基因工程藥物

基因工程藥物第1頁(yè)/共126頁(yè)基因工程是通過(guò)對(duì)目的基因的摻入，拼接和重組而實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，再借助質(zhì)粒，病毒或其他載體將目的基因轉(zhuǎn)移到新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的新技術(shù)?；蚬こ淌乾F(xiàn)代生物技術(shù)的主體及核心。又稱DNA重組，基因克隆等。定義基因工程技術(shù)最成功的應(yīng)用就是用于生物治療的新型生物藥物的研制。1982年人胰島素在美國(guó)的問(wèn)世，帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。生物技術(shù)用于疾病的預(yù)防和疑難雜癥的治療已經(jīng)成為了現(xiàn)實(shí)。第2頁(yè)/共126頁(yè)主要的人和事第3頁(yè)/共126頁(yè)第4頁(yè)/共126頁(yè)第5頁(yè)/共126頁(yè)第6頁(yè)/共126頁(yè)第7頁(yè)/共126頁(yè)第8頁(yè)/共126頁(yè)第9頁(yè)/共126頁(yè)第10頁(yè)/共126頁(yè)第11頁(yè)/共126頁(yè)第12頁(yè)/共126頁(yè)第13頁(yè)/共126頁(yè)發(fā)展現(xiàn)狀美國(guó)作為最早開展基因及基因工程研究的國(guó)家，自基因工程誕生以來(lái)處于世界領(lǐng)先地位。擁有生物技術(shù)公司2000余家，其中300余家上市公司。歐洲約有1000余家生物技術(shù)公司。亞洲的日本，韓國(guó)和印度也獲得了極大的發(fā)展。我國(guó)生物技術(shù)起步較晚，但是受到了國(guó)家的高度重視，發(fā)展速度也是十分驚人。1997年我國(guó)自主生產(chǎn)了第一個(gè)基因工程藥物重組干擾素。目前世界上排名前十位的重要基因工程藥物我國(guó)都能自主生產(chǎn)。我國(guó)已批準(zhǔn)上市的基因工程藥物和疫苗表26-1第14頁(yè)/共126頁(yè)基因工程藥物的特點(diǎn)穩(wěn)定性差，易腐敗。使用用量低，藥理活性高。具有細(xì)胞和組織特異性。給藥方式有特定要求。第15頁(yè)/共126頁(yè)主要的基因工程藥物第16頁(yè)/共126頁(yè)基因工程技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)可以大量生產(chǎn)過(guò)去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（如胰島素、干擾素、細(xì)胞因子等），為臨床使用提供有效的保障?？梢蕴峁┳銐驍?shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對(duì)其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍。利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)。利用基因工程技術(shù)改良藥物，獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來(lái)源。

第17頁(yè)/共126頁(yè)基因工程菌的制備目的基因的獲取載體的制備目的基因與載體的連接轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化子的鑒定和鑒別第18頁(yè)/共126頁(yè)目的基因的獲取反轉(zhuǎn)錄法以富含目的基因的實(shí)驗(yàn)材料提取RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下獲得cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終合成編碼多肽的雙鏈DNA序列，這是制取真核生物目的基因常用的方法。人工合成法化學(xué)合成法：利用特殊的化學(xué)試劑將相鄰的兩個(gè)核苷酸以3’,5’-磷酸二酯鍵

相連，逐漸延長(zhǎng)獲得目的基因序列。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：根據(jù)已經(jīng)基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)分

段和成基因片段最終獲得全長(zhǎng)基因。第19頁(yè)/共126頁(yè)載體的制備外源基因必須導(dǎo)入適合的細(xì)胞內(nèi)才能實(shí)現(xiàn)克隆，表達(dá)。這一過(guò)程依賴于載體的轉(zhuǎn)運(yùn)，外源基因片段與載體連接是DNA重組技術(shù)的關(guān)機(jī)步驟之一。根據(jù)受體細(xì)胞的不同，載體的選擇也是不同的，主要包括以下載體：質(zhì)粒載體λ噬菌體柯斯質(zhì)粒單M13噬菌體動(dòng)植物病毒的衍生物第20頁(yè)/共126頁(yè)質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體是存在于細(xì)菌（酵母）細(xì)胞質(zhì)中的一種獨(dú)立于染色并能自主復(fù)制的一類遺傳物質(zhì)。大多數(shù)質(zhì)粒成環(huán)狀。通常是游離于染色體之外單獨(dú)復(fù)制，也可在特殊狀況下整合入基因組DNA中共同復(fù)制。提取大量完整的質(zhì)粒是制備重組質(zhì)粒的前提基礎(chǔ)。（天然：pSC，RDF；改進(jìn)：pUC，pBR，pET）第21頁(yè)/共126頁(yè)λ噬菌體載體

λ噬菌體基因組長(zhǎng)度48.5kb，基因組中處的一連串基因并非噬菌體形成所必需的，若用外源DNA片段取代這個(gè)區(qū)域，不會(huì)影響噬菌體的形成，這也是λ噬菌體能夠作為質(zhì)粒載體的的前提條件。通過(guò)人工改造得到的λ噬菌體載體可以分為插入型和替換型。插入型：可用于組建cDNA文庫(kù)，可容納10kb以下的片段。（組織細(xì)胞特異性）替換型：可用于組建基因組文庫(kù)，容納20kb左右的片段。第22頁(yè)/共126頁(yè)柯斯質(zhì)粒載體

柯斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的特殊質(zhì)粒載體。含有λDNA的cos序列，質(zhì)粒復(fù)制子，抗藥性標(biāo)記，一種或幾種限制性內(nèi)切酶單一位點(diǎn)。具有λ噬菌體和質(zhì)粒的優(yōu)越性，又具有高容量的克隆能力，容納外源DNA的長(zhǎng)度可達(dá)45kb。腺病毒載體

