腦腫瘤干細(xì)胞放射敏感性的實(shí)驗(yàn)研究

腦腫瘤干細(xì)胞放射敏感性的實(shí)驗(yàn)研究【內(nèi)容摘要】目的評價(jià)腦腫瘤干細(xì)胞〔braintumorstemcell,btsc〕與膠質(zhì)瘤細(xì)胞系shg44細(xì)胞放射敏感性的差別。方法shg44細(xì)胞分別接種于含10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基和無血清的dmem／f12培養(yǎng)基(添加bfgf和egf)中。cd133免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定btsc。0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、20gyx線照耀shg44細(xì)胞和btsc后以流式細(xì)胞儀檢測兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率，繪制shg44細(xì)胞和btsc的存活曲線。結(jié)果shg44細(xì)胞中存在btsc，后者能在無血清的dmem／f12培養(yǎng)基中存活并懸浮生長，增殖構(gòu)成克隆球，具有自我更新和增殖能力，表達(dá)特異性標(biāo)記物cd133。兩種細(xì)胞在x線照耀后細(xì)胞周期無明顯差別，btsc的細(xì)胞凋亡率低于shg44細(xì)胞(p0.05)，細(xì)胞存活率高于shg44細(xì)胞(p0.01)。結(jié)論btsc的放射敏感性較shg44細(xì)胞明顯降低，是膠質(zhì)瘤放療抵抗的重要原因?！颈疚年P(guān)鍵詞語】腦腫瘤干細(xì)胞；shg44細(xì)胞；膠質(zhì)瘤；放射敏感性experimentalresearchofradiosensitivityforbraintumorstemcellkejin1,hejie2〔mentofoncology,zhongdahospital,southeastuniversity,nanjing210009,china；mentofpathology,fourthpeople′shospitalofwuxi,affiliatedtosuzhouuniversity,wuxi214062,china〕abstract：objectivetoevaluatedifferenceofradiosensitivityforbraintumorstemcell(btsc)andhumangliomacelllineshg44sshg44wasculturedindmem/f12supplementedwith10％fbs,andinserumfreedmem/f12containingbfgfandegfwasdetectedbyimmunocytochemistricalstainingwithantibodiesagainstandshg44cellwereirradiatedbyxrayswithdosesof0,0.5,1,2,3,4,6,8,10,20gyrespectively,andflowcytometryassaywasusedtodetectetheapoptosisandanalyzethechangesofcellsurvivalcurvesofbtscandshg44cellweredeterminedbythemeasureofcellclonesshg44cellcontainedbtsc,whichcouldsurviveandgrowbymeansofsuspensioninserumfreemediumandproliferateintotheclonalclonalspheresmaintainedstrongabilityofselfrenewalandspecificmarkercd133couldbeexpressedbybtscandshg44cellwereirradiatedbyxrays,flowcytometryassayshowedthatnodifferentcouldbefoundincellcyclesandtheratiosofapoptosisinbtscwerelowerthanthatofshg44cellsignificantly(p0.05).thecellsurvivalcurvesassayshowedthattheratiosofcellcloneformationinbtscwashigherthanthatofshg44cell(p0.01).conclusionsradiosensitivityofbtscislowerthanthatofshg44cell,anditismaincauseofgliomaradioresistence.keywords:braintumorstemcell；shg44cell；glioma；radiosensitivity〔modernmedicaljournal,2009,37:192194〕腦膠質(zhì)瘤(neurogliocytoma)是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的60%以上，無論放療、化療還是手術(shù)治療，惡性膠質(zhì)瘤患者的中位生存期只要14.6個(gè)月［1］。放療是腦膠質(zhì)瘤最有效的治療手段之一，但由于腫瘤的放療抵抗性使得相當(dāng)一部分患者在放療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)。