乳酸菌實驗報告

乳酸菌的離與培養(yǎng)保加利乳桿菌組長：王小英組員：王小英

鄭春玲

闕小琴

柳潔實目：

1.習(xí)并掌握普通光學(xué)顯微鏡油鏡的使用技術(shù)及微生形態(tài)觀察；2.學(xué)習(xí)微生物片、染色的基本技術(shù)，掌握乳酸菌的簡單染色法及無菌操作接種技術(shù)；3.通過對培養(yǎng)的配制解配制培養(yǎng)基的一般步驟和方法握微生物實驗常用的器皿的清洗與包扎、培養(yǎng)基的制備、消毒滅菌。4.了解各種滅的基本原理和應(yīng)用范圍，以及實驗室中常用的滅菌方法。5.了解酸奶中酸菌分離原,觀乳酸菌的基本形,握用顯微鏡測微尺測量微生物細(xì)胞大小、數(shù)目的測定的方法。6.了解稀釋平計數(shù)的原理，熟練掌握混合平板培養(yǎng)法。明確顯微鏡計數(shù)的原理并學(xué)習(xí)使用血球計數(shù)板進(jìn)行微生物計數(shù)的方法。7．步學(xué)會乳酸菌培養(yǎng)的基本技術(shù)，了解并掌握細(xì)菌鑒定中常用生理生化反應(yīng)的原理和方，掌握進(jìn)行微生物大分子水解試驗的原理和方法。8.了解并掌握生物菌種保藏的常用方法及其優(yōu)缺點(diǎn)，并了解不同微生物對不同的生物大分子的分解利用情況，認(rèn)識微生物代謝類型的多樣性。實原：酸指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱，本實驗中用革蘭氏染色法進(jìn)行染色，革蘭氏染色法是根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞壁成分不同脫色效果不同從而可將細(xì)菌區(qū)分為G+和G-。通過革蘭氏染色以及形態(tài)學(xué)觀察，乳酸菌呈紫色，為革蘭氏陽性菌；乳酸菌應(yīng)為乳桿菌和乳球菌的混合體。酸奶中含有乳酸菌，而且目前市場上銷售的酸奶中通常含有雙歧桿菌、嗜乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌四種菌。細(xì)菌及其它一些微生物的大小，通常用測微計來測量，微計分接目測微計與鏡臺測微計；培養(yǎng)基是按照微生物生長發(fā)育的需要，用不同組份的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)制成的營養(yǎng)基質(zhì)；滅菌是用物理或化學(xué)的方法來殺死或除去物品上或環(huán)境中的所有微生物，包括芽孢；然條件下，微生物常以群落狀態(tài)存在，這種群落往往是不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生的特性或者要大量培養(yǎng)或者使用某種微生物，必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養(yǎng)，這些獲得培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離和純化。用生化試驗的方法檢測細(xì)菌對各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)，從而鑒別細(xì)菌的種屬，稱之為細(xì)菌的生化反應(yīng)。實器：樣品：含乳酸菌的酸奶①培養(yǎng)基：改良MRS體培養(yǎng)基蛋白胨5g

