第九章 色譜分析法導論

§9.1概述色譜法也叫層析法，它是一種高效能的物理分離技術，將它用于分析化學并配合適當的檢測手段，就成為色譜分析法。當前1頁，總共102頁。

色譜法的最早應用是用于分離植物色素，其方法是這樣的：在一玻璃管中放入碳酸鈣，將含有植物色素（植物葉的提取液）的石油醚倒入管中。當前2頁，總共102頁。此時，玻璃管的上端立即出現幾種顏色的混合譜帶。然后用純石油醚沖洗，隨著石油醚的加入，譜帶不斷地向下移動，并逐漸分開成幾個不同顏色的譜帶，繼續(xù)沖洗就可分別接得各種顏色的色素，并可分別進行鑒定。色譜法也由此而得名。當前3頁，總共102頁。當前4頁，總共102頁。現在的色譜法早已不局限于色素的分離，其方法也早已得到了極大的發(fā)展，但其分離的原理仍然是一樣的。我們仍然叫它色譜分析。當前5頁，總共102頁。一、色譜分離基本原理：由以上方法可知，在色譜法中存在兩相，一相是固定不動的，我們把它叫做固定相；另一相則不斷流過固定相，我們把它叫做流動相。當前6頁，總共102頁。色譜法的分離原理就是利用待分離的各種物質在兩相中的分配系數、吸附能力等親和能力的不同來進行分離的。當前7頁，總共102頁。使用外力使含有樣品的流動相（氣體、液體）通過一固定于柱中或平板上、與流動相互不相溶的固定相表面。當流動相中攜帶的混合物流經固定相時，混合物中的各組分與固定相發(fā)生相互作用。當前8頁，總共102頁。由于混合物中各組分在性質和結構上的差異，與固定相之間產生的作用力的大小、強弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經過反復多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中先后流出。與適當的柱后檢測方法結合，實現混合物中各組分的分離與檢測。當前9頁，總共102頁。二、色譜分類方法：色譜分析法有很多種類，從不同的角度出發(fā)可以有不同的分類方法。當前10頁，總共102頁。（一）從兩相的狀態(tài)分類：色譜法中，流動相可以是氣體，也可以是液體，由此可分為氣相色譜法（GC）和液相色譜法（LC）。固定相既可以是固體，也可以是涂在固體上的液體，由此又可將氣相色譜法和液相色譜法分為氣-液色譜、氣-固色譜、液-固色譜、液-液色譜。分類情況如下：當前11頁，總共102頁。色譜法液相色譜法氣相色譜法氣-液色譜法氣-固色譜法液-固色譜法液-液色譜法當前12頁，總共102頁。（二）按固定相的形式分類：按固定相的狀態(tài)可分為：柱色譜：固定相裝在色譜柱中；紙色譜：利用濾紙作載體，吸附在紙上的水作固定相；薄層色譜：將固體吸附劑在玻璃板或塑料板上制成薄層作固定相。當前13頁，總共102頁。當前14頁，總共102頁。（三）按分離原理分類：可分為：吸附色譜法：利用吸附劑（固定相一般是固體）表面對不同組分吸附能力的差別進行分離的方法；當前15頁，總共102頁。分配色譜法：利用不同組分在兩相間的分配系數的差別進行分離的方法。當前16頁，總共102頁。離子交換色譜：利用溶液中不同離子與離子交換劑間的交換能力的不同而進行分離的方法?？臻g排斥（阻）色譜法：利用多孔性物質對不同大小的分子的排阻作用進行分離的方法。當前17頁，總共102頁。§9.2色譜流出曲線（色譜圖）及有關術語（一）氣相色譜法分離的過程：分離過程（以分離A、B兩組分為例）為：

當前18頁，總共102頁?；旌辖M分的分離過程及檢測器對各組份在不同階段的響應當前19頁，總共102頁。當前20頁，總共102頁。（二）色譜流出曲線：從載氣帶著組分進入色譜柱起就用檢測器檢測流出柱后的氣體，并用記錄器記錄信號隨時間變化的曲線，此曲線就叫色譜流出曲線，當待測組分流出色譜柱時，檢測器就可檢測到其組分的濃度，在流出曲線上表現為峰狀，叫色譜峰。當前21頁，總共102頁。如圖所示為一色譜流出曲線：當前22頁，總共102頁。色譜術語：1）基線：在實驗條件下，色譜柱后僅有純流動相進入檢測器時的流出曲線稱為基線?；€在穩(wěn)定的條件下應是一條水平的直線。它的平直與否可反應出實驗條件的穩(wěn)定情況。當前23頁，總共102頁。2）峰高（h）和峰面積：色譜峰頂點與基線的距離叫峰高。色譜峰與峰底基線所圍成區(qū)域的面積叫峰面積。當前24頁，總共102頁。3）保留值

