動物疫病監(jiān)測(診斷)基礎(chǔ)理論知識和方法原理

臨床癥狀病理變化觸片染色鏡檢培養(yǎng)特性生化特性血清學(xué)試驗初步診斷動物回歸試驗確診流行病學(xué)調(diào)查細菌感染的診斷第一頁，共64頁。病毒感染的診斷電鏡技術(shù)血清學(xué)試驗分子生物學(xué)技術(shù)病毒的分離鑒定標(biāo)本采集與送檢第二頁，共64頁。病毒的分離

動物接種是最原始的病毒培養(yǎng)方法，根據(jù)病毒種類不同，選擇敏感動物及適宜接種部位，如嗜神經(jīng)性病毒（狂犬病毒）可接種于小鼠腦內(nèi)，痘病毒可接種于家兔角膜或皮內(nèi)。

第三頁，共64頁。雞胚培養(yǎng)

雞胚對多種病毒敏感。一般采用孵化9-14天的雞胚，根據(jù)病毒種類不同，將病毒標(biāo)本接種于雞胚的不同部位，最常用的雞胚接種部位有羊膜腔、尿囊腔、絨毛尿囊膜和卵黃囊等。病毒的分離第四頁，共64頁。第五頁，共64頁。

組織培養(yǎng)法或細胞培養(yǎng)法是將離體活組織塊或分散的組織細胞加以培養(yǎng)的技術(shù)總稱，為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。病毒的分離第六頁，共64頁。形態(tài)學(xué)檢查電鏡和免疫電鏡檢查

普通光學(xué)顯微鏡檢查

有些病毒在宿主細胞內(nèi)增殖后，在細胞的一定部位(胞核、胞漿或兩者兼有)出現(xiàn)一個或數(shù)個、圓形或橢圓形、嗜酸性或嗜堿性的結(jié)構(gòu)，即包涵體。包涵體對病毒感染的診斷有一定價值。

第七頁，共64頁。病毒感染的血清學(xué)診斷是用已知病毒抗原來檢測病畜血清中有無相應(yīng)抗體，故須待病畜感染后體內(nèi)產(chǎn)生抗體時才能檢出。在采取臨床標(biāo)本及病人血清應(yīng)注意病程，必須采取患畜急性期血清與恢復(fù)期血清(雙份血清)進行血清學(xué)試驗。若第二次血清抗體滴度比第一次高出4倍以上時，才有診斷意義。第八頁，共64頁。現(xiàn)代免疫的概念：是機體識別“自身”與“非己”抗原，對“非己”抗原產(chǎn)生排斥作用，對自身抗原形成天然耐受的一種生理功能。

