青霉素發(fā)酵操作手冊

青霉素生產(chǎn)仿真使用手冊北京東方仿真軟件技術(shù)有限公司2023年8月目錄目錄1b5E2RGbCAP第一章背景知識3p1EanqFDPw1.1青霉素的發(fā)現(xiàn)3DXDiTa9E3d1.2青霉素分類及分子結(jié)構(gòu)3RTCrpUDGiT1.3青霉素的單位45PCzVD7HxA1.4作用機(jī)理4jLBHrnAILg1.5青霉素的應(yīng)用5xHAQX74J0X第二章發(fā)酵工藝過程6LDAYtRyKfE2.1菌種介紹6Zzz6ZB2Ltk2.2菌種的保藏6dvzfvkwMI12.3孢子的制備7rqyn14ZNXI2.4種子制備7EmxvxOtOco2.5發(fā)酵培養(yǎng)基介紹7SixE2yXPq52.6滅菌96ewMyirQFL2.7發(fā)酵9kavU42VRUs2.7.1發(fā)酵的過程控制9y6v3ALoS892.7.2防止染菌的要點(diǎn)11M2ub6vSTnP2.7.3空氣系統(tǒng)的規(guī)定110YujCfmUCw2.7.4蒸汽系統(tǒng)的規(guī)定12eUts8ZQVRd第三章提煉工藝過程13sQsAEJkW5T3.1發(fā)酵液預(yù)解決13GMsIasNXkA3.2提取13TIrRGchYzg3.3精制157EqZcWLZNX3.3.1脫色和去熱原質(zhì)15lzq7IGf02E3.3.2結(jié)晶15zvpgeqJ1hk3.4成品鑒定16NrpoJac3v13.5成品分裝171nowfTG4KI第四章操作規(guī)程18fjnFLDa5Zo4.1發(fā)酵工藝過程18tfnNhnE6e54.1.1正常發(fā)酵<過程）18HbmVN777sL4.1.2出料18V7l4jRB8Hs4.1.3發(fā)酵過程中PH值低1983lcPA59W94.1.4發(fā)酵過程中PH值高19mZkklkzaaP4.1.5發(fā)酵過程中溶解氧低19AVktR43bpw4.1.6殘?zhí)菨舛鹊?9ORjBnOwcEd4.1.7發(fā)酵過程中溫度高192MiJTy0dTT4.1.8泡沫高19gIiSpiue7A4.2提煉工藝過程19uEh0U1Yfmh4.2.1預(yù)解決操作19IAg9qLsgBX4.2.2一次BA萃取操作20WwghWvVhPE4.2.3一次反萃取操作21asfpsfpi4k4.2.4二次BA萃取操作21ooeyYZTjj14.2.5脫色罐操作22BkeGuInkxI4.2.6結(jié)晶罐及抽濾、干燥操作23PgdO0sRlMo第五章重要操作畫面253cdXwckm155.1青霉素工藝流程界面25h8c52WOngM5.2菌種介紹界面26v4bdyGious5.3孢子制備界面26J0bm4qMpJ95.4種子制備界面27XVauA9grYP5.5滅菌界面28bR9C6TJscw5.6培養(yǎng)基制備界面28pN9LBDdtrd5.7發(fā)酵工藝操作界面29DJ8T7nHuGT5.8發(fā)酵罐操作界面29QF81D7bvUA5.9菌種曲線界面304B7a9QFw9h5.10預(yù)解決界面31ix6iFA8xoX5.11提取流程總貌31wt6qbkCyDE5.12一次BA萃取界面32Kp5zH46zRk5.13精制流程總貌32Yl4HdOAA615.14脫色操作界面33ch4PJx4BlI5.15結(jié)晶操作界面33qd3YfhxCzo5.16抽濾、干燥操作界面34E836L11DO55.17成品鑒定界面35S42ehLvE3M5.18成品分裝界面35501nNvZFis第六章重要工藝指標(biāo)36jW1viftGw9第七章重要設(shè)備列表及仿真操作設(shè)備38xS0DOYWHLP第八章思考題40LOZMkIqI0w第一章背景知識1.1青霉素的發(fā)現(xiàn)1928年，英國細(xì)菌學(xué)家Fleming發(fā)現(xiàn)污染在培養(yǎng)葡萄球菌的雙蝶上的一株霉菌能殺死周邊的葡萄球菌。他將此霉菌分離純化后得到的菌株經(jīng)鑒定為點(diǎn)青霉，并將這菌所產(chǎn)生的抗生物質(zhì)命名為青霉素。ZKZUQsUJed1940年，英國Florey和Chain進(jìn)一步研究此菌，并從培養(yǎng)液中制出了干燥的青霉素制品。經(jīng)實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)證明，它毒性很小，并對一些革蘭氏陽性菌所引起的許多疾病有卓越的療效。dGY2mcoKtT1.2青霉素分類及分子結(jié)構(gòu)青霉素是6－氨基青霉烷酸<6-aminopenicillanicacid,6-APA）苯乙酰衍生物。側(cè)鏈基團(tuán)不同，形成不同的青霉素，重要是青霉素G。工業(yè)上應(yīng)用的有鈉、鉀、普魯卡因、二芐基乙二胺鹽。青霉素發(fā)酵液中具有5種以上天然青霉素<如青霉素F、G、X、K、F和V等），它們的差別僅在于側(cè)鏈R基團(tuán)的結(jié)構(gòu)不同，其中青霉素G在醫(yī)療中用得最多，它的鈉或鉀鹽為治療革蘭氏陽性菌的首選藥物，對革蘭氏陰性菌也有強(qiáng)大的克制作用。