腺病毒可以攜帶外源基因通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，但不整合入基因組中，實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染，復(fù)制。轉(zhuǎn)染效率達(dá)100%。脂質(zhì)體載體

是一種人工膜，可以和細(xì)胞膜融合從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)染，可以做到緩釋，毒性低。第23頁(yè)/共126頁(yè)方法一：加同聚尾連接。

用3‘末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化，使載體與cDNA的3’末端帶上互補(bǔ)的同型多聚體序列，如載體加上polyC（或A）的尾巴，則cDNA加上polyG（或T）的尾巴，這兩種粘性末端只能使載體與cDNA連接而不能自我環(huán)化，借助同型多聚體的退火作用形成重組分子，最后用T4DNA連接酶封口。優(yōu)點(diǎn)：不易自身環(huán)化。因?yàn)檩d體和外源片段的末端是互補(bǔ)的粘性末端，所以連接效率較高。用任何一種方法制備的DNA都可以用這種方法進(jìn)行連接,通用性好。目的基因與載體的連接第24頁(yè)/共126頁(yè)第25頁(yè)/共126頁(yè)方法二：加人工接頭連接用T4DNA連接酶在平末端接上人工接頭可以使DNA發(fā)生連接。所謂人工接頭是指人工合成的、連接在目的基因兩端的含有某些限制酶切位點(diǎn)的寡核苷酸片段。cDNA連上人工接頭后，用該種限制酶酶切就可得到粘性末端，從而能夠與載體連接；cDNA中也可能也帶有同樣的限制酶切點(diǎn)，為了保護(hù)cDNA不受限制酶破壞，可在加接頭前用甲基化酶修飾這些限制酶切位點(diǎn)。目的基因與載體的連接T4DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端之間的效率比較低。第26頁(yè)/共126頁(yè)CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-第27頁(yè)/共126頁(yè)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化含目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建完成后，需要導(dǎo)入宿主菌種進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)，通常采用轉(zhuǎn)化法。所謂轉(zhuǎn)化就是指在特殊狀態(tài)下即感受態(tài)狀態(tài)時(shí)，可攝取外源遺傳物質(zhì)，攝入的外源物質(zhì)可以單獨(dú)復(fù)制也可以整合到宿主細(xì)胞染色體一同復(fù)制，是宿主菌具有新的形狀。宿主細(xì)胞感受態(tài)的制備有多種方法包括：冷氯化鈣，氯化鋁，電轉(zhuǎn)法等。重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒野生型E.coli感受態(tài)細(xì)胞CaCl2低溫短暫熱刺激或電擊第28頁(yè)/共126頁(yè)熱激法：大腸桿菌在0℃CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基－鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，重組子基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉(zhuǎn)化子。

電擊法：使用瞬時(shí)高壓電處理細(xì)胞懸液，微生物細(xì)胞膜在高壓電的作用下發(fā)生去極化，產(chǎn)生微孔，懸液中溶解的核酸即可通過(guò)細(xì)胞膜上的孔洞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。這種方法很直接，轉(zhuǎn)化效率很高。做酵母等真核生物轉(zhuǎn)化時(shí)一般都是電擊。轉(zhuǎn)化方法第29頁(yè)/共126頁(yè)轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在全部受體細(xì)胞中只占極少數(shù)，需要從大量細(xì)胞中篩選出海鷗重組子的菌株，主要的方法有抗藥性篩選，單菌落快速電泳，序列測(cè)定，Southern印跡雜交等?？剐耘囵B(yǎng)基篩選第30頁(yè)/共126頁(yè)單菌落快速電泳單菌落不需培養(yǎng)擴(kuò)增，快速裂解單菌落，使內(nèi)部的質(zhì)粒釋放出來(lái)，直接上電泳檢測(cè)，判斷是否還有重組質(zhì)粒，也可以配合以PCR檢測(cè)是否能擴(kuò)增出目的基因。第31頁(yè)/共126頁(yè)序列測(cè)定Sanger雙脫氧鏈終止法是FrederickSanger于1975年發(fā)明的。測(cè)序過(guò)程需要先做一個(gè)PCR。過(guò)程中，雙脫氧核糖核苷酸（ddNTP）可能隨機(jī)的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于雙脫氧核糖核苷酸多脫了一個(gè)氧原子，一旦它被加入到DNA鏈上，這個(gè)DNA鏈就不能繼續(xù)增加長(zhǎng)度。最終的結(jié)果是獲得所有可能獲得的、不同長(zhǎng)度的DNA片段。目前最普遍最先進(jìn)的方法，是將雙脫氧核糖核苷酸進(jìn)行不同熒光標(biāo)記。將PCR反應(yīng)獲得的總DNA通過(guò)毛細(xì)管電泳分離，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下發(fā)出熒光。由于ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP（4種雙脫氧核糖核苷酸）熒光標(biāo)記不同，計(jì)算機(jī)可以自動(dòng)根據(jù)顏色判斷該位置上堿基究竟是A，T，G，C中的哪一個(gè)。第32頁(yè)/共126頁(yè)Southern印跡雜交一是將待測(cè)定核酸分子通過(guò)一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）；二是固定于膜上的核酸與同位素標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強(qiáng)度下退火，即分子雜交過(guò)程。第33頁(yè)/共126頁(yè)基因表達(dá)基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中轉(zhuǎn)錄，翻譯以及后加工過(guò)程。以下是主要的表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)第34頁(yè)/共126頁(yè)1.宿主菌的選擇容易獲得較高濃度的細(xì)胞；能利用易得廉價(jià)原料；不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)；容易進(jìn)行代謝調(diào)控；容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作；產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取純化影響基因表達(dá)的因素大腸桿菌枯草桿菌原核酵母，真菌，昆蟲，動(dòng)物細(xì)胞真核第35頁(yè)/共126頁(yè)原核細(xì)胞大腸桿菌其為不需要修飾蛋白的首選表達(dá)宿主細(xì)胞。結(jié)構(gòu)功能了解透徹，技術(shù)成熟。另外大腸桿菌可以進(jìn)行高密度培養(yǎng)，培養(yǎng)介質(zhì)簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，容易操作，優(yōu)化手段豐富。大腸桿菌原核第36頁(yè)/共126頁(yè)大腸桿菌中的表達(dá)的缺點(diǎn)：不存在信號(hào)肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物；分泌能力不足，常形成不溶性的包含體，產(chǎn)物須在下游處理過(guò)程中經(jīng)過(guò)變性和復(fù)性處理才能恢復(fù)其生物活性；不存在翻譯后修飾作用；翻譯通常從甲硫氨酸的AUG密碼子開始，故目的蛋白質(zhì)的N端常多余一個(gè)甲硫氨酸殘基，容易引起免疫反應(yīng)；產(chǎn)生的內(nèi)毒素難以除去；產(chǎn)生的蛋白質(zhì)酶會(huì)破壞蛋白質(zhì)。原核第37頁(yè)/共126頁(yè)枯草芽孢桿菌

