六種白蛉病毒核蛋白的抗原性和免疫反應性分析,病毒學論文

六種白蛉病毒核蛋白的抗原性和免疫反應性分析,病毒學論文布尼亞病毒科包括約350種RNA病毒,主要分布在5個病毒屬,即漢坦病毒屬、內(nèi)羅病毒屬、正布尼亞病毒屬、白蛉病毒屬和番茄斑萎病毒屬。除番茄斑萎病毒屬外,其余病毒屬均包含可感染脊椎動物和人類的病毒。據(jù)文獻報道,多種白蛉病毒可感染人類,引起從自限性疾病到致死性出血熱等不同程度的后果。在布尼亞病毒科病毒血清學診斷方面,ELISA方式方法簡單快速,敏感性和特異性均較高,可檢測抗原及抗體,是常用的實驗室診斷方式方法。但是由于其受血清學穿插反響的限制,只要部分病毒基于重組核蛋白抗原的實驗室診斷方式方法被建立起來,卻極少有商業(yè)化的ELISA試劑盒問世。本實驗選取立夫特谷熱病毒(Riftvalleyfevervirus,RVFV)、發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(Severefeverwiththrom-bocytopeniasyndromevirus,SFTSV)、哈特蘭德病毒(Heratlandvirus,HLV)、烏庫病毒(Uukuniemivirus,UUKV)、那不勒斯白蛉熱病毒(Sandflyfe-vernaplesvirus,SFNV)及西西里白蛉熱病毒(Sandflyfeversicilianvirus,SFSV)共六種致病性白蛉病毒,以探究其核蛋白的抗原性和免疫反響性,并進行血清學反響比擬研究,旨在為研發(fā)相應的血清學診斷試劑及避免因血清學穿插反響而導致的誤判誤診提供有效根據(jù)。材料與方式方法1、材料Vero細胞購自美國ATCC,本科室傳代保存;SFTSV分離自病人血清,本科室傳代保存;HLV由美國疾病預防控制中心提供,本科室傳代保存;UUKV、SFNV及SFSV由美國疾病預防控制中心提供病毒上清裂解液,本科室保存。RVFV核蛋白基來由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。兔抗-RVFV-NP、SFTSV-NP、HLV-NP、UUKV-NP、SFNV-NP和SFSV-NP多克隆抗體通過原核系統(tǒng)表示出純化的相應病毒核蛋白免疫新西蘭白兔制備。辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔IgG抗體及抗人IgG抗體,堿性磷酸酶(AP)標記的抗兔IgG抗體均購自于美國sigma公司。2、六種白蛉病毒核蛋白的表示出及純化將上述六種病毒NP編碼基因分別克隆至pET30a載體,并轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)細胞,均勻涂布于含50g/mL卡那霉素抗性的固體LB培養(yǎng)基,37℃過夜培養(yǎng)后挑選出正確的克隆并接種至含50g/mL卡那霉素抗性的2xYT培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)至OD值到達0.6后參加IPTG至終濃度為1mM,30℃過夜培養(yǎng)。收獲細胞并將之重懸于結(jié)合緩沖液(20mMTris,500mMNaCl,pH7.5),超聲破碎后離心,上清經(jīng)0.45m濾膜過濾后通過金屬鎳離子螯合層析純化,目的蛋白用洗脫緩沖液(20mMTris,500mMNaCl,500mMImidazole,pH7.5)洗脫收集并于PBS緩液中透析。純化的六種病毒核蛋白經(jīng)SDS鑒定后分裝凍存于-80℃。3、間接ELISA方式方法檢測六種白蛉病毒核蛋白抗原性純化的六種白蛉病毒核蛋白分別以每孔500ng包被96孔ELISA板,六種兔免疫血清和陰性對照兔免疫血清均以1∶500起兩倍稀釋至1∶1024000后分別參加包被反響板中,而五份SFTSV病人的血清和一份正常人的血清均以1∶100起兩倍稀釋至1∶204800后分別參加另外的包被反響板中,稀釋后的血清均以100l/孔加入,37℃溫育1h。PBST洗板后參加相應檢測抗體:HRP標記的羊抗兔IgG抗體(1∶3000稀釋)和羊抗人IgG抗體(1∶1000稀釋),37℃溫育1h;PBST洗板后加TMB顯色,酶標儀測定反響板中每孔液體450nm處的吸光度值(A450)。吸光度值大于陰性對照的2.1倍判定為陽性。