牛肉膏

5g

酵母提取物

2.5g

檸檬酸二銨1g

水500mL乙酸鈉2.5gK2HPO41gMnSO4·4H2O0.125瓊脂12.5gMgSO·7H2O0.29gCaCO35g

吐溫800.5mL葡萄糖10g。儀器用品：500ml燒一個250ml容三角瓶215ml試只

100ml量一個5ml無菌移液管高壓滅菌鍋

無菌培養(yǎng)皿12個1ml無菌移液管6只天平

水浴鍋一個電磁爐一個牛皮紙酒精燈一盞載玻片若干

玻棒一根棉花麻繩牛角匙恒溫培養(yǎng)箱

旋渦均勻器一臺紗布接種環(huán)一個pH試酸度計

鏡臺測微尺目鏡測微尺蓋玻片血球計數(shù)板擦鏡紙、吸水紙液體石蠟顯鏡

載玻片

玻片架、洗瓶、酒精燈火柴、滴管藥品：結(jié)晶紫，乙醇，草酸銨，碘，碘化鉀，番紅KOHNaCl，10％NaOH，2%氯化鐵。藥配結(jié)紫結(jié)晶紫乙醇飽和液（結(jié)晶紫g于20ml乙醇中1g草銨于蒸水。兩液混勻即成。盧氏液碘1g碘化鉀2g蒸餾水300ml。先將碘化鉀溶于少量蒸餾水，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸餾水300ml即。蕃溶：番紅2.5g，95%醇100ml，溶解后存于密閉的棕色瓶中。用時取與80ml蒸水混勻即可。0.1%的呂美染：A液美藍(lán)，95%乙醇B液0.01%KOH100ml?；旌螦和B液成，按1：稀即可。生鹽：取0.9克化鈉，溶解在少蒸餾水中，稀釋到100毫。實步：一、

培養(yǎng)基培養(yǎng)稱量用天平稱取蛋白胨1g,牛肉膏1g,酵母提取物0.5g,檬酸二銨0.2g,乙酸鈉0.5g,K2HPO40.2g,MnSO·4H2O0.025g,MgSO4·7H2O0.06g,葡萄糖2g,吐0.1mL,CaCO31g放燒杯。．溶解向述燒杯中加入蒸餾水50mL無水，用玻璃棒攪勻后，放到酒精燈上加在棉網(wǎng)上加熱溶解后加入2.5g瓊繼續(xù)用微火加熱在瓊脂溶化的過程中控火力的大小并且不斷攪拌，以免培養(yǎng)基溢出或燒焦。待瓊脂完全溶化后，補(bǔ)加蒸餾水至100mL。．調(diào)節(jié)pH用滴管逐滴滴入NaOH溶液，邊滴邊攪拌，并隨時用精密的H試測，到pH到6.8左。．過濾要熱用四層紗布過濾．培養(yǎng)基的分裝將培養(yǎng)基趁熱分裝到2個角瓶(一半為)。注意：分裝時不要將培養(yǎng)沾在管口和試管上段，以免引起污染。．加棉塞培基裝完畢以后，在管口上加一個棉塞。棉塞能防止雜菌污染，保證通氣良好。加棉塞時，應(yīng)使棉塞長度的2/3在試管口內(nèi)。．包扎在口外面包上一層牛皮紙，然后，用線繩扎好。在每捆試管外掛上標(biāo)簽注明培養(yǎng)基名稱、配制日期和制作者姓名二、滅．打開高壓蒸汽滅菌鍋，將里面的滅菌桶取出，向鍋內(nèi)加水最好用開水，水面與底架平齊為宜（直至高水位燈亮起．扎好的試管管口向上豎放在滅桶內(nèi)，再將滅菌桶放回滅菌鍋?zhàn)⒁猓簻缇皟?nèi)的物品不能得

太擠，否則會影響滅菌效果．蓋，并將排氣軟管插入滅菌桶排氣槽內(nèi)兩兩對稱的方式，同時旋緊相對的兩個緊固螺栓，以防漏氣）同時關(guān)閉滅菌鍋上方的安全閥，打開排氣閥，使水沸騰時得以排除鍋內(nèi)的冷空氣。．設(shè)置滅菌溫度和時間。溫度為121℃,20分鐘滅菌出鍋內(nèi)的冷空排閥內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升內(nèi)壓力上升到98kPa時，控制火力大小，使壓力維持在98kPa左右20min．滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力將至?xí)r，打開排氣閥，旋開蓋子，取出滅菌物品。三、無檢查將取出的滅菌培養(yǎng)基放入℃溫箱保溫培養(yǎng)24小，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。四