a.死時間(t0)：不與固定相作用的物質從進樣到出現峰極大值時的時間，它與色譜柱的空隙體積成正比。由于該物質不與固定相作用，因此，其流速與流動相的流速相近。據t0可求出流動相平均流速當前25頁，總共102頁。b.保留時間tr：試樣從進樣到出現峰極大值時的時間。它包括組份隨流動相通過柱子的時間t0和組份在固定相中滯留的時間。當前26頁，總共102頁。c.調整保留時間tr’：某組份的保留時間扣除死時間后的保留時間，它是組份在固定相中的滯留時間。即由于保留時間為色譜定性依據。但同一組份的保留時間與流速有關，因此有時需用保留體積來表示保留值。

當前27頁，總共102頁。d.死體積V0：色譜柱管內固定相顆粒間空隙、色譜儀管路和連接頭間空隙和檢測器間隙的總和。忽略后兩項可得到：當前28頁，總共102頁。其中，Fco為柱出口的載氣流速（mL/min)，其值為：F0-檢測器出口流速；Tr-室溫；Tc-柱溫；p0-大氣壓；pw-室溫時水蒸汽壓。當前29頁，總共102頁。e.保留體積Vr：指從進樣到待測物在柱后出現濃度極大點時所通過的流動相的體積。

當前30頁，總共102頁。f.調整保留體積：某組份的保留體積扣除死體積后的體積。當前31頁，總共102頁。g.相對保留值r2,1：組份2的調整保留值與組份1的調整保留值之比。當前32頁，總共102頁。注意：r2,1只與柱溫和固定相性質有關，而與柱內徑、柱長L、填充情況及流動相流速無關，因此，在色譜分析中，尤其是GC中廣泛用于定性的依據！具體做法：固定一個色譜峰為標準s，然后再求其它峰i對標準峰的相對保留值，此時以

表示：>1,又稱選擇因子。當前33頁，總共102頁。h.區(qū)域寬度：色譜峰的區(qū)域寬度是色譜流出曲線的重要參數之一，可用于衡量色譜柱的柱效及反映色譜操作條件下的動力學因素。寬度越窄，其效率越高，分離的效果也越好。當前34頁，總共102頁。區(qū)域寬度通常有三種表示方法：標準偏差：峰高0.607倍處峰寬處的一半。半峰寬W1/2：峰高一半處的峰寬。W1/2=2.354峰底寬W：色譜峰兩側拐點上切線與基線的交點間的距離。W=4當前35頁，總共102頁。色譜流出曲線的意義：色譜峰數=樣品中單組份的最少個數；色譜保留值——定性依據；色譜峰高或面積——定量依據；色譜保留值或區(qū)域寬度——色譜柱分離效能評價指標；色譜峰間距——固定相或流動相選擇是否合適的依據。當前36頁，總共102頁?！?.3色譜法基本原理色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離，組分要達到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數決定的，即與色譜過程的熱力學性質有關。但當兩峰間雖有一定距離，如果每個峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質和擴散行為決定的，即與色譜過程的動力學性質有關。因此，要從熱力學和動力學兩方面來研究色譜行為。

當前37頁，總共102頁。一、描述分配過程的參數1、分配系數(K)：如前所述，分配色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動相之間反復多次地分配過程，而吸附色譜的分離是基于反復多次地吸附一脫附過程。這種分離過程經常用樣品分子在兩相間的分配來描述，而描述這種分配的參數稱為分配系數。當前38頁，總共102頁。它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度之比值，即

K只與固定相和溫度有關，與兩相體積、柱管特性和所用儀器無關。當前39頁，總共102頁。分配系數K的討論試樣品一定時，K主要取決于固定相性質一定溫度下，組分的分配系數K越大，出峰越慢；每個組份在各種固定相上的分配系數K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎；某組分的K=0時，即不被固定相保留，最先流出。當前40頁，總共102頁。在一定條件下，各種物質的K是不同的。K較小的組分在色譜分析中每次分配后在氣相中的濃度較大，因此較早流出色譜柱。K較大的組分每次分配后在氣相中濃度較小，因此較晚流出色譜柱。當前41頁，總共102頁。當分配次數足夠多時，就能將具有不同K的組分分開。所以，我們可以認為，氣相色譜法是利用不同的物質具有不同的K而進行分離的。而K的不同則是由于各組分在固定相中的溶解度（對氣-液色譜）或吸附能力（對氣-固色譜）不同而造成的。當前42頁，總共102頁。2.分配比：在一定溫度和壓力下，組份在兩相間的分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質量比，稱為分配比。它反映了組分在柱中的遷移速率。又稱保留因子。也叫容量因子或容量比。