青霉素的結(jié)構(gòu)通式可表達(dá)為rCYbSWRLIA1.3青霉素的單位目前國際上青霉素活性單位表達(dá)方法有兩種：一是指定單位<unit）；二是活性質(zhì)量<μg），最早為青霉素規(guī)定的指定單位是：50mL肉湯培養(yǎng)基中恰能克制標(biāo)準(zhǔn)金葡萄菌生長的青霉素量為一個青霉素單位。在以后，證明了一個青霉素單位相稱于0.6μg青霉素鈉。因此青霉素的質(zhì)量單位為:0.6μg青霉素鈉等于1個青霉素單位。由此，1mg青霉素鈉等于1670個青霉素單位(unit>。FyXjoFlMWh1.4作用機(jī)理已有的研究認(rèn)為，青霉素的抗菌作用與克制細(xì)胞壁的合成有關(guān)。細(xì)菌的細(xì)胞壁是一層堅(jiān)韌的厚膜，用以抵抗外界的壓力，維持細(xì)胞的形狀。細(xì)胞壁的里面是細(xì)胞膜，膜內(nèi)裹著細(xì)胞質(zhì)。細(xì)菌的細(xì)胞壁重要由多糖組成，也具有蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的組成是肽聚糖占細(xì)胞壁干重的50％～80％<革蘭氏陰性菌為1％～10％）、磷壁酸質(zhì)、脂蛋白、多糖和蛋白質(zhì)。其中肽聚糖是一種具有乙酰基葡萄糖胺和短肽單元的網(wǎng)狀生物大分子，在它的生物合成中需要一種關(guān)鍵的酶即轉(zhuǎn)肽酶。青霉素作用的部位就是這個轉(zhuǎn)肽酶。現(xiàn)已證明青霉素內(nèi)酞胺環(huán)上的高反映性肽鍵受到轉(zhuǎn)肽酶活性部位上絲氨酸殘基的羥基的親核進(jìn)攻形成了共價(jià)鍵，生成青霉噻唑酰基-酶復(fù)合物，從而不可逆的克制了該酶的催化活性。通過克制轉(zhuǎn)肽酶，青霉素使細(xì)胞壁的合成受到克制，細(xì)菌的抗?jié)B透壓能力減少，引起菌體變形，破裂而死亡。TuWrUpPObX1.5青霉素的應(yīng)用臨床應(yīng)用：40數(shù)年，重要控制敏感金黃色葡糖球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、淋球菌、腦膜炎雙球菌、螺旋體等引起感染，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌<如金黃色葡萄球菌）和某些革蘭氏陰性細(xì)菌及螺旋體有抗菌作用。優(yōu)點(diǎn)：毒性小，但由于難以分離除去青霉噻唑酸蛋白<微量也許引起過敏反映），需要皮試。7qWAq9jPqE各種半合成抗生素的原料：青霉素的缺陷是對酸不穩(wěn)定，不能口服，排泄快，對陰性菌無效。氨芐青霉素耐酸廣譜；對抗綠膿桿菌的磺芐青霉素，耐酸、耐酶、口服的乙氧萘青霉素等。提供頭孢菌素母核。llVIWTNQFk第二章發(fā)酵工藝過程2.1菌種介紹青霉是產(chǎn)生青霉素的重要菌種。廣泛分布于空氣、土壤和各種物上，常生長在腐爛的柑桔皮上呈青綠色。目前已發(fā)現(xiàn)幾百種，其中產(chǎn)黃青霉(Penicillumchrysogenum>、點(diǎn)青霉(Penicillumnototum>等都能大量產(chǎn)生青霉素。青霉素的發(fā)現(xiàn)和大規(guī)模地生產(chǎn)、應(yīng)用，不僅對抗生素工業(yè)的發(fā)展起了巨大的推動作用，并且加上其他抗生素的廣泛使用，比如像磺胺藥物，使人類的平均壽命，再次延長了四歲。此外，有的青霉菌還用于生產(chǎn)灰黃霉素及磷酸二酯酶、纖維素酶等酶制劑和有機(jī)酸。1981年報(bào)導(dǎo)，癘孢青霉是纖維素酶的新來源，它能分解棉花纖維。yhUQsDgRT12.2菌種的保藏菌種的保藏方法有：斜面菌種低溫保藏法、砂土管保藏法、甘油封藏法、真空冷凍干燥法。斜面菌種低溫保藏法運(yùn)用低溫對微生物生命活動有克制作用的原理進(jìn)行保藏。把斜面菌種、固體穿刺培養(yǎng)物或菌懸液等，直接放入4～5℃冰箱中。保藏時(shí)間一般不超過3個月，屆時(shí)必須進(jìn)行移接傳代，再放回冰箱。MdUZYnKS8I砂土管保藏法將干燥砂粒與細(xì)土混合后滅菌制成砂土管，然后接種保藏。若把砂土管放在低溫或抽氣后密封，效果更佳。此法合用于產(chǎn)孢子及芽孢菌種的保藏。保藏期1～2023。09T7t6eTno甘油封藏法向培養(yǎng)好的菌種斜面上，加入滅菌甘油，高出斜面1cm，然后蠟封管口，放入冰箱。該法既可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，又能使菌種與空氣隔絕。保藏期1～2年。e5TfZQIUB5真空冷凍干燥法是目前比較抱負(fù)的一種方法。在低于-15℃下，快速將細(xì)胞凍結(jié)，并保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華致干。在此環(huán)境中，微生物的生長和代謝都暫時(shí)停止，不易發(fā)生變異，故可長時(shí)間保存，一般為5～2023，最多可達(dá)2023之久。此法兼?zhèn)淞说蜏?、干燥及缺氧幾方面條件，使微生物可以保存較長時(shí)間，但過程較麻煩，需要一定的設(shè)備。2.3孢子的制備這是發(fā)酵工序的開端，是一個重要環(huán)節(jié)?？