分泌能力強(qiáng)，可以將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成包含體。該菌也不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化，另外由于它有很強(qiáng)的胞外蛋白酶，會(huì)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行不同程度的降解，因此在外源基因克隆表達(dá)的應(yīng)用中受到影響枯草芽孢桿菌原核第38頁(yè)/共126頁(yè)鏈霉菌其是重要的工業(yè)微生物，近年來(lái)作為外源基因表達(dá)體系正日益受到人們的重視。其主要特點(diǎn)是：不致病、使用安全，分泌能力強(qiáng)，可將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力，變鉛青鏈霉菌限制修飾能力弱，可以作為理想的受體菌。現(xiàn)已構(gòu)建了一系列有效的載體，下游培養(yǎng)工藝也已經(jīng)成熟。鏈霉菌原核第39頁(yè)/共126頁(yè)酵母研究基因表達(dá)調(diào)控的最有效的單細(xì)胞真核生物。特點(diǎn)：①真核生物細(xì)胞，故有后翻譯過(guò)程；②基因組小，僅為大腸桿菌的4倍；③世代時(shí)間短，有單倍體和雙倍體兩種形式；④基因操作與原核生物相似；⑤可以建立有分泌功能的表達(dá)系統(tǒng)，將產(chǎn)物分

泌出胞外，分離純化工藝相對(duì)簡(jiǎn)單。釀酒酵母真核真核細(xì)胞第40頁(yè)/共126頁(yè)絲狀真菌特點(diǎn)：有很強(qiáng)的蛋白分泌能力；能正確進(jìn)行翻譯后加工，包括肽剪切和糖基化等，而且其糖基化方式與高等真核生物相似；絲狀真菌（如曲霉等）等又確認(rèn)是安全菌株，有成熟的發(fā)酵和后處理工藝哺乳動(dòng)物細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞由于外源基因的表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)成分完全由人控制，從而使產(chǎn)物純化變得容易。哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的基因產(chǎn)物是糖基化的，接近或類似于天然產(chǎn)物。但動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)慢，產(chǎn)率低，且培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液濃度較稀。第41頁(yè)/共126頁(yè)表達(dá)體系綜述雖然各種微生物從理論上來(lái)說(shuō)都可以用于基因表達(dá)，但由于克隆載體、DNA導(dǎo)入方法以及遺傳背景等方面的限制，目前使用最廣泛的宿主菌還是大腸桿菌

和酵母。一方面它們的遺傳背景研究得比較清楚，建立了許多適合它們的克隆載體和DNA導(dǎo)入方法，另一方面許多外源基因在這兩種宿主菌中表達(dá)成功，積累了許多實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)。當(dāng)然，現(xiàn)在我們不僅要繼續(xù)利用大腸桿菌和酵母，研究清除影響基因表達(dá)的各種因素之間的關(guān)系，提出更有效的解決方法，而且還要尋找更好的適合于不同外源基因表達(dá)的微生物宿主菌。第42頁(yè)/共126頁(yè)大腸桿菌表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)：積累了充足經(jīng)驗(yàn)，有多種載體可供應(yīng)用；操作安全，致病能力低；技術(shù)操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，成本相對(duì)低得多，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)；真核生物的基因先在原核體系上構(gòu)建克隆，稱為亞克?。╯ub-clone），然后采用其它方式轉(zhuǎn)移至真核細(xì)胞上表達(dá)。2.大腸桿菌體系中的基因表達(dá)第43頁(yè)/共126頁(yè)2.1載體表達(dá)載體必須具備的條件載體能獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制：載體本身就是一個(gè)復(fù)制子，具有復(fù)制起點(diǎn)，分為嚴(yán)緊型和松弛型，前者伴隨染色體的復(fù)制而復(fù)制，在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)僅1~3個(gè)，后者的復(fù)制不依賴于宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)可高達(dá)3000個(gè)應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆、鑒定和篩選，且克隆位點(diǎn)位于啟動(dòng)子序列后，以便外源基因表達(dá)應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識(shí)別。第44頁(yè)/共126頁(yè)2.1載體表達(dá)載體必須具備的條件應(yīng)具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其他無(wú)關(guān)的基因，同時(shí)，很強(qiáng)的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號(hào)，即起始密碼AUG和SD序列，以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。第45頁(yè)/共126頁(yè)第46頁(yè)/共126頁(yè)pBV220系統(tǒng)（質(zhì)粒載體系統(tǒng)）特點(diǎn)：質(zhì)粒拷貝數(shù)較多，小量簡(jiǎn)便快速抽提可滿足需求。溫度誘導(dǎo)，外源基因的表達(dá)量可達(dá)到細(xì)胞總蛋白的20%-30%.正常情況下，產(chǎn)物以包含體的形式存在與細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)產(chǎn)物不易被降解，均一性好。pBV220系統(tǒng)大腸桿菌常用載體第47頁(yè)/共126頁(yè)特點(diǎn)：克隆宿主與表達(dá)宿主分離?？芍苯硬迦?。表達(dá)量可達(dá)總蛋白的50%。有NedI，NcoI酶切位點(diǎn)，切開后直接出現(xiàn)ATG用于表達(dá)。帶有組氨酸標(biāo)簽，可用于純化。

pET系統(tǒng)pET系統(tǒng)第48頁(yè)/共126頁(yè)2.2提高目的基因在大腸桿菌中的表達(dá)提高翻譯水平：增加mRNA的穩(wěn)定性；調(diào)整SD序列與ATG之間的距離；