、

菌懸液配制先將酸奶樣品攪拌均勻，用無菌移液管吸取樣品10ml加入盛有90ml無水的三瓶中，在旋渦均勻器上充分振搖20分，使樣品均分散。用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml酸懸液注入9ml無水的試管中，吹息三次，使充分混勻。然后再用一支1ml無吸管從此試管中吸取1ml入另一盛有9ml無菌水的試管中，以此類推制成10-1、10-2、10-4、、、10-7各稀釋度的菌懸液要取7只試）。五、倒板取無菌平板12個編號標(biāo)明10-1、10-7各三套；將經(jīng)高溫消毒的培養(yǎng)基冷卻到0℃左右，按無菌操作法倒12只平板，每皿約15ml；平置使培養(yǎng)基均勻分布在皿底，待凝固。六、分方法A涂平板用三支1ml無菌吸管分別吸取、10-6和10-7的釋菌懸各1ml對號接種于與之對應(yīng)的3個無菌平板中，每個平皿放0；快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放與試驗臺上20Min；然后倒置于℃恒溫箱中培養(yǎng)48小。B．板線1、線在近焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，按無菌操作對標(biāo)‘10-1‘的3個板進(jìn)行劃操作。常用的劃線方法;(a)用接種環(huán)以菌操作挑取菌液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線3-4條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分做第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線部分做第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次行劃線。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于放在40恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小。b）挑取有品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于放在40恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小。C．釋合板先分別吸取1ml的10-510-7稀度的菌懸液對號放入平板，然后再倒入經(jīng)高溫消毒的并冷卻到℃左右培養(yǎng)基中，邊倒入邊搖勻，使樣品中的微生物與培養(yǎng)基混合勻，到冷凝成平板后，倒置于40℃溫箱中培養(yǎng)48小時。七、菌特征的觀察恒溫培養(yǎng)48小過后，取出培養(yǎng)平板；選擇菌落分布較好的平板，先對其菌落形態(tài)（如菌落的大小、表面狀況、透明度、色澤、邊緣、隆起度、透光性、是否分泌色素等特點(diǎn)）進(jìn)行觀察，初步找出酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大約1~3，形隆起，表面光滑或稍粗，呈乳白色、灰白色或暗黃色；在產(chǎn)酸菌落周圍還能產(chǎn)生CaCO3溶解圈。八、乳菌的形態(tài)觀及保加亞乳桿菌的態(tài)觀察（一）通光學(xué)顯微的使用

1.鏡從微鏡箱中取出顯微鏡時，用一手握鏡臂一手托鏡座，直立移動，輕放在平穩(wěn)的實驗臺上，使用前首先要熟悉顯微鏡的結(jié)構(gòu)和性能，檢查各部零件是否齊全，鏡頭是否清潔，做好必要地潔和調(diào)整工作。2.節(jié)光照1)用調(diào)節(jié)器提升鏡筒，將倍物鏡旋到鏡筒下方，使鏡頭和載物臺距離約為5右。2)上聚光器，使之與載物表面相距1米左右。3)插電源，開開電源開關(guān)左眼看目鏡調(diào)節(jié)反光鏡鏡面角度（在天然的光線下觀察，一般用平面反鏡；若以燈光為光源，則一般多用凹面反光鏡）。4)開光圈，調(diào)節(jié)光線強(qiáng)弱直至視野內(nèi)得到最均勻最適宜的光度為止。3.倍鏡觀察1)將片標(biāo)本（涂面朝上）于載物臺的標(biāo)本夾上，并將標(biāo)本部位處于物鏡的正下方，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使鏡頭下降至鏡面距離檢視物大約5mm處2)然以左眼看目鏡，另一睜開，一邊觀察視野，一邊扭動粗調(diào)節(jié)器使鏡頭緩慢地升高，至視野內(nèi)出現(xiàn)物像后，改用細(xì)調(diào)節(jié)器上下微微轉(zhuǎn)動，仔細(xì)調(diào)節(jié)焦距和照明，直至視野內(nèi)獲得清晰的物像選擇適宜部位，移到視野中心。3)移推動器，換高倍鏡觀。4.倍鏡觀察將高倍物鏡轉(zhuǎn)至鏡筒下方調(diào)光圈和聚光鏡使光線亮度適中再仔細(xì)反復(fù)轉(zhuǎn)動微調(diào)螺旋，調(diào)節(jié)焦距，獲得清晰物象，再移動推動器選擇最滿意的鏡檢部位將染色標(biāo)本移至視野中央待油鏡觀察。5.鏡觀察1)先粗調(diào)節(jié)旋鈕將鏡筒提（或?qū)⑤d物臺下降）約2，轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器將油鏡至鏡筒正下方。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺緩緩地上升，使油浸鏡浸入香柏油中，使鏡頭幾乎與標(biāo)本接觸。2)左看目鏡，右手反時針向微微轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋，下將載物臺，當(dāng)視野中有模糊地標(biāo)本物象時，改用細(xì)調(diào)螺旋，并移動標(biāo)本直至標(biāo)本物象清晰為止。3)觀完畢，下降載物臺，油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦擦鏡紙蘸少許二甲苯或乙醚酒精混合液（乙醚2份，純酒精3份，擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭2~3下即可，（注意向一個方向擦拭）。4)將部分還原：下降載物最低處；轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡鏡頭轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋轉(zhuǎn)至最低處；將調(diào)節(jié)光源亮度的旋鈕最小化；關(guān)掉電源；用柔軟紗布清潔載物臺等機(jī)械部分，放好顯微，蓋上罩。（如果是自然采光顯微鏡，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直）。6.片另新的標(biāo)本片，必須從第三條開始操作。7.后必須清潔、復(fù)原觀完畢，上旋鏡筒，先擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上的殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。機(jī)部件用細(xì)軟布擦去灰塵和冷凝水，下降鏡筒，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形置于載物臺上。下降聚光鏡，（切使接物鏡與聚光鏡相碰受損），反光鏡垂直于鏡座。放進(jìn)顯微鏡箱中鎖好，并放入指定的面微鏡柜中（）