股禺a(chǎn)量和成品質(zhì)量同菌種性能以及同孢子和種子的情況有密切關(guān)系。生產(chǎn)用的孢子需通過純種和生產(chǎn)能力的檢查，符合規(guī)定的才干用來制備種子。保藏在砂土管或冷凍干燥管仲的菌種經(jīng)無菌手續(xù)接入適合于孢子發(fā)芽或菌絲生長的斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)成熟后挑選菌落正常的孢子可再一次接入試管斜面。對于產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基孢子，孢子可直接作為中子罐的種子。GXRw1kFW5s2.4種子制備種子制備是指孢子接入種子罐后，在罐中繁殖成大量菌絲的過程，其目的是使孢子發(fā)芽、繁殖和獲得足夠數(shù)量的菌絲，以便接種到發(fā)酵罐當(dāng)中去。種子制備所使用的培養(yǎng)基及其它工藝條件，都要有助于孢子發(fā)芽和菌絲繁殖。UTREx49Xj9種子罐級數(shù)是在指制備種子需逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，一般根據(jù)種子的生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度，以及發(fā)酵罐的容積而定。青霉素種子制備一般為二級種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)。8PQN3NDYyP2.5發(fā)酵培養(yǎng)基介紹培養(yǎng)基是供微生物生長繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的組成和比例是否恰當(dāng)，直接影響微生物的生長、生產(chǎn)和工藝選擇、產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量等。青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基由碳源、氮源、無機(jī)鹽及金屬離子、添加前體、消沫劑五部分組成。mLPVzx7ZNw碳源的重要作用是：為微生物菌種的生長繁殖提供能源和合成菌體所必需的碳成分；為合成目的產(chǎn)物提供所需的碳成分。青霉素發(fā)酵中常用乳酸或葡萄糖，也可采用葡萄糖母液、糖蜜等。其中乳糖最為便宜，但因貨源較少，很多國家采用葡萄糖代替。但當(dāng)葡萄糖濃度超過一定限度時(shí)，會過度加速菌體的呼吸，以至培養(yǎng)基中的溶解氧不能滿足需要，使一些中間代謝物不能完全氧化而積累在菌體或培養(yǎng)基中，導(dǎo)致pH下降，影響某些酶的活性，從而克制微生物的生長河產(chǎn)物的合成。AHP35hB02d氮源的作用是供應(yīng)菌體合成氨基酸和三肽的原料，以進(jìn)一步合成青霉素。重要有機(jī)氮源為玉M漿、棉籽餅粉、花生餅粉、酵母粉、蛋白胨等。玉M漿為較抱負(fù)的氮源，含固體量少，有助于通氣及氧的傳遞，因而運(yùn)用率較高。固體有機(jī)氮源原料一般需粉碎至200目以下的細(xì)度。有機(jī)氮源還可以提供一部分有機(jī)磷，供菌體生長。無機(jī)氮如硝酸鹽、尿素、硫酸銨等可適量使用。NDOcB141gT碳酸鈣用來中和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的雜酸，并控制發(fā)酵液的pH值，為菌體提供營養(yǎng)的無機(jī)磷源一般采用磷酸二氫鉀。此外加入硫代硫酸鈉或硫酸鈉以提供青霉素分子中所需的硫。由于現(xiàn)在尚有一些工廠采用鐵罐發(fā)酵，在發(fā)酵過程中鐵離子便逐漸進(jìn)入發(fā)酵液。發(fā)酵時(shí)間愈長，則鐵離子愈多。鐵離子在50μg/ml以上便會影響青霉素的合成。采用鐵絡(luò)合劑以克制鐵離子的影響，但實(shí)際對青霉素產(chǎn)量并無改善。所以青霉素的發(fā)酵罐采用不銹鋼制造為宜，其他重金屬離子如銅、汞、鋅等能催化青霉素的分解反映。1zOk7Ly2vA添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借?；D(zhuǎn)移的作用，將苯乙酸轉(zhuǎn)入青霉素分子，提高青霉素G的生產(chǎn)強(qiáng)度，添加苯氧乙酸則產(chǎn)生青霉素V。因此前體的加入成為青霉素發(fā)酵的關(guān)鍵問題之一。但苯乙酸對發(fā)酵有影響，一般以苯乙酰胺較好。也有人采用苯乙酸月桂醇酯，其優(yōu)點(diǎn)是在發(fā)酵中月桂醇酯水解，苯乙酸結(jié)合進(jìn)青霉素成品。而月桂酸作為細(xì)菌營養(yǎng)劑及發(fā)酵液消沫劑，且其毒性比苯乙酸小，但價(jià)格較貴。前體要在發(fā)酵開始20h后加入，并在整個發(fā)酵過程中控制在50μg/ml左右fuNsDv23Kh由于在發(fā)酵過程中二氧化碳的不斷產(chǎn)生，加上培養(yǎng)基中有很多有機(jī)氮源具有蛋白質(zhì)，因此在發(fā)酵罐內(nèi)會產(chǎn)生大量泡沫，如不嚴(yán)加控制，就會產(chǎn)生發(fā)酵液逃液，導(dǎo)致染菌的后果。