選擇偏好性密碼子。生長(zhǎng)與表達(dá)過(guò)程分離：減少宿主菌的代謝負(fù)荷，讓宿主菌專一性的復(fù)制

重組合質(zhì)粒達(dá)到一定數(shù)量后再誘導(dǎo)表達(dá)。提高表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性：組建融合蛋白；定點(diǎn)突變，改變二硫鍵位置；選

用突變菌種；采用表達(dá)分泌蛋白的載體（信號(hào)肽，

從胞質(zhì)到間質(zhì)）。第49頁(yè)/共126頁(yè)2.3真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式融合蛋白的形式短的原核多肽與真核蛋白結(jié)合，氨基端為原核序列，羧基端為真核系列。不易被降解，操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定，高表達(dá)，只能做抗原。非融合蛋白形式不存在細(xì)菌肽，完全是外源蛋白形式，容易被降解，有甲硫氨酸，易發(fā)生免疫發(fā)應(yīng)。分泌型蛋白不含起始密碼子編碼的甲硫氨酸，直接能分泌到胞外。但產(chǎn)量不高，信號(hào)肽不易被切除。第50頁(yè)/共126頁(yè)3.酵母體系中的基因表達(dá)酵母具有原核生物和真核生物的雙重特點(diǎn)，與大腸桿菌不同的是酵母可以對(duì)異源蛋白進(jìn)行簡(jiǎn)單地翻譯后加工。與哺乳動(dòng)物不同的是酵母可以在簡(jiǎn)單培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在各種酵母工程菌中釀酒酵母應(yīng)用最為廣泛。與其它表達(dá)系統(tǒng)一樣，酵母表達(dá)體系也包括載體、啟動(dòng)子等控制序列和宿主細(xì)胞3個(gè)部分。第51頁(yè)/共126頁(yè)3.1載體附加體質(zhì)粒（YEP）復(fù)制型質(zhì)粒（YRP）著絲粒質(zhì)粒（YCP）整合型質(zhì)粒（YIP）第52頁(yè)/共126頁(yè)3.1載體①YEp類（yeastepisomalplasmid，酵母附加體質(zhì)粒）最為常用。這類載體的復(fù)制序列為酵母2質(zhì)粒成分。2質(zhì)粒:是多數(shù)釀酒酵母中天然存在的質(zhì)粒，可獨(dú)立復(fù)制。將2質(zhì)粒中復(fù)制起點(diǎn)區(qū)及REp3基因區(qū)的序列引入載體，就足以維持在大多數(shù)酵母株系中的復(fù)制能力。以2質(zhì)粒為基礎(chǔ)的載體，因具有較高的拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)化頻率和穩(wěn)定性而被廣泛使用第53頁(yè)/共126頁(yè)②YRp類（yeastreplicationplasmid，酵母復(fù)制型質(zhì)粒）復(fù)制序列是非2來(lái)源的自主復(fù)制序列，可來(lái)自酵母染色體，也可來(lái)自其他生物。此類載體穩(wěn)定性差，拷貝數(shù)也少。③YCp類（yeastcentromericplasmid，酵母著絲粒質(zhì)粒）:可以部分整合到染色體中，在子代細(xì)胞中精確地分配，因此有很好的穩(wěn)定性。但它們的拷貝數(shù)只有1個(gè)。④YIp類（yeastinteegrativeplasmid，酵母整合型質(zhì)粒）

此類載體含有可與酵母染色體重組的序列，可以完全整合到染色體中一同復(fù)制，穩(wěn)定性好，拷貝數(shù)只有一個(gè)。第54頁(yè)/共126頁(yè)3.2啟動(dòng)子啟動(dòng)子是外源基因表達(dá)的關(guān)鍵構(gòu)件。酵母表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用的啟動(dòng)子種類很多主要包括：

組成型誘導(dǎo)型分泌型復(fù)合型第55頁(yè)/共126頁(yè)4.桿狀病毒表達(dá)體系桿狀病毒可在真核細(xì)胞中大量表達(dá)外源蛋白，應(yīng)用廣泛，主要特點(diǎn)有：為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對(duì)蛋白進(jìn)行修飾，加工，轉(zhuǎn)運(yùn)，近似天然蛋白。利用多角體強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)體系，高效表達(dá)外源蛋白。病毒基因組較大，可以插入較大的DNA片段。在同一個(gè)感染的昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)多個(gè)外源蛋白。不感染脊椎動(dòng)物，安全性高。第56頁(yè)/共126頁(yè)5.哺乳動(dòng)物表達(dá)體系由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)部存在質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，所以只能利用可以感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒作為載體，攜帶外源基因進(jìn)入進(jìn)行復(fù)制表達(dá)。表達(dá)體系主要的組成部件包括：原核DNA序列啟動(dòng)子增強(qiáng)子拼接信號(hào)終止信號(hào)篩選信號(hào)報(bào)告基因第57頁(yè)/共126頁(yè)