其其中VmV0，Vs為固定相體積當前43頁，總共102頁。分配比k的求算：k也等于組分的校正保留時間與死時間的比值因此，k可通過實驗測得。由此也可知道，k可表示出組分在柱中停留時間的長短。k越大，停留時間也就越長。當前44頁，總共102頁。稱為相比率，它也是反映色譜柱柱型特點的參數。對填充柱，=6~35；對毛細管柱，=60~600。3.K與k的關系：當前45頁，總共102頁。4.

選擇因子：色譜柱對A、B兩組分的選擇因子定義如下：A為先流出的組分，B為后流出的組分。當前46頁，總共102頁。注意：K或k反映的是某一組分在兩相間的分配；而是反映兩組分間的分離情況！當兩組分K或k相同時，=1時，兩組分不能分開；當兩組分K或k相差越大時，越大，分離得越好。也就是說，兩組分在兩相間的分配系數不同，是色譜分離的先決條件。和k是計算色譜柱分離效能的重要參數！當前47頁，總共102頁。二、塔板理論塔板理論是描述色譜柱中組分在兩相間的分配狀況及評價色譜柱的分離效能的一種半經驗式的理論。塔板理論將一根色譜柱當作一個由許多塔板組成的精餾塔，用塔板概念來描述組分在柱中的分配行為。塔板是從精餾中借用的，是一種半經驗理論，但它成功地解釋了色譜流出曲線呈正態(tài)分布。

當前48頁，總共102頁。當前49頁，總共102頁。塔板理論假定：1）塔板之間不連續(xù)；2）塔板之間無分子擴散；3）組分在各塔板內兩相間的分配瞬間達至平衡，達一次平衡所需柱長為理論塔板高度H；4）某組分在所有塔板上的分配系數相同；5）流動相以不連續(xù)方式加入，即以一個一個的塔板體積加入。

當前50頁，總共102頁。(一）、色譜分離過程：塔板理論是把色譜柱假想為一個精餾塔，塔內存在許多塔板，組分在每個塔板的氣相和液相間進行分配，達成一次分配平衡。然后隨著流動相按一個塔板、一個塔板的方式向前移動。經過多次分配平衡后，分配系數小的組分，先離開蒸餾塔（色譜柱），分配系數大的組分后離開蒸餾塔（色譜柱），從而使分配系數不同的組分彼此得到分離。當前51頁，總共102頁。分離過程如下圖所示當前52頁，總共102頁。當前53頁，總共102頁。下面我們再舉一個例子說明組分在色譜柱中的分配情況。為簡單起見，設色譜柱由5塊塔板（n=5n為柱子的塔板數）組成，并以r表示塔板編號．r=0，1，2，3，4，5；某組分的分配比k=1。根據上述假定．在色譜分離過程中。該組分的分布可計算如下：

當前54頁，總共102頁。開始時，將單位質量（即m=1）的該組分進入0號塔板上，然后將流動相以一個板體積（△V）一個板體積的脈動形式進入色譜柱；此時組分將安下表所示在固定相和流動相進行分配：當前55頁，總共102頁。板號r載氣體積0123進樣mM0.5mS0.5△VmM0.250.25mS0.250.252△VmM0.1250.125+0.1250.125mS0.1250.125+0.1250.1253△VmM0.0630.063+0.1250.063+0.1250.063mS0.0630.063+0.1250.063+0.1250.063當前56頁，總共102頁。按上述分配過程，對于n=5，k=1，m=1的體系，隨著進入柱中板體積載氣的增加，組分分布在柱內任一板上的總量（氣相和液相的總質量）見下表：當前57頁，總共102頁。rn01234出口010000010.50.5000020.250.50.2500030.1250.3750.3750.1250040.0630.250.3750.250.063050.0320.1570.3130.3130.1570.032當前58頁，總共102頁。60.0160.0950.2350.3130.2350.07970.0080.0560.1160.2740.2740.11880.0040.0320.0860.1960.2740.13390.0020.0180.0590.1410.2360.138100.0010.0100.0380.1000.1890.118當前59頁，總共102頁。