采用植物油消沫依舊是個好方法，一方面作為消沫劑，另一方面還可以起到碳源作用，但現(xiàn)在已普遍采用合成消沫劑<如聚酯、聚醇類消沫劑）代替豆油。tqMB9ew4YX2.6滅菌“滅菌”指的是用化學(xué)或物理的方法殺滅或除去物料及設(shè)備中所有的有生命物質(zhì)的技術(shù)或工藝流程。滅菌實(shí)質(zhì)上可分殺菌和溶菌兩種，前者指菌體雖死，但形體尚存，后者則指菌體殺死后，其細(xì)胞發(fā)生溶化、消失的現(xiàn)象。HmMJFY05dE工業(yè)上常用的方法有：干熱滅菌、濕熱滅菌、化學(xué)藥劑滅菌、射線滅菌和介質(zhì)過濾除菌等幾種。在青霉素的生產(chǎn)中，對培養(yǎng)基和發(fā)酵罐重要采用的是濕熱蒸汽滅菌和空氣過濾除菌的方法。2.7發(fā)酵這一過程的目的重要是為了使微生物分泌大量的抗生素。發(fā)酵開始前，有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基必須先通過滅菌，后接入種子。接種量一般為5～20%。發(fā)酵周期一般為4～5天，但也有少于24小時(shí)，或長達(dá)二周以上的。在整個過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐壓，并隔一段時(shí)間取樣進(jìn)行生化分析和無菌實(shí)驗(yàn)，觀測代謝變化、抗生素產(chǎn)生情況和有無雜菌污染。ViLRaIt6sk2.7.1發(fā)酵的過程控制1、碳源控制：青霉菌能運(yùn)用多種碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂等。乳糖是青霉素生物合成的最佳碳源，葡萄糖也是比較好的碳源，但必須控制其加入的濃度，由于葡萄糖易被菌體氧化并產(chǎn)生克制抗生素合成酶形成的物質(zhì)，從而影響青霉素的合成，所以可以采用連續(xù)添加葡萄糖的方法代替乳糖。9eK0GsX7H1苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可作為青霉素G的側(cè)鏈前體。菌體對前體的運(yùn)用有兩個途徑：直接結(jié)合到產(chǎn)物分子中或作為養(yǎng)料和能源運(yùn)用，即氧化為二氧化碳和水。前體究竟通過哪個途徑被菌體運(yùn)用，重要取決于培養(yǎng)條件以及所用菌種的特性。naK8ccr8VI通過比較苯乙酰胺、苯乙酸及苯氧基乙酸的毒性，除苯氧基乙酸外，苯乙酰胺和苯乙酸的毒性取決于培養(yǎng)基的pH和前體的濃度。堿性時(shí)，苯乙酰胺有毒；酸性時(shí)，苯乙酸毒性較大；中性時(shí)，苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。前體用量大于0.1%時(shí)，青霉素的生物合成均下降。所以一般發(fā)酵液中前體濃度以始終維持在0.1%為宜。B6JgIVV9ao在堿性條件下，苯乙酸被菌體氧化的速率隨培養(yǎng)基pH上升而增長。年幼的菌絲不氧化前體，而僅運(yùn)用它來構(gòu)成青霉素分子。隨著菌齡的增大，氧化能力逐漸增長。培養(yǎng)基成分對前體的氧化限度有較大影響，合成培養(yǎng)基比復(fù)合培養(yǎng)基對前體的氧化量少。P2IpeFpap5為了盡量減少苯乙酸的氧化，生產(chǎn)上多用間歇或連續(xù)添加低濃度苯乙酸的方法，以保持前體的供應(yīng)速率略大于生物合成的需要。3YIxKpScDM2、pH控制：在青霉素發(fā)酵過程中，pH是通過下列手段控制的：如pH過高，則添加糖、硫酸或無機(jī)氮源；若pH過低，則加入碳酸鈣、氫氧化鈉、氨或尿素，也可提高通氣量。此外，也可運(yùn)用自動加入酸或堿的方法，使發(fā)酵液pH維持在6.8～7.2，以提高青霉素產(chǎn)量。gUHFg9mdSs3、溫度控制：青霉菌生長的適宜溫度為30℃，而分泌青霉素的適宜溫度是20℃左右，因此生產(chǎn)上采用變溫控制的方法，使之適合不同階段的需要。一般一級種子的培養(yǎng)溫度控制在27±1℃左右；二級種子的培養(yǎng)溫度控制在25±1℃左右；發(fā)酵前期和中期的溫度控制在264、補(bǔ)料控制：發(fā)酵過程中除以中間補(bǔ)糖控制糖濃度及pH外，補(bǔ)加氮源也可提高發(fā)酵單位。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：若在發(fā)酵60～70h開始分次補(bǔ)加硫酸銨，則在90h后菌絲含氮量幾乎不下降，維持在6%～7%，，且60%～70%的菌絲處在年幼階段，菌絲呼吸強(qiáng)度維持在二氧化碳量近30μl/<mg菌絲·h），抗生素產(chǎn)率為最高水平的30%～40%；而不加硫酸銨的對照罐，在發(fā)酵中期菌絲含氮量為7%，以后逐級下降。至發(fā)酵結(jié)束時(shí)為4%。發(fā)酵結(jié)束時(shí)呼吸強(qiáng)度降至二氧化碳量為16μl/<mg菌絲·h），且抗生素產(chǎn)量下降至零，總產(chǎn)量僅為實(shí)驗(yàn)罐的1/2。因此，為了延長發(fā)酵周期，提高青霉素產(chǎn)量，發(fā)酵過程分次補(bǔ)加氮源也是有效的措施。