主要基因工程表達(dá)體系比較表達(dá)體系產(chǎn)物產(chǎn)生部位培養(yǎng)方式提純產(chǎn)物活性潛在危性大腸桿菌多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易一般對(duì)原核好不大融合蛋白質(zhì)部分高產(chǎn)對(duì)真核差酵母多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易菌體內(nèi)真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高產(chǎn)稍復(fù)雜天然產(chǎn)物哺乳動(dòng)物完整外分泌較難成本高簡(jiǎn)單可達(dá)天然需注意糖基化蛋白可高產(chǎn)產(chǎn)物致癌第58頁(yè)/共126頁(yè)基因工程下游技術(shù)主要包括工程細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，目的蛋白的分離純化兩個(gè)方面。主要步驟和階段：

1.培養(yǎng)液的培養(yǎng)與預(yù)處理

2.初步純化（粗提）

3.高度純化（純化）

4.最后純化（精制）工程菌的培養(yǎng)和預(yù)處理下游操作的一般流程第59頁(yè)/共126頁(yè)工程菌的培養(yǎng)培養(yǎng)的設(shè)備機(jī)械攪拌罐：常規(guī)發(fā)酵罐，用于好氧菌培養(yǎng)，放大技術(shù)成熟，攪拌

易傷害發(fā)酵細(xì)胞。氣體提升式發(fā)酵罐：利用氣體的升力帶動(dòng)流體在整個(gè)發(fā)酵罐內(nèi)循環(huán)，

能避免機(jī)械攪動(dòng)造成的細(xì)胞損傷。固定床反應(yīng)器：發(fā)酵時(shí)氣泡的表面張力會(huì)破壞細(xì)胞，為防止兩者接

觸常采用固定板床反應(yīng)器，將細(xì)胞固定在載體上，

并通過(guò)微孔氣體分布器將空氣很細(xì)的分布在培養(yǎng)液

中不產(chǎn)生氣泡。第60頁(yè)/共126頁(yè)培養(yǎng)方式補(bǔ)料分批培養(yǎng)：是指將種子接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)一段時(shí)間后，間歇的補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的培養(yǎng)方法。避免一次性高濃度基質(zhì)加入對(duì)菌體造成的抑制作用。使細(xì)胞生長(zhǎng)或產(chǎn)物形成處于最佳狀態(tài)。連續(xù)培養(yǎng)：

在連續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基的同時(shí)連續(xù)放出發(fā)酵液。使菌體所處的生長(zhǎng)，發(fā)酵環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，能促使細(xì)胞不斷生長(zhǎng)合產(chǎn)物不斷形成，連續(xù)收獲產(chǎn)物，對(duì)分泌性和非分泌型蛋白都適用。工程菌的培養(yǎng)第61頁(yè)/共126頁(yè)培養(yǎng)方式透析培養(yǎng)：利用半透膜原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離通過(guò)去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來(lái)解除其對(duì)菌體的不利影響。固定化培養(yǎng)：將菌體固定在特定載體上能有效提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性，便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。在連續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基的同時(shí)連續(xù)放出發(fā)酵液。使菌體所處的生長(zhǎng)，發(fā)酵環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，能促使細(xì)胞不斷生長(zhǎng)合產(chǎn)物不斷形成，連續(xù)收獲產(chǎn)物，對(duì)分泌性和非分泌型蛋白都適用。工程菌的培養(yǎng)第62頁(yè)/共126頁(yè)發(fā)酵過(guò)程的影響因素

⒈培養(yǎng)基的影響

培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長(zhǎng)速率，又要保持工程菌的穩(wěn)定性，使外源基因高效表達(dá)。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、氨水、硫酸

銨、氯化銨等。還有無(wú)機(jī)鹽、維生素等工程菌的培養(yǎng)第63頁(yè)/共126頁(yè)⒉接種量的影響

接種量是指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。接種量?。壕w延遲期較長(zhǎng)，使菌齡老化，不利于外源基因表達(dá)。接種量大：可縮短生長(zhǎng)延遲期，菌體迅速繁衍，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)

期，適于表達(dá)外源基因接種量過(guò)高，使菌體生長(zhǎng)過(guò)快，

代謝物積累過(guò)多，反而會(huì)抑制后期菌體的生長(zhǎng)。第64頁(yè)/共126頁(yè)3.溫度的影響

溫度對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用表現(xiàn)在對(duì)復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯和小分子調(diào)節(jié)分子的合成等水平的影響。它影響各種酶的反應(yīng)速度，改變菌體代謝產(chǎn)物的反應(yīng)方向。高溫或低溫都會(huì)使發(fā)酵異常，影響終產(chǎn)物的形成并導(dǎo)致減產(chǎn)溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成。是工程菌發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中影響菌體代謝的一個(gè)重要參數(shù)。對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成都有著很大的影響。對(duì)于好氧發(fā)酵，溶解氧濃度是重要的參數(shù)。好氧微生物利用溶解于培養(yǎng)液中的氧氣進(jìn)行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，則能提高發(fā)酵產(chǎn)率。4.溶氧第65頁(yè)/共126頁(yè)5.誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響一般在工程菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行加溫或加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞快速繁殖，菌群數(shù)目倍增，對(duì)營(yíng)養(yǎng)和氧的需求激增，對(duì)于營(yíng)養(yǎng)和溶氧要求很高。

pH對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和外源蛋白的高效表達(dá)都有影響，所以應(yīng)根據(jù)工程菌的生長(zhǎng)和代謝情況，對(duì)pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)如采取兩段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期重點(diǎn)是優(yōu)化工程菌的生長(zhǎng)條件，其最佳pH在6.8～7.4左右；培養(yǎng)后期重點(diǎn)是優(yōu)化外源蛋白的表達(dá)條件,其最佳pH為6.0～6.5。6.