近期研究發(fā)現(xiàn)，腦腫瘤中存在具有自我更新特性的細(xì)胞亞群即腦腫瘤干細(xì)胞(braintumorstemcell，btsc)，是引發(fā)腫瘤并維持其生長的根本源頭，并在腫瘤的復(fù)發(fā)經(jīng)過中起著決定性作用［2］。放療失敗的原因可解釋為放射線并沒有將腫瘤干細(xì)胞全部殺死,存活下來的腫瘤干細(xì)胞具有無限增殖能力,能繼續(xù)促進(jìn)腫瘤生長。本研究旨在討論btsc在膠質(zhì)瘤放療抵抗性中的作用及其可能的機(jī)制。1材料和方法1.1材料膠質(zhì)瘤細(xì)胞系shg44細(xì)胞〔上海中國科學(xué)院〕，dmem／f12(1∶1)培養(yǎng)基(南京天為公司)，胎牛血清〔杭州四季青公司〕，胰蛋白酶(sigma公司)，人表皮生長因子(egf，peprotech公司)，人堿性成纖維生長因子(bfgf，peprotech公司)，兔抗cd133多克隆抗體〔abcam公司〕。1.2方法1.2.1shg44細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代shg44細(xì)胞接種于含10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5～7d后按1∶2或1∶3的比例傳代。1.2.2btsc的培養(yǎng)和傳代shg44細(xì)胞接種于含egf〔20ng·ml1〕和bfgf〔20ng·ml1〕的無血清dmem/f12培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待btsc增殖構(gòu)成干細(xì)胞球3、4d后，汲取上清液體培養(yǎng)基(含細(xì)胞球)從新吹打成單細(xì)胞懸液，按1∶2或1∶3的比例傳代。1.2.3btsc的鑒定用btsc的特異性標(biāo)記物cd133進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，將細(xì)胞離心后滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上，靜置待干，100％的丙酮固定，正常血清封閉，抗cd133一抗孵育4℃過夜，二抗孵育37℃30min，dab染色5～10min，每步驟間均用0.01mmol·l-1pbs沖刷3遍，封片后顯微鏡下觀察。1.2.4實(shí)驗(yàn)分組及照耀兩種細(xì)胞均各自以隨機(jī)數(shù)字法設(shè)立對照組及照耀組，照耀組進(jìn)一步分為0.5、1、2、3、4、6、8、10、20gy劑量組。除對照組不照耀外，兩種細(xì)胞均采取西門子直線加速器md7745照耀，室溫下進(jìn)行。1.2.5繪制細(xì)胞存活曲線對照組和照耀組細(xì)胞孵育24h，采集細(xì)胞，接種于24孔板中〔200個(gè)細(xì)胞·皿-1〕。2周后用giemsa染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的克隆，并計(jì)算細(xì)胞存活率，繪制shg44細(xì)胞和btsc的存活曲線。1.2.6流式細(xì)胞術(shù)取經(jīng)0、2、4、8、10、20gyx線照耀后的兩種細(xì)胞，孵育48h，采集106個(gè)細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率和細(xì)胞周期。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果采取單因素方差分析，p0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由spss13.0軟件完成。2結(jié)果2.1shg44細(xì)胞的生長和btsc的構(gòu)成、增殖在含血清培養(yǎng)基中，shg44細(xì)胞呈貼壁生長并交錯(cuò)成網(wǎng)狀〔圖1〕。在無血清培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3～4d后一小部分細(xì)胞構(gòu)成btsc，并能自我增殖成克隆球，呈球形或卵球形，大小不一，折光性較強(qiáng)，懸浮生長，取克隆球吹打成單細(xì)胞后從新培養(yǎng)，3d后可見克隆球從新生成〔圖2〕。2.2btsc的鑒定cd133免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見克隆球呈棕黃色，cd133定位在細(xì)胞膜〔圖3〕。2.3x線對shg44細(xì)胞和btsc的影響shg44細(xì)胞和btsc存活曲線〔圖4〕顯示，隨著照耀劑量的增長，兩種細(xì)胞的存活率出現(xiàn)下降，但btsc的存活率明顯高于shg44細(xì)胞〔p0.01〕。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期無明顯差別。隨著x線照耀劑量的增長兩種細(xì)胞的凋亡率均升高〔圖5〕，但btsc的凋亡率明顯低于shg44細(xì)胞(p0.05)。3討論人們對于腫瘤干細(xì)胞(tumorstemcell，tsc)的認(rèn)識最初來自于對白血病的研究，以為在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展經(jīng)過中僅僅只要一小部分細(xì)胞具有廣泛的增殖和自我更新能力,被稱為腫瘤干細(xì)胞。