IMGWiDkflP5、鐵離子的影響：三價(jià)鐵離子對青霉素生物合成有顯著影響，一般若發(fā)酵液中鐵離子含量超過30～40μg/ml，則發(fā)酵單位增長緩慢。鐵離子對產(chǎn)黃青霉綠色孢子合成青霉素的影響見下表。因此鐵罐在使用前必須進(jìn)行解決，可在罐壁涂上環(huán)氧樹脂等保護(hù)層，使鐵離子含量控制在30μg/ml以下。WHF4OmOgAw2.7.2防止染菌的要點(diǎn)染菌是抗生素發(fā)酵的大敵，不制服染菌就不能實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。影響染菌的因素很多，并且?guī)щS機(jī)性質(zhì)，但只要認(rèn)真對待，過細(xì)地工作，染菌是可以防止的。請到左邊的導(dǎo)航欄里選擇查看防止染菌的要點(diǎn)的內(nèi)容。aDFdk6hhPd2.7.3空氣系統(tǒng)的規(guī)定防止空氣帶菌重要是提高空壓機(jī)進(jìn)口空氣的潔凈度，防止空氣夾帶油和水及空氣過濾器失效。提高空壓機(jī)進(jìn)口空氣的潔凈度，可以從提高吸氣口的位置及加強(qiáng)空氣的壓縮前過濾著手。防止空氣夾帶油、水，除加強(qiáng)去除油、水的措施外，還必須防止空氣冷卻器漏水，注意勿使冷卻水壓力大于空氣壓力，防止冷卻水進(jìn)入空氣系統(tǒng)。ozElQQLi4T2.7.4蒸汽系統(tǒng)的規(guī)定重視飽和蒸汽的質(zhì)量，要嚴(yán)防蒸汽中夾帶大量冷凝水，防止蒸汽壓力大幅度波動，保證生產(chǎn)時(shí)所用的蒸汽壓力在30～35千帕以上。CvDtmAfjiA1、連續(xù)滅菌設(shè)備：連消塔結(jié)構(gòu)規(guī)定簡樸，易于拆裝和清理，操作時(shí)蒸汽能與物料混合均勻，并易于控制溫度。2、發(fā)酵罐：發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備應(yīng)注意嚴(yán)密和防止泄漏，避免形成“死角”。凡與物料、空氣、下水道連接的閥門都必須保證嚴(yán)密度。QrDCRkJkxh3、無菌室：用超凈工作臺及凈化室代替無菌室，以提高無菌限度。第三章提煉工藝過程3.1發(fā)酵液預(yù)解決發(fā)酵液中的雜質(zhì)如高價(jià)無機(jī)離子<Fe2+、Ca2+、Mg2+）和蛋白質(zhì)在離子互換的過程中對提煉影響甚大，不利于樹脂對抗生素的吸取。如用溶媒萃取法提煉時(shí)，蛋白質(zhì)的存在會產(chǎn)生乳化，使溶媒合水相分離困難。對高價(jià)離子的去除，可采用草酸或磷酸。如加草酸則它與鈣離子生成的草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固以提高發(fā)酵濾液的質(zhì)量。如加磷酸<或磷酸鹽），既能減少鈣離子濃度，也利于去除鎂離子。4nCKn3dlMXNa5P3O10+Mg2+====MgNa3P3O10+2Na+加黃血鹽及硫酸鋅，則前者有助于去除鐵離子，后者有助于凝固蛋白質(zhì)。此外，兩者尚有協(xié)同作用。他們所產(chǎn)生的復(fù)鹽對蛋白質(zhì)有吸附作用。ijCSTNGm0E2K4Fe(CN>6+3ZnSO4K2Zn[Fe(CN>6]2+2Na+為了有效的去除發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，需加入絮凝劑。絮凝劑是一種能溶于水的高分子化合物。具有很多離子化基團(tuán)<如—NH2，—COOH，—OH）。vfB1pxanfk3.2提取化學(xué)提取和精制的目的：從發(fā)酵液中制取高純度的、合乎藥典的抗生素成品。由于發(fā)酵液中青霉素濃度很低，僅0.1～4.5%左右，而雜質(zhì)濃度比青霉素的高幾十倍甚至幾千倍，并且某些雜質(zhì)的性質(zhì)與抗生素的非常相近，因此提取精制是一件十分重要的工作。JbA9VhEou1發(fā)酵液中常見的雜質(zhì)有：菌絲、未用完的培養(yǎng)基、易污染雜菌、產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物、預(yù)解決需要加入的雜質(zhì)等。在提煉過程中要遵循下面四個原則：1、時(shí)間短2、溫度低3、pH適中4、勤清洗消毒常用的提取方法有溶媒萃取法、離子互換法和沉淀法等。1、溶媒萃取法這是運(yùn)用抗生素在不同的pH值條件下以不同的化學(xué)狀態(tài)<游離態(tài)、堿或鹽）存在時(shí)，在水及水互不相溶的溶媒中溶解度不同的特性，使抗生素從一種液相<如發(fā)酵濾液）轉(zhuǎn)移到另一種液相<如有機(jī)溶媒）中去，以達(dá)成濃縮和提純的目的。運(yùn)用此原理就可借助于調(diào)節(jié)pH值得方法時(shí)抗生素從一個液相中被提取到另一液相中去。所選用的溶媒與水應(yīng)是互不相溶或僅很小部分互溶，同時(shí)所選溶媒在一定的pH下對于抗生素應(yīng)有較大的溶解度和選擇性，方能用較少量的溶媒使提取完全，并在一定限度上分離掉雜質(zhì)。X7Ahr18pJI2、離子互換法運(yùn)用離子互換樹脂和抗生素之間的化學(xué)親和力，有選擇性的將抗生素吸附上去，然后以較少量的洗脫劑將它洗下來。