pH值第66頁(yè)/共126頁(yè)目標(biāo)產(chǎn)物的分離主要包括兩個(gè)階段。產(chǎn)物的初級(jí)分離階段:任務(wù)是分粒細(xì)胞和培養(yǎng)液，破碎細(xì)胞釋放內(nèi)容物，溶解包涵體，復(fù)性蛋白質(zhì)，濃縮產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)。精制純化階段：在初級(jí)分離基礎(chǔ)上，利用各種高選擇手段（各種色譜方法）將目標(biāo)產(chǎn)物和干擾雜質(zhì)盡可能的分開，使產(chǎn)物的純度達(dá)到相關(guān)要求，最后制成可以儲(chǔ)存，運(yùn)輸和使用的產(chǎn)品。細(xì)胞破碎與固液分離細(xì)胞破碎與固液分離屬于初級(jí)分離階段第67頁(yè)/共126頁(yè)細(xì)胞破碎按照是否加作用力分為機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法。機(jī)械破碎法：高壓勻漿法、超聲破碎法、高速珠磨法、

高壓擠壓法。非機(jī)械破碎法：酶溶法、化學(xué)滲透法、熱處理法、滲透壓沖擊法。第68頁(yè)/共126頁(yè)固液分離分離細(xì)胞碎片可以用離心，膜過(guò)濾或雙水相分配的方法。離心：高速離心，超速離心。膜過(guò)濾：微濾，超濾，反滲透。雙水相萃?。簩⑵扑楹蟮募?xì)胞懸液與聚乙二醇-無(wú)機(jī)鹽混合，然后

離心分相。

第69頁(yè)/共126頁(yè)精制純化主要是各種色譜分離方法：名稱分離原理吸附層析法組份在吸附劑表面吸附，固定相是固體吸附劑，各能力不同分配層析法各組份在流動(dòng)相和靜止液相（固相）中的分配系數(shù)不同離子交換層析法固定相是離子交換劑，各組份與離子交換劑親和力不同凝膠層析法固定相是多孔凝膠，各組份的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同親和層析法固定相只能與一種待分離組份專一結(jié)合，以此和無(wú)親和力的其它組份分離第70頁(yè)/共126頁(yè)純度及活性檢測(cè)純度檢測(cè)電泳法，色譜法，質(zhì)譜法，和末端氨基酸分析法?；钚詸z測(cè)

免疫學(xué)檢測(cè)：放射免疫，酶標(biāo)法

生物檢測(cè)：抗原抗體反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞，組織和動(dòng)物的生物功能影響。第71頁(yè)/共126頁(yè)第三節(jié)舉例第72頁(yè)/共126頁(yè)hGM-CSF第73頁(yè)/共126頁(yè)IFN-α第74頁(yè)/共126頁(yè)4選擇分離純化方法的依據(jù)（1）根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來(lái)選擇

①分泌型的表達(dá)：產(chǎn)物通常體積比較大、濃度低，因此必須在純化之前進(jìn)行濃縮處理，以盡快縮小樣品的體積，濃縮的方法可用沉淀和超濾第75頁(yè)/共126頁(yè)②可溶性表達(dá)產(chǎn)物：產(chǎn)物破菌后，其上清液首選親和層析的分離方法，若無(wú)單克隆抗體或特異性的配基可用，一般選用離子交換色譜，處于極端等電點(diǎn)的蛋白用離子交換分離可以得到較好的分離效果，能去除大部分的雜質(zhì)第76頁(yè)/共126頁(yè)③周質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物：周質(zhì)表達(dá)是介于細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)和分泌表達(dá)之間的一種形式獲得：菌體經(jīng)溶菌酶破碎后，一般采用滲透壓休克的方法獲得滲透壓休克:突然改變滲透壓并使細(xì)胞發(fā)生物理性破裂第77頁(yè)/共126頁(yè)④不溶性的表達(dá)產(chǎn)物（包含體）獲得：通過(guò)離心，得到變性的包含體，再通過(guò)復(fù)性劑促使包含體復(fù)性，得到目的產(chǎn)品第78頁(yè)/共126頁(yè)（2）根據(jù)單元之間的銜接來(lái)選擇正確選擇分離純化的次序：盡早采用高效的分離手段，去除主要雜質(zhì)；昂貴、費(fèi)時(shí)的分離單元在最后階段通常先選用非特異性、低分辨率的操作單元，如沉淀、超濾和吸附等，這一階段主要目的是盡快縮小樣品的體積，提高產(chǎn)物的濃度，去除主要的雜質(zhì)隨后采用高分辨率的操作單元，如具有高選擇性的離子交換和親和色譜凝膠過(guò)濾色譜這類分離規(guī)模小、分離速度慢的操作單元放在最后，可以提高分辨效率第79頁(yè)/共126頁(yè)（3）根據(jù)分離純化工藝的要求來(lái)選擇①具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性②要盡可能減少組成工藝的步驟③組成工藝的各技術(shù)或步驟之間要相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)、工藝和設(shè)備也能相互適應(yīng)，從而減少步驟之間對(duì)物理的處理和條件的調(diào)整第80頁(yè)/共126頁(yè)（3）根據(jù)分離純化工藝的要求來(lái)選擇④工藝過(guò)程中盡量少的使用試劑⑤時(shí)間盡可能短⑥工藝和技術(shù)必須高效、高收率、易操作，對(duì)設(shè)備要求低、能耗低⑦具有較高安全性（能去除有危險(xiǎn)的污染）第81頁(yè)/共126頁(yè)第十一節(jié)變性蛋白的復(fù)性包含體：重組蛋白在E.coil中的高水平表達(dá)經(jīng)常導(dǎo)致蛋白聚集而形成不溶的、無(wú)活性的顆粒，即包含體第82頁(yè)/共126頁(yè)大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白易形成包含體

高效表達(dá)的目的蛋白在大腸桿菌內(nèi)形成大量無(wú)活性包含體因無(wú)法有效的解決復(fù)性問(wèn)題，在美國(guó)每年造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)幾十億美元