免疫的定義第九頁，共64頁。免疫的基本特性1識別自身和非自身

這是免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)免疫細胞膜表面的抗原受體+外來抗原的表位識別很精細，包括異種之間，同種不同個體之間2特異性即免疫具有很強的針對性3免疫記憶對相同抗原物質(zhì)的再次進入具有記憶，會產(chǎn)生更快、更強的免疫應(yīng)答。第十頁，共64頁。免疫的基本功能1.抵抗感染指動物機體抵御病原微生物感染和侵襲的能力。免疫功能亢進變態(tài)反應(yīng)免疫功能低下或缺陷機會感染2.自身穩(wěn)定清除機體產(chǎn)生的大量衰老死亡細胞功能異常自身免疫病3.免疫監(jiān)視腫瘤細胞的發(fā)現(xiàn)和清除功能低下或失調(diào)腫瘤發(fā)生第十一頁，共64頁。免疫的類型一、固有免疫：概念：出生時即有的天然免疫，經(jīng)遺傳獲得，非特異性，也稱非特異性/先天性免疫。組成：屏障結(jié)構(gòu)、吞噬細胞、某些體液因子。二、適應(yīng)性免疫：概念：出生后接觸特定抗原獲得的針對該物質(zhì)的免疫，也稱獲得性/特異性免疫。包括：體液免疫、細胞免疫。第十二頁，共64頁。第十三頁，共64頁。第十四頁，共64頁。抗原抗原（Antigen，Ag）：是指進入動物機體后，能刺激機體產(chǎn)生特異性免疫球蛋白或致敏淋巴細胞，并能與其發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)，也就是說具有抗原性的物質(zhì)稱抗原?？乖园▋蓚€方面：1.免疫原性：能刺激機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞的特性。2.反應(yīng)原性：能與由其所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生反應(yīng)的特性。第十五頁，共64頁。免疫球蛋白：是指具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白?？贵w：當(dāng)動物機體受到抗原物質(zhì)刺激后，由B淋巴細胞轉(zhuǎn)化為漿細胞產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白?？贵w第十六頁，共64頁。第十七頁，共64頁。第十八頁，共64頁。第十九頁，共64頁。第二十頁，共64頁。第二十一頁，共64頁。IgG多為單體，占血清免疫球蛋白總量的75%～80%IgG1、IgG2和IgG3的CH2能通過經(jīng)典途徑激活補體IgG是唯一能通過胎盤的抗體通過Fc段與吞噬細胞表面FcR結(jié)合，發(fā)揮調(diào)理作用；與K細胞結(jié)合，發(fā)揮ADCC作用；與葡萄球菌A蛋白結(jié)合。具有抗菌、抗毒和抗病毒作用參與II、III型超敏反應(yīng)IgG第二十二頁，共64頁。為五聚體，是分子量最大的Ig。IgM激活補體能力比IgG強。IgM是抗原刺激后出現(xiàn)最早的抗體，故檢測IgM水平可用于傳染病的早期診斷。IgM是B細胞抗原受體的主要成分。也可參與II、III型超敏反應(yīng)。IgM第二十三頁，共64頁。分為血清型和分泌型兩種，血清型IgA主要由腸系膜淋巴組織中的漿細胞產(chǎn)生。而分泌型IgA(SIgA)是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等處的固有層中漿細胞產(chǎn)生。主要存在于初乳、唾液、淚液，以及呼吸道消化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中。分泌型IgA的合成和主要作用部位在黏膜。IgA第二十四頁，共64頁。血清IgD含量極低。膜性IgD存在于成熟B細胞表面，因此，它是成熟B細胞的主要標(biāo)志。它也是B細胞抗原受體（BCR）。IgD第二十五頁，共64頁。血清中含量最低的抗體。能與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的IgE-Fc受體結(jié)合，介導(dǎo)Ⅰ型超敏反應(yīng)。與抗寄生蟲感染有關(guān)。IgE第二十六頁，共64頁。單克隆抗體——由一個B細胞分化增值的子代細胞（漿細胞）產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇（表位）的抗體。多克隆抗體——采用傳統(tǒng)的免疫方法，將抗原物質(zhì)經(jīng)過不同途徑注入動物體內(nèi)，經(jīng)數(shù)次免疫后采血所獲得的抗血清即為多克隆抗體。人工制備抗體第二十七頁，共64頁。第二十八頁，共64頁。免疫學(xué)試驗技術(shù)

血清學(xué)試驗的類型第二十九頁，共64頁。血清學(xué)反應(yīng)的特點1.特異性與交叉反應(yīng)性2.可逆性：表面的結(jié)合，有可逆性3.適比性：比例合適，反應(yīng)才可見4.階段性：不可見可見反應(yīng)5.條件依賴性：pH，溫度，電解質(zhì)第三十頁，共64頁?？乖贵w結(jié)合除了空間結(jié)構(gòu)互補外，主要以氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水鍵等非共價結(jié)合。Ag+血清(Ab)

Ag-Ab復(fù)合物pH7.0T37℃pH＜3T＞60℃表面性與可逆性第三十一頁，共64頁。Ag和Ab結(jié)合需要適當(dāng)?shù)谋壤?，Ag或Ab過多過少，都不能形成大的Ag-Ab復(fù)合物。Ab過剩Ag過剩比例適當(dāng)，交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)網(wǎng)格學(xué)說適合比例性第三十二頁，共64頁。電解質(zhì)：稀釋抗原、血清常用生理鹽水，但稀釋禽類血清時常用8～10%高滲鹽水。酸堿度：稀釋抗原、血清的溶液pH6.0～8.0均可以，為了穩(wěn)定pH，在抗原抗體反應(yīng)中最好用pH7.0～7.2的磷酸緩沖液作抗原抗體稀釋液。溫度：通常為37℃，適當(dāng)提高反應(yīng)溫度可增加Ag與Ab分子的碰撞機會，加速反應(yīng)的出現(xiàn)影響抗原抗體反應(yīng)的因素第三十三頁，共64頁。凝集試驗定義：細菌、紅細胞等顆粒性抗原，或吸附在膠乳、白陶土和紅細胞的抗原，與相立抗體結(jié)合，在有適當(dāng)電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時間，形成肉眼可見的凝集團塊，稱為凝集試驗。凝集反應(yīng)中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。分類：凝集試驗可根據(jù)抗原的性質(zhì)、反應(yīng)的方式分為直接凝集試驗(簡稱凝集試驗)和間接凝集試驗。第三十四頁，共64頁。一、直接凝集試驗細菌、螺旋體和紅細胞等顆?？乖?，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集。直接凝集試驗分為：玻板凝集試驗和試管凝集試驗。第三十五頁，共64頁。①玻板凝集試驗為一種定性試驗方法：將含有已知抗體的診斷血清(適當(dāng)稀釋)與待檢菌懸液各一滴在玻片上混合，數(shù)分鐘后，如出現(xiàn)顆粒狀或絮狀凝集，即為陽性反應(yīng)。此法簡便、快速，常用于菌種鑒定或ABO血型鑒定。