4、Western-blotting方式方法檢測六種白蛉病毒核蛋白抗原性將六種白蛉病毒重組核蛋白抗原和陰性對照EV71-VP1抗原進行SDS,恒壓20V轉(zhuǎn)膜后用封閉緩沖液(5%脫脂奶,PBS)室溫封閉1h后,分別參加六種重組核蛋白抗原的兔免疫血清(1∶1000稀釋),室溫反響1h后4℃過夜。PBST洗膜后參加AP標記的抗兔IgG抗體(1∶2000稀釋),室溫反應1h,PBST洗膜后參加顯色劑(BCIP/NBT)顯色。結(jié)果1、六種白蛉病毒核蛋白的表示出與純化表示出六種白蛉病毒核蛋白的菌液經(jīng)收集超聲后,上清與沉淀分別進行SDS檢測,結(jié)果顯示目的蛋白多存于上清中,講明目的蛋白均為可溶性。純化后的六種白蛉病毒核蛋白經(jīng)SDS鑒定,均呈現(xiàn)單一的蛋白條帶,純度到達90%以上,相對分子量RVFV-NP為26kD,SFTSV-NP為27kD,HLV-NP為26kD,UUKV-NP為28kD,SFNV-NP為28kD,SFSV-NP為28kD。結(jié)果如此圖1所示。2、間接ELISA方式方法檢測六種白蛉病毒核蛋白抗原性六種白蛉病毒重組核蛋白抗原兔免疫血清和陰性對照兔免疫血清均以1∶500起兩倍系列稀釋至1∶1024000,結(jié)果顯示每種病毒核蛋白抗原兔免疫血清IgG抗體滴度都能到達1∶512000或以上。同時,每種病毒核蛋白抗原兔免疫血清都與其余五種白蛉病毒重組核蛋白抗原存在穿插反響,穿插反響的ELISA滴度從1∶2000到1∶128000不等,而六種白蛉病毒核蛋白抗原與陰性對照兔免疫血清均無穿插反響。五份SFTSV病人血清和一份正常人血清均以1∶100起兩倍系列稀釋至1∶204800,結(jié)果顯示這5份病人血清IgG抗體滴度都能到達1∶12800,并且1號、2號、3號病人血清分別可與其它1種至4種不等的白蛉病毒重組核蛋白抗原存在穿插反響。而六種白蛉病毒核蛋白抗原與正常人血清均無穿插反響。結(jié)果如表1所示。3、Western-blotting方式方法檢測六種白蛉病毒核蛋白抗原性每種病毒重組核蛋白抗原兔免疫血清都分別與六種白蛉病毒核蛋白抗原進行了免疫印跡雜交。結(jié)果顯示,每種抗原與相應兔免疫血清反響時均可見特異性目的條帶。同時,每種抗原與其余五種免疫兔血清反響時,也在相應位置顯示出特異性條帶,講明六種白蛉病毒核蛋白之間可能存在血清學穿插反響。結(jié)果如此圖2所示。而以EV71-VP1兔免疫血清作為陰性對照未見任何條帶(結(jié)果未顯示)。討論當下,白蛉病毒的流行區(qū)域主要包括非洲、歐州南部、亞洲中部以及北美洲,且有向未流行地區(qū)擴散的趨勢。為避免這種情況愈演愈烈,應當加強病毒流行區(qū)域的防護意識和防控措施。研發(fā)更有效、更便捷、敏感性和特異性更強的診斷試劑也尤為重要。ELISA方式方法方便快速,對儀器設備的要求不高,合適疾病流行區(qū)域十分是偏僻地區(qū)的應用和推廣。很多針對白蛉病毒核蛋白IgG抗體和IgM抗體的實驗室診斷方式方法被建立起來,如立夫特谷熱病毒、托斯卡納病毒、發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒等。但是,到當下為止,僅有一種基于托斯卡納病毒重組核蛋白的ELISA試劑盒商業(yè)化。這主要是由于白蛉病毒屬內(nèi)存在較嚴重血清學穿插反響導致的。因而，探究幾種致病性白蛉病毒核蛋白的抗原性能夠為日后開發(fā)商業(yè)化ELISA診斷試劑盒奠定基礎(chǔ)。本研究通過原核系統(tǒng)表示出并純化了六種致病性白蛉病毒的核蛋白,并將這六種抗原和六種相應的多克隆兔血清兩兩組合,分別利用間接ELISA和Western-blotting方式方法檢測,同時還用這六種抗原通過間接ELISA法檢測了5份SFTS病人血清,以研究這六種致病性白蛉病毒核蛋白的抗原性,并比擬其互相之間的血清學反響情況。實驗結(jié)果表示清楚,對于多克隆兔血清的檢測,無論是間接ELISA法還是Western-blotting法,都提示六種白蛉病毒核蛋白抗原之間可能存在血清學穿插反響;而對于SFTS臨床樣本的檢測結(jié)果而言,也同樣表示清楚血清學穿插反響可能存在。但是,由于缺乏除SFTS以外的實際感染血清,這六種白蛉病毒核蛋白之間能否確實存在血清學穿插反響還需要進一步的驗證。另外,可能的血清學穿插反響提示我們在實際的檢測經(jīng)過中要引起重視,尤其在以ELISA方式方法進行檢測