鏡檢革蘭氏染方法）1.片取凈載玻片一塊，在載玻片中央加一滴蒸餾水，將培養(yǎng)的乳酸菌作涂意涂片不可過于濃厚），干燥、固定。固定時通過火焰12次即可，不可過熱，以載玻片不燙為宜。2.色(1)初染加酸銨結(jié)晶紫染色液一滴，約1一分，傾去染色液，用自來水小心地沖洗。(2)媒染滴盧哥氏碘液沖去殘水，并覆蓋約1一分，水洗。(3)脫色將玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約20—秒，立即用水沖凈酒精，以終止脫色。

(4)復(fù)染滴番紅液，染色2—3分，水洗。最后用吸水紙輕輕吸干。(5)鏡干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭陽性菌呈紫色。以分散開的乳酸菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。其中保加利亞乳桿菌呈桿狀，成單桿、或桿菌或長絲狀；嗜熱鏈球菌，呈球狀，成對、或短鏈、或長鏈狀。十、保利亞乳桿菌細(xì)胞大測定、鏡微的正把鏡的上透鏡旋下，將目鏡測微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上，把鏡臺測微尺置于載物臺上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對準(zhǔn)焦距，視野中看清鏡臺測微尺刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺的刻度平行，移動推動器，使兩尺重疊，再使兩尺的“刻度完全重合，定位后，仔細(xì)尋找兩尺第二個完全重合的刻度，計數(shù)兩重合刻度之間目鏡測微尺的格數(shù)鏡臺測微尺的格數(shù)。因為鏡臺測微尺的刻度每格長l0μm所以由下列公式可以算出目鏡測微尺每格所代表的長度。例如目鏡測微尺5小正好與鏡臺測微尺小重疊，已知鏡臺測微尺每小格為l0μm則目鏡測微尺上每小格長度為=5×10μm/510、體小測取下鏡臺測微尺，將保加利亞乳桿菌染色標(biāo)本片置于載物臺上，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物。然后在高倍鏡下轉(zhuǎn)動目鏡測微尺，測出保加利亞乳桿菌的長和寬各占幾格不足一格的部分估計到小數(shù)點(diǎn)后一位），測出的格數(shù)乘上目鏡測微尺每格的長度，即等于該菌的大小同法在油鏡下轉(zhuǎn)動目鏡測微尺測出保加利亞乳桿菌的長和寬各占幾格（不足一格的部分估計到小數(shù)點(diǎn)一位），測出的格數(shù)乘上目鏡測微尺每格的長度，即等于該菌的大小。例如目鏡測微尺在顯微鏡下經(jīng)過校正，當(dāng)使用油鏡時，每格相當(dāng)于。如果測量菌體的長度相當(dāng)于目鏡測微尺的兩格，則菌體長度應(yīng)為1.3μm×2=2.6μm。一般測定微生物細(xì)胞大小時，通常測量1—20菌體左右，求出平均值，才能代表該菌的大小。用最大和最小的數(shù)值來表示菌體大小的范圍。例如長為3~5μm，寬為1~2μm，則其大小為l~2×3~5μm。3、出鏡微尺，接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測微尺和鏡臺測微尺分別再用擦紙擦拭后，放回盒內(nèi)保存。（二）球計數(shù)板在微鏡下接計數(shù)保加亞乳桿的數(shù)量如圖--血球計數(shù)板構(gòu)造上：俯視圖（中間平臺分為兩半，各刻有一個方格網(wǎng)）下：側(cè)面圖（中間平臺與蓋玻片之間有高度為0.1mm的隙）