也可用已知的診斷抗原懸液，檢測待檢血清中是否存在相應(yīng)抗體，如布氏桿菌的玻板凝集反應(yīng)和雞白痢全血平板凝集試驗。第三十六頁，共64頁。②、試管凝集試驗為一種定量試驗方法：常用已知抗原液與一系列稀釋的受檢血清混合，保溫后觀察每管內(nèi)抗原凝集程度。以產(chǎn)生50%凝集的最高稀釋度作為血清中抗體的效價（亦稱為凝集價或滴度）。第三十七頁，共64頁。二、間接凝集試驗將可溶性抗原(或抗體)先吸附于一種與免疫無關(guān)的、一定大小的不溶性顆粒(統(tǒng)稱為載體顆粒)的表面，然后與相應(yīng)抗體(或抗原)作用，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下，所出現(xiàn)的特異性凝集反應(yīng)稱為間接凝集反應(yīng)。根據(jù)所用載體分：①.乳膠凝集試驗②.炭素凝集試驗

③.間接血凝試驗根據(jù)致敏載體用的是抗原或抗體以及凝集反應(yīng)的方式分：①．正向間接凝集反應(yīng)②．反向間接凝集反應(yīng)③．間接凝集抑制反應(yīng)④．協(xié)同凝集反應(yīng)第三十八頁，共64頁。正向間接凝集反應(yīng)用抗原致敏載體以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體可溶性抗原載體顆粒抗體（凝集素）第三十九頁，共64頁。反向間接凝集反應(yīng)用特異性抗體致敏載體以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗原?？贵w可溶性抗原載體顆粒第四十頁，共64頁。間接凝集抑制反應(yīng)診斷試劑為抗原致敏的顆粒載體及相應(yīng)的抗體，用于檢測標(biāo)本中是否存在與致敏抗原相同的抗原。也可用抗體致敏的載體及相應(yīng)的抗原作為診斷試劑，以檢測標(biāo)本中的抗體，此稱反向間接凝集抑制反應(yīng)。第四十一頁，共64頁。協(xié)同凝集反應(yīng)與間接凝集反應(yīng)的原理相似，只是所用載體既非天然的紅細胞，也非人工合成的聚合物顆粒，而是一種金黃色葡萄球菌。

①它的菌體細胞壁中含有A蛋白(SPA)

②SPA具有與IgG的Fc段結(jié)合的特性因此當(dāng)這種葡萄球菌與IgG抗體連接時，就成為抗體致敏的顆粒載體；如與相應(yīng)抗原接觸，即出現(xiàn)反向間接凝集反應(yīng)。適用于細菌和病毒等的直接檢測。第四十二頁，共64頁。

基本原理：許多病毒表面具血凝素，具有凝集某些動物或人紅細胞的特性，稱為血凝現(xiàn)象，可用于鑒定病毒。血凝現(xiàn)象可以被特異性抗體所抑制，稱為血凝抑制現(xiàn)象，利用這種特性可進行血清學(xué)試驗，稱為血凝抑制試驗。病毒的血凝與血凝抑制試驗病毒+雞RBC=凝集（血凝試驗）病毒+特異性抗體+雞RBC=不凝集（血凝抑制試驗）第四十三頁，共64頁。沉淀試驗定義：可溶性抗原(如細菌的外毒素、內(nèi)毒素、病毒的可溶性抗原、血清、組織浸出液等)與相應(yīng)抗體結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的白色沉淀，稱為沉淀試驗。參與沉淀試驗的抗原稱沉淀原，抗體稱為沉淀素。分類：沉淀反應(yīng)可在液體中進行，也可在半固體瓊脂凝膠中進行。第四十四頁，共64頁。液相內(nèi)沉淀反應(yīng)絮狀沉淀反應(yīng)環(huán)狀沉淀反應(yīng)+－抗血清抗原+－抗原抗體第四十五頁，共64頁。凝膠內(nèi)沉淀反應(yīng)免疫擴散技術(shù)免疫電泳技術(shù)單向擴散試驗雙向擴散試驗火箭電泳對流電泳免疫電泳第四十六頁，共64頁。瓊擴試驗

