實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)的沉淀與凝固

#實(shí)驗(yàn)二十二血清脂蛋白瓊脂糖電泳［原理］瓊脂糖電泳與薄膜電泳的原理基本是一致的，它們的區(qū)別主要是電泳支持物的不同。瓊脂糖是從海洋植物瓊脂中提取出來(lái)的一種聚合鏈線狀分子，加水后可以制成具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。本次實(shí)驗(yàn)是用瓊脂糖為支持物分離血清脂蛋白。血清中的脂類(lèi)物質(zhì)均與血清蛋白質(zhì)結(jié)合成水溶性的脂蛋白形式存在，各種脂蛋白中，所含的蛋白質(zhì)種類(lèi)和數(shù)量不同，脂蛋白顆粒大小亦不同，這些因素使它們?cè)陔妶?chǎng)中的移動(dòng)速度各異，因而可以通過(guò)電泳使不同的脂蛋白一一分開(kāi)。樣品先經(jīng)脂類(lèi)染料染色，通電后脂蛋白在凝膠板上的移動(dòng)量可以肉眼觀察。區(qū)帶寬窄及染色深淺反映各種脂蛋白的量。瓊脂糖電泳可將血清脂蛋白分出3條區(qū)帶（a-脂蛋白、前B一脂蛋白和B-脂蛋白）。［操作］預(yù)染血清：血清0.2m1加蘇丹黑染色液0.016ml于小試管中，混合后置37°C水浴染色30分鐘。然后每分鐘2000轉(zhuǎn)，離心約5分鐘。制備瓊脂糖凝膠板：已配制的5g/L瓊脂糖凝膠于沸水浴中加熱融化。用吸管吸取凝膠溶液流注載玻片，每片約3ml。靜置約半小時(shí)后凝固（天熱時(shí)需延長(zhǎng)，可放冰箱數(shù)分鐘加速凝固）。點(diǎn)加血清：在將要凝固的瓊脂糖凝膠板距一端約2cm處，放一個(gè)1.5X10mm的金屬棒，向下壓使之接觸載玻片，用吸鐵石將小棒吸出。以小片濾紙吸干小槽中水分,用毛細(xì)管或微量注射器吸取經(jīng)過(guò)預(yù)染的血清約15卩1,注入凝膠板上的小槽內(nèi)。電泳：將加過(guò)血清的凝膠板平行放于電泳槽中，樣品放于陰極一端。兩塊三層紗布于巴比妥緩沖液中浸濕，然后輕輕緊密貼在凝膠板兩端，紗布的另一端浸于電泳槽內(nèi)的巴比妥緩沖液中，接通電源，電壓為100V,每片電流為3?4mA,約經(jīng)電泳45?55分鐘，即可見(jiàn)分離之色帶。［臨床意義］正常人血清脂蛋白可出現(xiàn)3條區(qū)帶，從陰極到陽(yáng)極依次為B-脂蛋白（最深）、前B-蛋白（最淺），a-脂蛋白（比前B-脂蛋白略深些），在原點(diǎn)處應(yīng)無(wú)乳糜微粒。如果前3-脂蛋白比a-蛋白深，結(jié)合血清甘油三酯明顯升高和膽固醇正?；蚵詥J，可以確定為W型咼脂蛋白血癥。如果3-脂蛋白區(qū)帶比正常血清明顯深染者，同時(shí)結(jié)合血清總膽固醇明顯增高，甘油三酯正常者為Ila型，若結(jié)合血清總膽固醇增高而甘油三酯略高和3略深者為lib型。如果3-和前3一兩區(qū)帶分離不開(kāi)連在一起稱“寬3區(qū)帶”結(jié)合血清甘油三酯和膽固醇均有所增高，可定為III型。如果原點(diǎn)出現(xiàn)乳廉微粒，3、前3均正?；驕p低，結(jié)合血清甘油三酯明顯升高,可定為I型［試劑］巴比妥緩沖液（pH8.6）:用于電泳槽者離子強(qiáng)度0.075，巴比妥鈉15.458g、巴比妥2.766g、加水至1000ml。配制瓊脂糖凝膠者離子強(qiáng)度0.05,巴比妥鈉10.3g、巴比妥1.84g、加水至1000ml。5g/L瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖0.5g,加入巴比妥緩沖液（離子強(qiáng)度0.05）100ml,置沸水浴中溶解，分裝于試管中，冰箱保存