(jìn)行造血干細(xì)胞的采集，對(duì)骨髓有浸潤(rùn)纖維化或接受過骨盆放療的患者仍可施行。

3、正常情況下外周血干細(xì)胞含量很少，需進(jìn)行動(dòng)員處理方可有效增加外周血干細(xì)胞含量，以供移植時(shí)采集。

當(dāng)前42頁，總共46頁。

4、與骨髓相比，外周血中腫