b3zqXLCqXo3、沉淀法是一種分離抗生素簡樸而經(jīng)濟(jì)的方法，濃縮倍數(shù)高，因而也是很有效的方法。青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而青霉素鹽易溶于水。運(yùn)用這一性質(zhì)，在酸性條件下青霉素轉(zhuǎn)入有機(jī)溶媒中，調(diào)節(jié)pH，再轉(zhuǎn)入中性水相，反復(fù)幾次萃取，即可提純濃縮。選擇對青霉素分派系數(shù)高的有機(jī)溶劑。工業(yè)上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取2－3次。從發(fā)酵液萃取到乙酸丁酯時(shí)，pH選擇2.8-3.0，從乙酸丁酯反萃到水相時(shí)，pH選擇6.8-7.2。為了避免pH波動，采用硫酸鹽、碳酸鹽緩沖液進(jìn)行反萃。所得濾液多采用二次萃取，用10%硫酸調(diào)pH2.8~3.0，加入醋酸丁酯。在一次丁酯萃取時(shí)，由于濾液具有大量蛋白，通常加入破乳劑防止乳化。第一次萃取，存在蛋白質(zhì)，加0.05-0.1%乳化劑PPB。pZyytu5rc53.3精制這是青霉素生產(chǎn)的最后工序。對產(chǎn)品進(jìn)行精制、烘干和包裝的階段要符合“藥品生產(chǎn)管理規(guī)范”的規(guī)定。3.3.1脫色和去熱原質(zhì)脫色和去熱原質(zhì)是精制注射用青霉素中不可缺少的一步。色素是在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，它與菌種和發(fā)酵條件有關(guān)。熱原質(zhì)是在生產(chǎn)過程中由于被污染后雜菌所產(chǎn)生的一種內(nèi)毒素。生產(chǎn)中一般用活性炭脫色去熱原質(zhì)，但需注意脫色時(shí)pH、溫度、活性炭用量及脫色時(shí)間等因素，還應(yīng)考慮它對抗生素的吸附問題，否則影響收率。DVyGZezsrM3.3.2結(jié)晶抗生素精制常用結(jié)晶法來制得高純度成品。常用的幾種結(jié)晶方法有：1、改變溫度結(jié)晶運(yùn)用抗生素在溶劑中的溶解度隨溫度變化而顯著變化的這一特性來進(jìn)行結(jié)晶。2、運(yùn)用等電點(diǎn)結(jié)晶當(dāng)將某一抗生素溶液的pH調(diào)到等電點(diǎn)時(shí)，它在水溶液中溶解度最小，則沉淀析出。3、加成鹽劑結(jié)晶在抗生素溶液中加成鹽劑使抗生素以鹽的形式從溶液中可以沉淀結(jié)晶。青霉素鈉鹽在醋酸丁酯中溶解度很小，運(yùn)用此性質(zhì)，再二次醋酸丁酯萃取液中加入醋酸鈉乙醇溶液，并控制溫度青霉素鈉鹽就結(jié)晶析出。反映如下：RQxPvY3tFs醋酸丁酯中含水量過高會影響收率，但可提高晶體純度。水分在0.9%以下對收率影響較小。得到的晶體規(guī)定顆粒均勻，有一定的細(xì)度。顆粒太細(xì)會使過濾、洗滌困難。晶體經(jīng)丁醇洗滌，真空干燥即可等到成品。5MxX1IxuU93.4成品鑒定成品鑒定是根據(jù)藥典的規(guī)定逐項(xiàng)進(jìn)行分析，涉及效價(jià)鑒定、毒性實(shí)驗(yàn)、無菌檢查、熱源質(zhì)實(shí)驗(yàn)、水分測定、水溶液酸堿度及混濁度測定、結(jié)晶顆粒的色澤及大小的測定等。對于藥典上未有規(guī)定的新抗生素，則可參照相近抗生素，按經(jīng)驗(yàn)規(guī)定一些指標(biāo)。jIw5xs0v9P酸堿度檢測取本品，加水制成每1ml中含30mg的溶液，測定。pH值應(yīng)為5.0～7.5。溶液的澄清度與顏色取樣品0.3g，加水5ml使溶解，溶液應(yīng)澄清無色；如顯渾濁，與濁度標(biāo)準(zhǔn)液比較，均不得更濃；如顯色，與黃色或黃綠色標(biāo)準(zhǔn)比色液比較，均不得更深。xEve2buwnw吸光度取樣品，加水制成每1ml中含1.80mg的溶液，在280nm的波長處測定吸光度，不得大于0.10；在264nm的波長處有最大吸取，吸光度應(yīng)為0.80～0.88。KAvmyVYxCd細(xì)菌內(nèi)毒素取樣品測定，每100青霉素單位中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.01EU。無菌取樣品，用青霉素酶法滅活后或用適宜溶劑溶解后，轉(zhuǎn)移至不少于500ml的0.9%無菌氯化鈉溶液中，用薄膜過濾法解決后測定。Ywuu4FszRT效價(jià)測定取本品適量，精密稱定，加水溶液并定量稀釋制成每1ml中約含0.5mg的溶液，搖勻，精密量取10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取青霉素對照品適量，同法測定。按外標(biāo)以峰面積計(jì)算，其結(jié)果乘以1.0658，即為本品效價(jià)。每1mg相稱于1670青霉素單位。cstDApWA6A3.5成品分裝抗生素產(chǎn)品一般分裝為大包裝的原料藥，以供制劑廠進(jìn)行小包裝或制劑加工。也有一些抗生素工廠在無菌條件下用自動分裝機(jī)進(jìn)行小瓶分裝。