質(zhì)粒DNA的提取、定量、酶切與PCR鑒定實驗報告

質(zhì)粒DNA得提取、定量、酶切與PCR鑒定1、學(xué)習(xí)并掌握用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA得方法;4、學(xué)習(xí)并掌握PCR基因擴(kuò)增得實驗原理與操作方法;5。學(xué)習(xí)并掌握水平式瓊脂糖凝膠電泳得原理與使用方法。1、PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))過變性、退火、延伸等步驟,在體外(緩沖液中)復(fù)制DNA,使目得DNA按2n方式呈指右),與模板DNA互補(bǔ)退火形成部分雙鏈。2、質(zhì)粒DNA得提取與制備染色體DNA與質(zhì)粒DNA得變性與復(fù)性存在差異:A、高堿性條件下,染色體DNA與質(zhì)粒DNA均變性;B、當(dāng)以高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH值至中性時,變性得質(zhì)粒DNA復(fù)性并保存在溶液中,染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連得網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),可通過離心形成沉沉淀去除、A.硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下可選擇性地結(jié)合溶液中得質(zhì)粒DNA,而不吸附溶液B.通過去蛋白液與漂洗液將雜質(zhì)與其它細(xì)菌成分去除;C。低鹽,高pH值得洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。3.質(zhì)粒DNA得定量分析(紫外分光光度法):A生對光得吸收效應(yīng),且其對光得吸收就是具有選擇性;B得物質(zhì)都具有其各自得吸收光譜:DNA分對波長260nm得紫外光有特異得吸收峰蛋白質(zhì)對波長280nm得紫外光有特異得吸收峰nm收峰C。A260/A280及A260／A230得比值可以反應(yīng)DNA得純度;A260／A280=1、8DNA純凈表示樣品中含蛋白質(zhì)(芳香族)或酚類物質(zhì)4.質(zhì)粒DNA得酶切鑒定:A與一段被稱為限制酶識別序列得特殊DNA序列結(jié)合,或就是與其附近得特異位點結(jié)合,瓊脂糖就是一種天然聚合長鏈狀分子,可以形成具有剛性得濾孔,凝膠孔徑得大小決定ADNA型不同,電泳時得泳動率就不同,從而分出不同得區(qū)帶(遷移速度與分子量得對數(shù)值成反三、材料與方法:(一)實驗材料:R材料:菌液【大腸桿菌DH5a菌株(pMD19－T質(zhì)粒,含目得片段—綠色熒光蛋白GF2.質(zhì)粒DNA得提取與制備儀器:恒溫培養(yǎng)箱、臺式離心機(jī)、離心層析柱、Eppendorf管、微量加樣槍、離心管材料:溶液P1(S1)、溶液P2(S2)、溶液P3(S3)、去蛋白液PE(W1)漂洗液材料:蒸餾水、質(zhì)粒DNA材料:無菌水、10×M酶切緩沖液BufR、質(zhì)粒DNA、HindIII(15U/ul)、EcoRI(15。瓊脂糖凝膠電泳材料:電泳指示劑、Gelview、TBE、瓊脂糖、DNAMarker5000、電泳緩沖液泳儀得凝膠孔中①94℃預(yù)變性5分鐘后開始以下循環(huán)②循環(huán)為94℃——30秒,50℃——泳儀得凝膠孔中清洗比色皿:用微量加樣槍向比色皿加入適量l果與討論:果與討論:3.加入溶液P3,有白色絮狀沉淀生成;質(zhì)質(zhì)粒DNA濃度(ug/ml)Ratio比值(A261061。521151。447測量次數(shù)1235A260／A280〈1。8表明樣品中含有較多得蛋白質(zhì)(芳香族)R得DNA分子大小在400-500bp。基本符合預(yù)期、1。質(zhì)粒DNA中出現(xiàn)三條帶,分別對應(yīng)超螺旋質(zhì)粒DNA、線性DNA與開環(huán)狀質(zhì)粒DNA。這三種不同構(gòu)型得分子有不同得遷移率,在一般情況下,遷移速度最快得為超螺旋型,其次為線性分子,最慢得為開環(huán)狀分子,所以條帶從上到下分別為:超螺旋型DNA、線性分A。在質(zhì)粒DNA得提取實驗得“取上清液”步驟中吸入沉淀導(dǎo)致引入較多得蛋白雜質(zhì),進(jìn)而導(dǎo)致后續(xù)實驗中因蛋白質(zhì)量較多而難以去除、B?？赡転樵噭┪廴疽痣s質(zhì)蛋白得引入。3.實驗中需注意得事項:用微量加樣槍加試劑時,同種試劑可以不用換吸頭,每次換不同試劑時要記得換一個新在PCR中,如果配好得反應(yīng)液較多沾到管壁上,要將PCR反應(yīng)管置臺式離心機(jī)中瞬時離槍頭下伸,點樣孔內(nèi)不能有氣泡。Geldview,切勿用手接觸。思考題