n

r01234出口1100.0050.0240.0690.1450.0951200.0020.0160.0460.1070.0731300.0010.0080.0300.0760.05414000.0040.0190.0530.03815000.0020.0120.0360.02816000.0010.0080.0240.018當前60頁，總共102頁。由表中可見，當n=5時，即5個塔板體積的流動相進入柱中時，組分就開始從柱口流出。并且呈現先小后大的情況。當前61頁，總共102頁。以上是當塔板數為5時的情況，出現的峰形不對稱，這是由于塔板數太少的原因。當塔板數大于50時，峰形就是對稱的。在實際色譜柱中，n值很大（約為106～109）。所以色譜峰一般為正態(tài)分布。當前62頁，總共102頁。（二）柱效能指標：對于一個色譜柱來說，其分離能力（叫柱效能）的大小主要與塔板的數目有關，塔板數越多，柱效能越高。色譜柱的塔板數可以用理論塔板數和有效塔板數來表示。當前63頁，總共102頁。式中：tR為某組分的保留時間；W1/2為某組分色譜峰的半寬度；W為色譜峰的峰底寬度。由式可見，柱子的理論塔板數與峰寬和保留時間有關。保留時間越大，峰越窄，理論塔板數就越多。柱效能也就越高。1．理論塔板數n：對于一個柱子下說，其理論塔板數可由下式計算：當前64頁，總共102頁。對于一個柱長固定為L的柱子，其理論塔板高度H為每一個塔板的高度，即組分在柱內每達成一次分配平衡所需要的柱長叫理論塔板高度。它越小，也表示柱效能越高。當前65頁，總共102頁。2．有效塔板數n有效：在以上計算理論塔板數的式子中使用的是保留時間，它包括了死時間，它與組分在柱內的分配無關，因此不能真正反映色譜柱的柱效。為此，引入了有效塔板數的概念。當前66頁，總共102頁。同理有效塔板高度為：當前67頁，總共102頁。3.塔板理論的特點：(1)當色譜柱長度一定時，塔板數n越大(塔板高度H越小)，被測組分在柱內被分配的次數越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。(2)不同物質在同一色譜柱上的分配系數不同，用有效塔板數和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質。(3)柱效不能表示被分離組分的實際分離效果，當兩組分的分配系數K相同時，無論該色譜柱的塔板數多大，都無法分離。(4)塔板理論無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。當前68頁，總共102頁。三．速率理論——范弟姆特方程式：

塔板理論是一個半經驗性的理論。它定性的給出了板高的概念，但不能指出影響板高的因素。速率理論就是在塔板理論的基礎上，給出了影響塔板高度的因素：

當前69頁，總共102頁。u為流動相線速度；A，B，C為常數，其中A—分別表示渦流擴散系數；B—分子擴散系數；C—傳質阻力系數（包括液相和固相傳質阻力系數）。該式從動力學角度很好地解釋了影響板高（柱效）的各種因素！任何減少方程右邊三項數值的方法，都可降低H，從而提高柱效。當前70頁，總共102頁。1）渦流擴散項(A)在填充柱中，由于受到固定相顆粒的阻礙，組份在遷移過程中隨流動相不斷改變方向，形成紊亂的“渦流”：從圖中可見，因填充物顆粒大小及填充的不均勻性——同一組分運行路線長短不同——流出時間不同——峰形展寬。展寬程度以A表示：A=2dp其中dp—填充物平均直徑；—填充不規(guī)則因子?？梢?，使用細粒的固定相并填充均勻可減小A，提高柱效。對于空心毛細管柱，無渦流擴散，即A=0。流動方向當前71頁，總共102頁。當前72頁，總共102頁。2）分子擴散項(B/u)縱向分子擴散是由于濃度梯度引起的。當樣品被注入色譜柱時，它呈“塞子”狀分布。隨著流動相的推進，“塞子”因濃度梯度而向前后自發(fā)地擴散，使譜峰展寬。其大小為B=2D—稱為彎曲因子，它表示固定相幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況；D—組分在流動相中的擴散系數。組份為氣體或液體時，分別以Dg或Dm表示；當前73頁，總共102頁。討論：分子量大的組分，Dg小，即B小Dg