qotL69pBkh第四章操作規(guī)程4.1發(fā)酵工藝過程4.1.1正常發(fā)酵<過程）進(jìn)料(基質(zhì)>，開備料泵 開備料閥 備料后<罐重100000KG）關(guān)備料閥 關(guān)備料泵 開攪拌器 設(shè)立攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn) 開通風(fēng)閥 開排氣閥 投加菌種 補(bǔ)糖，開補(bǔ)糖閥 補(bǔ)氮，開加硫銨閥 開冷卻水，維持溫度在25PH值保持在一定范圍內(nèi) 前體超過1KG/M3<扣分環(huán)節(jié)，出現(xiàn)則扣分）4.1.2出料停止進(jìn)空氣 停攪拌 關(guān)閉所有進(jìn)料，開閥出料 4.1.3發(fā)酵過程中PH值低調(diào)節(jié)PH值開大氨水流量 PH值指標(biāo) 4.1.4發(fā)酵過程中PH值高關(guān)閉進(jìn)氨水 開大補(bǔ)糖閥 調(diào)節(jié)PH值 4.1.5發(fā)酵過程中溶解氧低開大進(jìn)空氣閥V02 調(diào)節(jié)溶解氧大于30% 4.1.6殘?zhí)菨舛鹊烷_加糖閥補(bǔ)糖 4.1.7發(fā)酵過程中溫度高開通冷卻水進(jìn)水冷卻 溫度指標(biāo) 4.1.8泡沫高添加消泡劑 泡沫高度減少到30CM4.2提煉工藝過程4.2.1預(yù)解決操作打開閥V14，加發(fā)酵液。待加料至5000kg時(shí)，關(guān)閉閥V14。打開預(yù)解決罐攪拌器打開閥V13，加黃血鹽，去除鐵離子。觀測鐵離子濃度變化，待鐵離子濃度為零時(shí)，關(guān)閉閥V13。打開閥V12，加磷酸鹽，去除鎂離子。觀測鎂離子濃度變化，鎂離子濃度為零時(shí)，關(guān)閉閥V12。打開閥V11，加絮凝劑，去除蛋白質(zhì)。觀測蛋白質(zhì)濃度變化，蛋白質(zhì)濃度為零時(shí)，關(guān)閉閥V11。打開閥V16、V17及泵P5，同時(shí)打開轉(zhuǎn)筒過濾器開關(guān)及后閥V18。待發(fā)酵液通過濾排至混合罐B101后，關(guān)閉閥V16、V17、泵P5以及轉(zhuǎn)筒過濾器開關(guān)及后閥V18。停止預(yù)解決罐攪拌器。4.2.2一次BA萃取操作打開混合罐B101攪拌器打開閥V19，加BA<醋酸丁酯）質(zhì)量為發(fā)酵液的1/4~1/3倍。關(guān)閉閥V19。打開閥V22，加稀硫酸調(diào)節(jié)PH值。待PH值調(diào)節(jié)至2~3時(shí)，關(guān)閉閥V22。打開閥V21，加破乳劑。加破乳劑量為100kg時(shí)，關(guān)閉閥V21。打開閥V23、V24及泵P6，向分離機(jī)注液。待分離機(jī)中有液位時(shí)，迅速打開A101開關(guān)。打開萃余相回收閥V26，調(diào)節(jié)V26閥門開度，控制重相液位在總液位的80%左右，使輕相液能充足的溢流至B102。EksTCSTCzX待混合罐B101液體排空后，關(guān)閉閥V23、V24及泵P6。停止混合罐B101攪拌器。待分離機(jī)A101中液體排盡后，關(guān)閉閥V26。關(guān)閉分離機(jī)A101開關(guān)4.2.3一次反萃取操作打開混合罐B102攪拌器。打開V28，加碳酸氫鈉溶液，質(zhì)量為青霉素溶液的3~4倍，并調(diào)節(jié)PH值為7~8待PH值調(diào)節(jié)至7~8時(shí)，關(guān)閉閥V28。打開閥V29、V30及泵P7，向分離機(jī)A102注液。待分離機(jī)A102中有液位時(shí)，迅速打開A102開關(guān)。打開萃余相回收閥V32，調(diào)節(jié)V32閥門開度，控制重相液位在總液位的80%左右，輕相液能充足的溢流出。待混合罐B102液體排空后，關(guān)閉閥V29、V30及泵P7。停止混合罐B102攪拌器。待分離機(jī)中剩余少許重液時(shí)，關(guān)閉閥V32，防止輕液流入混合罐B103中關(guān)閉分離機(jī)A102開關(guān)4.2.4二次BA萃取操作打開混合罐B103攪拌器。打開閥V33，加BA<醋酸丁酯）質(zhì)量為發(fā)酵液的1/4~1/3倍。關(guān)閉閥V33。打開閥V35，加稀硫酸調(diào)節(jié)PH值。待PH值調(diào)節(jié)至2~3時(shí)，關(guān)閉閥V35。打開閥V36、V37及泵P8。待分離機(jī)中有液位時(shí)，迅速打開A103開關(guān)。打開萃余相回收閥V39，調(diào)節(jié)V39閥門開度，控制重相液位在總液位的80%左右，使輕相液能充足的溢流至脫色罐中。Sgs28CnDOE待混合罐B103液體排空后，關(guān)閉閥V36、V37及泵P8。停止混合罐B103攪拌器。待分離機(jī)A103中液體排盡后，關(guān)閉閥V39。關(guān)閉分離機(jī)A103開關(guān)。4.2.5脫色罐操作打開活性炭進(jìn)料閥。選擇進(jìn)料量，進(jìn)料25kg進(jìn)料關(guān)閉進(jìn)料閥。