(Agargelprecipitationtest,

AGP)①瓊脂凝膠呈多孔結(jié)構(gòu)，孔內(nèi)充滿水分，l%瓊脂凝膠的孔徑約為85nm，因此可允許各種抗原抗體在瓊脂凝膠中自由擴散。②Ag和Ab在瓊脂凝膠中相遇，在最適比例處結(jié)合成Ag-Ab復(fù)合物，此復(fù)合物因顆粒較大而不能擴散，故形成沉淀帶。第四十七頁，共64頁。中和試驗(病毒、毒素中和試驗)原理：病毒與抗血清中抗體特異結(jié)合后失去感染易感動物、易感雞胚或鴨胚、易感細胞的活性。用途：①.用已知血清檢測病毒——鑒定病毒，診斷病毒病。②.用已知病毒檢測血清抗體——診斷病毒感染，測定病毒免疫血清效價（中和價）。第四十八頁，共64頁。補體結(jié)合試驗1.定義：有補體參與，以綿羊紅細胞和溶血素作指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。2.組成：有2個系統(tǒng)共5種成分

1)檢測系統(tǒng)：包括已知抗原(或抗體)和待測抗體(或抗原)

2)指示系統(tǒng)：包括綿羊紅細胞和溶血素(綿羊紅細胞的特異性抗體)3)補體：取自豚鼠的新鮮血清3.補體結(jié)合反應(yīng)的基本原理1)補體可與任何抗原抗體復(fù)合物相結(jié)合；2)指示系統(tǒng)遇補體后就出現(xiàn)明顯的溶血反應(yīng)。第四十九頁，共64頁。AgAb紅細胞溶血素補體AbAg紅細胞補體溶血素溶血（-）不溶血（+）補體結(jié)合反應(yīng)

第五十頁，共64頁。標(biāo)記免疫技術(shù)免疫酶技術(shù)免疫熒光技術(shù)放射免疫測定免疫膠體金技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫測定二、按標(biāo)記物分類：一、按測定用途分類：免疫組化技術(shù)：用于組織切片或其他標(biāo)本中Ag或Ab的定位。免疫測定技術(shù)：用于液體標(biāo)本中Ag或Ab的測定。第五十一頁，共64頁。免疫酶技術(shù)將酶分子與Ab或Ag分子連接形成穩(wěn)定的結(jié)合物（酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原）不影響：?Ab或Ag的免疫活性?酶的活性1.Ag-Ab反應(yīng)的特異性和敏感性2.酶促反應(yīng)的高效催化性和敏感性原理第五十二頁，共64頁。常用的酶與底物常用酶常用底物反應(yīng)顏色辣根過氧化物酶(HRP)H2O2不溶性供氫體：3,3’二氨基聯(lián)苯胺（DAB）黃褐色可溶性供氫體：鄰苯二胺（OPD）橙黃色堿性磷酸酶(AP)硝基苯磷酸鹽（p-NPP）黃色葡萄糖氧化酶與HRP類似棕色DH2+H2O2D+2H20HRP第五十三頁，共64頁。酶聯(lián)免疫吸附測定一、基本原理①、使Ag或Ab吸附到固相載體表面，并保持其免疫活性。②、使Ag或Ab與某種酶連接成酶標(biāo)Ag或Ab，酶標(biāo)Ag或Ab既保留其免疫活性，又保留酶的活性。③、測定時，把受檢標(biāo)本(測定其中的Ab或Ag)和酶標(biāo)Ag(或Ab)按不同的步驟與固相載體表面的Ab(或Ag)起反應(yīng)。④、通過洗滌將固相載體上未結(jié)合的Ag或Ab去除，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。⑤、加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物。

產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)?？筛鶕?jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析。第五十四頁，共64頁。二、ELISA方法的基本類型●雙抗體（原）夾心法：檢測抗原（體）的常見方法●間接法：檢測抗體的方法●競爭法：檢測抗原或小分子半抗原、抗體

根據(jù)檢測目的和操作步驟不同有三種基本方法第五十五頁，共64頁。間接ELISA

用于測定抗體。用抗原包被固相載體，然后加入待檢血清樣品，經(jīng)孵育一定時間后，若待檢血清中含有特異性的抗體，即與固相載體表面的抗原結(jié)合形成抗原—抗體復(fù)合物。洗滌除去其他成分，再加上酶標(biāo)記的抗抗體，反應(yīng)后洗滌，加入底物，在酶的催化作用下底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。樣品中含抗體越多，出現(xiàn)顏色越快越深。第五十六頁，共64頁。獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加受檢標(biāo)本（抗原）形成固相抗體－抗原復(fù)合物洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)加酶標(biāo)抗體生成抗體—待測抗原—酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體加底物進行酶催化反應(yīng)根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量測定雙抗體夾心法第五十七頁，共64頁。用已知特異性抗體包被固相載體測定管加待測抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合對照管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合分別洗滌除去未結(jié)合的成分加底物顯色分別測定兩管的吸光度值，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比，計算標(biāo)本中待測抗原含量競爭法

第五十八頁，共64頁。ELISA問題解析⑴、實驗室溫度太低；⑵、洗滌液配制不正確或使用了錯誤的洗滌液；⑶、洗滌系統(tǒng)有微生物污染或含有替代洗滌模式；