包含體電鏡圖第83頁(yè)/共126頁(yè)包涵體的組成與特性：

一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等

一般得到包涵體后要進(jìn)行超生破菌、與可溶性蛋白分離、洗滌、變性溶解、復(fù)性，最終拿到你的相對(duì)比較純的目的蛋白第84頁(yè)/共126頁(yè)包含體可以富集目的蛋白、抗蛋白酶、對(duì)宿主的毒性小包含體蛋白復(fù)性率低，大大增加了提取成本解決方法：①使重組蛋白在E.coil中表達(dá)成可溶性的活性形式②優(yōu)化包含體的復(fù)性第85頁(yè)/共126頁(yè)一包含體形成的原因高水平表達(dá)的結(jié)果①重組蛋白高水平表達(dá)時(shí)，新生肽鏈的聚集速率超過(guò)了蛋白的正確折疊速率導(dǎo)致了包含體的形成②重組蛋白表達(dá)時(shí)，缺乏一些蛋白在折疊過(guò)程中需要的酶和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶

第86頁(yè)/共126頁(yè)二包含體的分離和溶解包含體的分離：①收集重組菌進(jìn)行破碎（高壓勻漿、超聲破碎等），還可加入一定的溶菌酶

包含體抗剪切力，保持完整結(jié)構(gòu)②離心除去破碎上清后的沉淀部分用含有低濃度的變性劑（尿、鹽酸胍）、去垢劑等緩沖溶液洗滌如需要對(duì)包含體進(jìn)行純化，還可采用蔗糖密度梯度離心的方法第87頁(yè)/共126頁(yè)二包含體的分離和溶解包含體的溶解打斷包含體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使得多肽鏈伸展強(qiáng)的變性劑：脲、鹽酸胍或硫氰酸鹽

鹽酸胍優(yōu)于脲，因?yàn)辂}酸胍是較強(qiáng)的變性劑、而且脲中常含有異氰酸鹽或酯會(huì)不可逆地修飾蛋白質(zhì)的氨基或巰基第88頁(yè)/共126頁(yè)蛋白質(zhì)復(fù)性概念將蛋白質(zhì)從結(jié)構(gòu)不規(guī)則、無(wú)活性的狀態(tài)，恢復(fù)到有唯一立體結(jié)構(gòu)、有生物活性的狀態(tài)的過(guò)程稱為蛋白質(zhì)復(fù)性。三包含體蛋白復(fù)性的方法第89頁(yè)/共126頁(yè)三包含體蛋白復(fù)性的方法稀釋、透析復(fù)性法：除去變性劑、還原劑，促進(jìn)蛋白復(fù)性二硫鍵的復(fù)性：①空氣氧化法：利用空氣中的氧氣在折疊期間氧化巰基，金屬離子的存在具有催化作用

②加入氧化-還原轉(zhuǎn)換試劑③復(fù)性前后，氧化型與還原型試劑的恰當(dāng)使用封閉蛋白的疏水簇復(fù)性：疏水簇的存在增加了聚集，用特異性結(jié)合疏水簇的單克隆抗體來(lái)封閉疏水簇，可減少分子間結(jié)合引起的聚集

第90頁(yè)/共126頁(yè)凝膠過(guò)濾層析復(fù)性：①層析介質(zhì)的隔離作用，降低了蛋白之間相互作用產(chǎn)生的凝集，提高了復(fù)性濃度和復(fù)性率②蛋白經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾層析本身可以得到一定的純化小分子添加劑復(fù)性：小分子添加劑可以防止蛋白的凝集①穩(wěn)定蛋白的活性狀態(tài)、降低了非正確折疊分子的穩(wěn)定性，增加了折疊中間體的穩(wěn)定性②添加劑并不加快折疊速率，只抑制凝集的發(fā)生第91頁(yè)/共126頁(yè)分子伴侶或折疊酶復(fù)性：

分子伴侶：一類在序列上沒(méi)有相關(guān)性但有共同功能的蛋白質(zhì)，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)幫助其他含多肽的結(jié)構(gòu)完成正確的組裝，而且在組裝完畢后與之分離，不構(gòu)成這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)執(zhí)行功能時(shí)的組份應(yīng)用分子伴侶和折疊酶在體外幫助蛋白復(fù)性可以提高復(fù)性率，但分離較為繁瑣，增加成本人工分子伴侶復(fù)性可加入去垢劑等，形成蛋白-去垢劑復(fù)合體，復(fù)合體的形成抑制蛋白的聚集，加入環(huán)糊精去除去垢劑，促使蛋白折疊第92頁(yè)/共126頁(yè)透析法:簡(jiǎn)單;但費(fèi)時(shí),費(fèi)緩沖液,蛋白質(zhì)濃度不能過(guò)高(容易產(chǎn)生沉淀)快速稀釋法:

最常用的小規(guī)模復(fù)性方法;但比較費(fèi)時(shí),費(fèi)緩沖液,蛋白質(zhì)的濃度不能高(容易產(chǎn)生沉淀)

超濾透析法:比較省緩沖液,處理量大;但費(fèi)時(shí),要控制好蛋白質(zhì)濃度凝膠過(guò)濾法:

快速,可重復(fù)性高,不會(huì)產(chǎn)生沉淀,操作復(fù)雜一點(diǎn)分子伴侶或折疊酶法：復(fù)性率率高，

但分離較為繁瑣，增加成本包含體來(lái)源蛋白質(zhì)的復(fù)性第93頁(yè)/共126頁(yè)①活性蛋白回收率高②正確產(chǎn)物易于分離③折疊復(fù)性后能得到濃度較高的蛋白產(chǎn)品④折疊復(fù)性方法易于放大⑤復(fù)性過(guò)程耗時(shí)少有效理想的折疊復(fù)性方法的特點(diǎn)第94頁(yè)/共126頁(yè)第十二節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制基因工程產(chǎn)品相對(duì)于一般藥品，有著許多不同之處①活的細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)來(lái)制備產(chǎn)品，產(chǎn)品分子質(zhì)量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜②具有顯著效應(yīng)，在微量情況下就可以發(fā)揮作用，因此，產(chǎn)品的任何性質(zhì)或數(shù)量上的偏差，都可能貽誤病情甚至造成嚴(yán)重的傷害③雜質(zhì)多，需嚴(yán)格控制產(chǎn)品的有效性、安全性、均一性第95頁(yè)/共126頁(yè)第十二節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制一原材料的控制原材料的質(zhì)量是要確保藥品的DNA序列的準(zhǔn)確性，重組微生物來(lái)自單一克隆，所用質(zhì)量純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性，所以原材料的質(zhì)量控制主要是對(duì)目的基因、表達(dá)載體已經(jīng)宿主細(xì)胞的檢查第96頁(yè)/共126頁(yè)1目的基因