打開脫色罐攪拌器，并設(shè)定攪拌時(shí)間：10min攪拌10min后，打開閥V41、V42及泵P9，將青霉素溶液通過過濾器排至結(jié)晶罐。待脫色罐液體排空后，關(guān)閉閥V41、V42及泵P9。停止脫色罐攪拌器。4.2.6結(jié)晶罐及抽濾、干燥操作啟動結(jié)晶罐攪拌器打開閥V43，向結(jié)晶罐中加入醋酸鈉-乙醇溶液。觀測青霉素濃度，待青霉素剛好反映完時(shí)，關(guān)閉閥V43。打開冷卻水閥V44及VD10，控制結(jié)晶罐溫度為5℃打開閥V45、V46及泵P10，將結(jié)晶液排至真空抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾待真空抽濾機(jī)中上層液位達(dá)成50%左右后，迅速打開真空閥V47，進(jìn)行抽濾。同時(shí)打開V48，回收母液。待結(jié)晶罐中液體排空后，關(guān)閉閥V45、V46及泵P10。停止結(jié)晶罐攪拌器抽濾完畢后，關(guān)閉真空閥V47。待母液所有回收后，關(guān)閉閥V48。點(diǎn)擊“移出晶體”按鈕，將抽濾后的晶體移入洗滌罐。打開閥V49，加丁醇進(jìn)行洗滌。待丁醇加入量為500kg時(shí)，關(guān)閉閥V49。啟動洗滌罐攪拌器，并設(shè)定期間為8min。停止洗滌罐攪拌器。并設(shè)定期間，保持10min。打開閥V50，排出廢洗液。待廢洗液排盡后，關(guān)閉閥V50。點(diǎn)擊“移出晶體”，將洗滌后的晶體移至真空干燥機(jī)。啟動干燥機(jī)，進(jìn)行干燥，并設(shè)定期間為20min關(guān)閉干燥機(jī)開關(guān)，停止干燥。第五章重要操作畫面5.1青霉素工藝流程界面5.2菌種介紹界面5.3孢子制備界面5.4種子制備界面5.5滅菌界面5.6培養(yǎng)基制備界面5.7發(fā)酵工藝操作界面5.8發(fā)酵罐操作界面5.9菌種曲線界面5.10預(yù)解決界面5.11提取流程總貌5.12一次BA萃取界面5.13精制流程總貌5.14脫色操作界面5.15結(jié)晶操作界面5.16抽濾、干燥操作界面5.17成品鑒定界面5.18成品分裝界面第六章重要工藝指標(biāo)編號指標(biāo)推薦值發(fā)酵罐1糖濃度~5kg/m32氨氮含量0.25~0.3kg/m33PH值6．8-7．24溫度255攪拌轉(zhuǎn)速150-250rpm6溶氧濃度>30%7前體濃度<1kg/m38發(fā)酵液中硫氨濃度0.25kg/m39發(fā)酵罐壓力0.07MPa一次BA萃取1醋酸丁酯<BA）用量青霉素溶液的1/32PH值2.8-3.03破乳劑用量100kg4、重相液位80%一次反萃取1碳酸氫鈉用量青霉素溶液的2.52PH值6.8-7.23重相液位80%二次BA萃取1醋酸丁酯<BA）用量青霉素溶液的1/32PH值2.8-3.03重相液位80%脫色罐1活性炭用量25kg結(jié)晶罐1結(jié)晶溫度52丁醇用量500kg3青霉素鈉鹽晶體效價(jià)1670u/ml第七章重要設(shè)備列表及仿真操作設(shè)備編號名稱備注1發(fā)酵罐發(fā)酵罐容量為170000kg，重要部件有罐體、攪拌器、擋板、軸封、空氣分布器、傳動裝置、冷卻管、視鏡等。2進(jìn)料泵加入基質(zhì)3空氣系統(tǒng)含消毒、冷卻、過濾。4計(jì)量泵一<加氨水）操作時(shí)有開關(guān)、調(diào)節(jié)及入罐處泵門三處要操作5計(jì)量泵二<加前體）同上6計(jì)量泵三<加消沫劑）同上7加菌種按鈕點(diǎn)擊后自動按比例增長一次菌種8預(yù)解決罐容量為12600kg。9轉(zhuǎn)筒真空過濾器轉(zhuǎn)筒真空過濾機(jī)是一種連續(xù)操作的過濾機(jī)械，廣泛應(yīng)用于各種工業(yè)中。設(shè)備的主體是一個能轉(zhuǎn)動的水平圓筒，其表面有一層金屬網(wǎng)，網(wǎng)上覆蓋濾布，筒的下部浸入濾漿中，如圖3-24所示。圓筒沿徑向分隔成若干扇形格，每格都有單獨(dú)的孔道通至分派頭上。圓筒轉(zhuǎn)動時(shí)，憑藉分派頭的作用使這些孔道依次分別與真空管及壓縮空氣管相通，因而在回轉(zhuǎn)一周的過程中每個扇形格表面即可順序進(jìn)行過濾、洗滌、吸干、吹松、卸餅等項(xiàng)操作。10混合罐容量為17000kg。11分離機(jī)在離心力作用下，將兩種密度不同且不相容的溶液分離，輕相由頂部溢流而出，重相由底部排出。12脫色罐容量為17000kg。13活性炭進(jìn)料按鈕點(diǎn)擊“進(jìn)料閥”按鈕，打開進(jìn)料閥，點(diǎn)擊“選擇進(jìn)料量”按鈕，輸入進(jìn)料量，然后點(diǎn)擊“進(jìn)料”按鈕，完畢進(jìn)料環(huán)節(jié)14結(jié)晶罐冷卻結(jié)晶罐，容量為14000kg，有攪拌裝置，使結(jié)晶顆粒保持懸浮于溶液中，并同溶液有一個相對運(yùn)動，提高溶質(zhì)質(zhì)點(diǎn)的擴(kuò)散速度，加速晶體長大。15真空抽濾機(jī)通過抽真空，使晶體與濾液分離16洗滌罐容量為1200。17移出晶體按鈕點(diǎn)擊“移出晶體”按鈕，可以將晶體18真空干燥機(jī)真空干燥機(jī)是一種在真空條件下操作的接觸式干燥過程，與常