隨柱溫升高而增加，隨柱壓降低而減??；流動相分子量大，Dg小，即B??；u增加，組份停留時間短，縱向擴散??；（B/u）

對于液相色譜，因Dm較小，B項可勿略。球狀顆粒；大分子量流動相；適當增加流速；短柱；低溫。當前74頁，總共102頁。3）傳質阻力項(Cu)因傳質阻力的存在，使分配不能“瞬間”達至平衡，因此產生峰形展寬。氣相色譜以氣體為流動相，液相色譜以液體為流動相，二者傳質過程不完全相同。下面分別作討論。a）氣液色譜：傳質阻力項C包括氣相傳質阻力系數Cs和液相傳質阻力系數Cl。當前75頁，總共102頁。流動相固液界面固定液組分分子ClCg當前76頁，總共102頁。討論：減小填充顆粒直徑dp；采用分子量小的流動相，使Dg增加；減小液膜厚度df，Cl下降。但此時k又減小。因此，當保持固定液含量不變時，可通過增加固定液載體的比表面來降低df。但比表面過大又會因吸附過強使峰拖尾。增加柱溫，可增加Dl，但k值也減小，為保持合適Cl值，應控制柱溫。當前77頁，總共102頁。b）液液色譜：傳質阻力項C包括流動相傳質阻力系數Cm和固定相傳質阻力系數Cs。sm當前78頁，總共102頁。討論：流動相傳質阻力包括兩方面：流動相中的傳質阻力Cm、滯留的流動相傳質阻力Cs。分別與填充物大小dp、擴散系數(Dm)、微孔大小及其數量等有關。因此，降低流動相傳質阻力的方法有：細顆粒固定相、增加組分在固定相和流動相中的擴散系數D、適當降低線速度、短柱。固定相傳質阻力與液膜厚度df、保留因子k和擴散系數Ds等有關。因此，降低固定相傳質阻力的方法有：與氣液色譜中液相傳質阻力的表述相同。當前79頁，總共102頁。4）流速u由方程H=A+B/u+Cu知道：當u一定時，僅在A、B、C較小時，H較小，柱效較高；反之則柱效較低，色譜峰將展寬。以u對H作圖，可得H-u曲線（如圖），從該曲線得到：當前80頁，總共102頁。板高，H(cm)HminA+B/u+CuCmuCsuAB/u當前81頁，總共102頁。渦流擴散項A與流速u無關；低流速區(qū)(u小)，B/u大，分子擴散項占主導，此時選擇分子量大的氣體如N2和Ar為載氣，可減小擴散，提高柱效；高流速區(qū)(u大)，Cu大，傳質阻力項占主導，此時選擇分子量小的氣體如H2和He為載氣，可增加擴散系數，提高柱效；

LC的Hmin和uopt均比GC的小一個數量級，即在

LC中，較低流速可獲得較大的柱效。曲線的最低點對應最佳線速uopt()下的最小板高Hmin()；當前82頁，總共102頁。5）固定相顆粒大小對板高的影響實驗表明，顆粒越細，板高越小，受線速影響越小。即，在HPLC分析中采用細粒作固定相的理論根據！但顆粒細導致柱流速慢，當采用高壓技術，才能實現HPLC的分析要求。當前83頁，總共102頁。板高,H(cm)當前84頁，總共102頁。上面分別介紹了影響色譜分離的基本原理以及影響柱效的各種因素，但是如何從總體上定量描述色譜分離效能？如何將各種影響因素對分離的影響定量地表述出來呢？當前85頁，總共102頁?！?.4分離度及色譜分離方程一、分離度(Resolution,R)同時反映色譜柱效能和選擇性的一個綜合指標。也稱總分離效能指標或分辨率。其定義為：用此式，可直接從色譜流出曲線上求出分離度R。當前86頁，總共102頁。色譜分離中的四種典型情況①分離效果差，柱效低，選擇性（）低②完全分離，柱效高，峰窄，選擇性（）低；③完全分離，選擇性（）增加，柱效低，峰寬④完全分離，柱效高，選擇性（）好當前87頁，總共102頁。R越大，相鄰組分分離越好。當R=1.5時，分離程度可達99.7%，因此R=1.5通常用作是否分開的判據。當前88頁，總共102頁。R=1.5R=0.75R=1.0響應信號保留時間t,min當前89頁，總共102頁。二、色譜分離方程R的定義并未反映影響分離度的各種因素。也就是說，R未與影響其大小的因素：柱效n、選擇因子和保留因子k聯系起來。對于相鄰的難分離組分，由于它們的分配系數K相差小，可合理假設k1k2=k，W1W2=W。因此可導出R與n、和k的關系：當前90頁，總共102頁。有關色譜方程的討論：1）分離度R與柱效的關系分離度R與理論塔板數n有關，即R受熱力學性質的影響。對具一定相對保留值的物質對，R與有效塔板數neff有關，說明neff可正確代表柱效能。由色譜方程可得：因此可通過增加柱長提高分離度。然而，分析時間也相應增加，且峰寬也展寬！為提高柱效，用減小塔板高度H的方法比增加柱長更有效。當前91頁，總共102頁。2）分離度R與保留