血球計數(shù)板通常是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有四條槽而構(gòu)成三個平臺（5-2）。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽而隔成兩半，每個半邊上面各刻有一個方格網(wǎng)。每個方格網(wǎng)共分9大其中間的1格又稱為計數(shù)室，微生物的計數(shù)就在大格中進(jìn)行。常用的血球計數(shù)板的計數(shù)室有兩種規(guī)格的刻度網(wǎng)格。一種是一個大方格分成16中方格，而每個中方格又分成25個方格，即為16×25另一種是一個大方格分成25個方格而每個中方格又分成16小方格，即。是不管計數(shù)室是哪種規(guī)格，其計數(shù)室的小格數(shù)總是相同的，即16×25=400（小格），見下圖。圖--計數(shù)網(wǎng)的區(qū)分與分格每一個大方格邊長為則一大方格面積為lmm2蓋上蓋玻片后載片計數(shù)室與蓋被片之的高度為，所以每個計數(shù)室（大方格）體積為0.1mm3。計數(shù)時，通常數(shù)個中方格的總菌數(shù)求得平均值再乘上或25就得一大方格中總菌數(shù)后再換算成1mL菌中的總菌數(shù)1mL=1cm31）操作步驟如：、取培養(yǎng)后的保加利亞乳桿菌液振蕩混勻，加無菌水適當(dāng)稀釋（斜面一般稀釋到0）稀釋度選擇以小方格中的分布的菌體清晰可數(shù)為宜。一般以每小格內(nèi)含4～菌體的稀釋度為宜。取潔無油的血球計數(shù)板，在計數(shù)室上面加蓋玻片。將保加亞乳桿菌液搖勻滴管吸取少許從數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴（不宜過多），使菌液沿兩玻片間自行滲入計數(shù)室，勿使產(chǎn)生氣泡，并用吸水紙吸去溝槽流出的多余菌液。也可以將菌液直接滴加在計數(shù)室上，然后加蓋蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡）。靜后將球計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上用低倍鏡找到計數(shù)板的大方格網(wǎng)位置尋找時光圈要縮小，光線要偏暗些，并將計數(shù)室移至視野中央。．計數(shù)時用由中的計數(shù)板，要按對角方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個中格（即100小格）的保加利亞乳桿菌數(shù)。如果是個大方格組成的計數(shù)區(qū)，除數(shù)述四個格外，還需數(shù)中央l個格的保加利亞乳桿菌菌數(shù)（即80小格）。由于菌體在計數(shù)室中處于不同的空間位置，要在不同的焦距下才能看到，因而觀察時必須不斷調(diào)節(jié)微調(diào)如菌體位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。6．在高倍鏡下計數(shù)