隨著singh等［3］從多種腦腫瘤中分離出腫瘤源性細(xì)胞，tsc的存在得到證明。tsc學(xué)說［26］以為，腦膠質(zhì)瘤內(nèi)存在與神經(jīng)干細(xì)胞性質(zhì)類似的細(xì)胞，即tsc，它們參與了腦腫瘤的構(gòu)成。這些細(xì)胞在體外可構(gòu)成神經(jīng)球，能夠自我更新，具有無限增殖、多向分化潛能以及高致瘤性。tsc學(xué)說之所以近年逐步升溫，得益于技術(shù)的發(fā)展和干細(xì)胞標(biāo)記物的出現(xiàn)。tsc和神經(jīng)干細(xì)胞存在許多共同特征，兩者存在一些共同的外表標(biāo)記，如cd133和nestin。cd133是一種分子量為120ku的細(xì)胞外表蛋白，nestin屬于中間微絲，兩者是比較公認(rèn)的tsc外表標(biāo)記物。tsc外表標(biāo)記物為cd133和nestin。本研究采取懸浮培養(yǎng)法。在添加生長因子的無血清培養(yǎng)基中，btsc呈懸浮球樣生長，而除此之外的大部分細(xì)胞貼壁生長，故為初步分離培養(yǎng)tsc提供了一種有效的方法。本實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)的接種密度約為1×106ml-1，傳代密度為1×105ml-1。培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：接種的密度較高，細(xì)胞球的構(gòu)成速度較快。本研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系shg44細(xì)胞和btsc承受x線干涉后，btsc的存活率高于shg44細(xì)胞，凋亡率明顯低于shg44細(xì)胞，表示清楚btsc的放射敏感性低于shg44細(xì)胞。放射生物學(xué)在放療機(jī)制中以為，dna是放射線對細(xì)胞作用最關(guān)鍵的靶，射線對dna損傷越大，對腫瘤細(xì)胞的打擊越大，放療敏感性就愈高。但若dna損傷后能很快修復(fù)，就不會(huì)出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的死亡，也就是產(chǎn)生放療抵抗性［7］。btsc的放療抵抗性可能與dna損傷的修復(fù)有關(guān)。bao等［8］發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗和cd133+細(xì)胞亞群有關(guān)，慣例放療后，瘤組織中cd133+亞群相比照例增長，而cd133-亞群減少。cd133+細(xì)胞〔btsc〕可通過優(yōu)先激活dna損傷檢查點(diǎn)蛋白提升放療抵抗性。放療后cd133+細(xì)胞檢查點(diǎn)蛋白〔atm、rad17、chk1、chk2〕的磷酸化較cd133-細(xì)胞明顯升高，這使其修復(fù)dna的損傷愈加有效，而且用檢查點(diǎn)激酶(chk1和chk2)特異性抑制劑〔dbh〕［9］能夠逆轉(zhuǎn)btsc的放射抵抗性［8］。同樣，shiloh等[1011]在對橫紋肌樣型腦膜瘤的cd133+細(xì)胞放療抵抗性的研究中發(fā)現(xiàn)，放療后cd133+細(xì)胞較cd133-細(xì)胞優(yōu)先激活dna損傷檢查點(diǎn)蛋白〔atm、rad17、chk2〕和抗凋亡基因〔bcl2、bclxl〕，而且dna損傷修復(fù)基因〔atm、gadd45、ku80、ercc5〕表達(dá)增長。除此之外，腦腫瘤干細(xì)胞放射敏感性還可能與影響細(xì)胞周期調(diào)控、抗細(xì)胞凋亡及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變有關(guān)?？傊?，隨著tsc研究的深切進(jìn)入，利用tsc學(xué)說解釋膠質(zhì)瘤放療抵抗性的機(jī)制，為克制膠質(zhì)瘤放療抵抗提供了新思路?！疽韵聻閰⒖嘉墨I(xiàn)】［1］stuppr,masonwp,vandenbentmj,etherapyplusconcomitantandadjuvanttemozolomideforglioblastoma［j］.nengljmed,2005,352(10):987996.［2］marxstemcellsmayseedcancer［j］.science,2003,301(5638):13081310.［3］singhsk,clarkeid,terasakim,etficationofacancerstemcellinhumanbraintumors［j］.cancerres,2003,63(18):58215828.［4］hemmatihd，nakanoi，lazareffja,etousstemcellscanariesfrompediatricbraintumors［j］.procnatlacadsciusa,2003,100(12):1517815183.［5］singhsk，hawkinsc，clarkid，etficationofhumanbraintumorinitiatingcells［j］.nature，2004，432(7015):396401.［6］gallir,bindae,orfanelliu,etionandcharacterizationoftumorigenic,stemlikeneuralprecursorsfromhumanglioblastoma［j］.cancerres,2004