①需明確目的基因的來(lái)源、克隆經(jīng)過(guò)②對(duì)于改造過(guò)的基因應(yīng)說(shuō)明被修飾改過(guò)的密碼子、被切除的肽段及拼接方法③使用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到的基因，應(yīng)說(shuō)明擴(kuò)增的模板、引物及酶反應(yīng)等情況，并以限制性內(nèi)切酶圖譜和核苷酸序列等分析方法確證基因結(jié)構(gòu)的正確無(wú)誤第97頁(yè)/共126頁(yè)2表達(dá)載體

應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及其組成部分（如復(fù)制子、啟動(dòng)子等）的來(lái)源與功能，構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)記等第98頁(yè)/共126頁(yè)3宿主細(xì)胞

①需提供宿主細(xì)胞的的名稱、來(lái)源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性②需闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)，是否整合到染色體內(nèi)及拷貝數(shù)，并證明宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性③提供載體插入基因與表達(dá)載體兩側(cè)控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過(guò)程中，啟動(dòng)與控制克隆基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法和水平第99頁(yè)/共126頁(yè)第十二節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制二培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制

貯存中要求種子純而穩(wěn)定培養(yǎng)過(guò)程中，要求質(zhì)粒穩(wěn)定生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定，能排除外源微生物污染第100頁(yè)/共126頁(yè)1生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)

基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)采用種子批細(xì)胞系統(tǒng)。需證明種子批不含致癌物質(zhì)，無(wú)細(xì)菌、病毒、霉菌和支原體等污染，再由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫(kù)在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)內(nèi)，不得同時(shí)操作兩種不同的細(xì)胞或菌種，一個(gè)工作人員不得同時(shí)操作兩種細(xì)胞或菌種第101頁(yè)/共126頁(yè)2培養(yǎng)過(guò)程

培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)測(cè)定被表達(dá)基因分子的完整性及宿主細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)后的基因型特征培養(yǎng)周期結(jié)束后，應(yīng)監(jiān)測(cè)宿主細(xì)胞/載體系統(tǒng)的特性：比如：質(zhì)粒拷貝數(shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體殘留程度、含插入基因的載體的酶切圖譜等第102頁(yè)/共126頁(yè)第十二節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制三純化過(guò)程的質(zhì)量控制保證提純分子批次間保持一致、提純過(guò)程中能去除有害物質(zhì)和熱源質(zhì)純化工藝的每一步完成后均應(yīng)測(cè)定收獲物純度，計(jì)算提純倍數(shù)、收獲率等，要對(duì)每一步的純化效率、活性回收率和蛋白回收率進(jìn)行檢測(cè)，只有當(dāng)這兩種回收率呈正相關(guān)時(shí)，純化過(guò)程才是有效、可行的第103頁(yè)/共126頁(yè)四目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制

基因工程的質(zhì)量控制主要包括這些：產(chǎn)品的理化性質(zhì)的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性第十二節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制第104頁(yè)/共126頁(yè)1生物活性的測(cè)定

多肽或蛋白質(zhì)藥物的生物活性是蛋白質(zhì)藥物的重要質(zhì)量控制指標(biāo)生物學(xué)效價(jià)的測(cè)定必須采用國(guó)際上通用的方法采用在動(dòng)物體內(nèi)或通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行體外效價(jià)測(cè)定重組蛋白是抗原，具有相應(yīng)的抗體或單克隆抗體，可采用放射性免疫分析法或酶標(biāo)法測(cè)定其免疫學(xué)活性第105頁(yè)/共126頁(yè)2理化性質(zhì)的測(cè)定

采用多種方法對(duì)重組技術(shù)獲得的蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品進(jìn)行全面的鑒定特異性鑒別、非特異性鑒別、相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定、等電點(diǎn)測(cè)定、肽圖分析、氨基酸組成分析、部分氨基酸序列分析、蛋白質(zhì)二硫鍵分析第106頁(yè)/共126頁(yè)3蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

根據(jù)蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定Folin-酚法、染色法、雙縮尿法、紫外吸收法、HPLC法、凱式定氮法質(zhì)量鑒定中常用的方法是：Folin-酚法、染色法第107頁(yè)/共126頁(yè)4蛋白質(zhì)純度分析

蛋白質(zhì)純度分析方法

SDS

等電點(diǎn)聚焦

HPLC

毛細(xì)管電泳第108頁(yè)/共126頁(yè)第109頁(yè)/共126頁(yè)第110頁(yè)/共126頁(yè)5雜質(zhì)檢測(cè)

蛋白類雜質(zhì)：

①純化過(guò)程中殘留的宿主細(xì)胞蛋白，可采用免疫學(xué)的方法測(cè)定

②目的蛋白發(fā)生了某些變化，形成在理化性質(zhì)上與原蛋白極為相似的蛋白雜質(zhì)，比如一些目的蛋白的沉淀等這些目的蛋白的變構(gòu)體在體內(nèi)往往會(huì)產(chǎn)生抗體，因此對(duì)這類雜質(zhì)的質(zhì)量控制也要嚴(yán)格限定第111頁(yè)/共126頁(yè)非蛋白類雜質(zhì)具有生物學(xué)作用的非蛋白類雜質(zhì)主要有：病毒和細(xì)