第十五章重組技術(shù)的基本原理

第十五章重組技術(shù)的基本原理演示文稿當(dāng)前1頁，總共42頁。（優(yōu)選）第十五章重組技術(shù)的基本原理當(dāng)前2頁，總共42頁。一、重要的工具酶及其作用特點(diǎn)一般把DNA分子切割、DNA片段末端修飾和DNA片段連接等所用的酶稱為工具酶。（一）限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）：是一類以環(huán)狀或線形雙鏈DNA為底物，能識(shí)別DNA中的特定核苷酸序列，并在合適反應(yīng)條件下，使每條的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生３'-OH和5'-P基團(tuán)DNA片段的內(nèi)脫氧核酸酶(endodeoxyribonuclease)。當(dāng)前3頁，總共42頁。當(dāng)前4頁，總共42頁。（二）DNA連接酶DNA連接酶（ligase）：能夠催化兩個(gè)DNA片段末端之間的-P基團(tuán)和-OH基團(tuán)形成磷酸二酯鍵的酶。當(dāng)前5頁，總共42頁。（三）DNA聚合酶當(dāng)前6頁，總共42頁。當(dāng)前7頁，總共42頁。（四）逆轉(zhuǎn)錄酶當(dāng)前8頁，總共42頁。（五）RNA聚合酶當(dāng)前9頁，總共42頁。當(dāng)前10頁，總共42頁。二、目的基因的載體類型及其功能載體（vector）:能夠攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子?；蚩寺≥d體必備條件：（1）受體細(xì)胞本來就有的或受體細(xì)胞可以接受的；（2）具有能使外源DNA片段插入的多克隆位點(diǎn)（MCS，multiplecloningsite）；（3）能進(jìn)行自我復(fù)制，具有復(fù)制原點(diǎn)（ORI，origin）；（4）具有選擇標(biāo)記，承載外源DNA片段的載體進(jìn)入細(xì)胞后，以便篩選克隆子。當(dāng)前11頁，總共42頁。（一）質(zhì)粒及其功能當(dāng)前12頁，總共42頁。當(dāng)前13頁，總共42頁。（二）噬菌體及其功能當(dāng)前14頁，總共42頁。（三）考斯質(zhì)粒當(dāng)前15頁，總共42頁。（四）動(dòng)物病毒的載體作用當(dāng)前16頁，總共42頁。

（五）植物寄生菌作為目的DNA的載體

Ti質(zhì)粒（Tiplasmid）：是一種細(xì)菌質(zhì)粒，存在于土壤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens）（革蘭氏陰菌）細(xì)胞中，可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生瘤細(xì)胞(Tumor-inducing,Ti)，冠癭瘤（growngalltumors)。

當(dāng)前17頁，總共42頁。誘導(dǎo)植物產(chǎn)生瘤細(xì)胞當(dāng)前18頁，總共42頁。第二節(jié)DNA重組的基本技術(shù)步驟1、目的基因的制備2、目的基因與載體的重組3、重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增4、克隆基因的鑒定當(dāng)前19頁，總共42頁。當(dāng)前20頁，總共42頁。ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmolecule

Introductionintohostcellsbytransformationofviralinfection

HostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+當(dāng)前21頁，總共42頁。一、目的基因的制備方法

基因工程的主要目的是通過優(yōu)良性狀相關(guān)基因的重組，獲得具有高度應(yīng)用價(jià)值的新物種。

為此，必須從現(xiàn)有生物群體中，根據(jù)需要分離用于克隆的此類基因，這樣的基因通常稱為目的基因。當(dāng)前22頁，總共42頁。（一）建立DNA文庫(kù)某種生物基因組全部遺傳信息的一系列DNA片段，通過克隆載體貯存在一種受體菌的群體之中，這種包含某生物基因組全部DNA片段受體菌群體（一套克?。┓Q為這種生物的基因組文庫(kù)。當(dāng)前23頁，總共42頁。基因組文庫(kù)建立順序當(dāng)前24頁，總共42頁?；蛭膸?kù)和cDNA文庫(kù)的建立組織可克隆之DNA載體DNAcDNAmRNA部分或完全酶解DNADNA長(zhǎng)度分級(jí)甲基化，雙鏈接頭DNADNA與載體連接引入大腸桿菌鑒定文庫(kù)的滴度和特性擴(kuò)增后供長(zhǎng)期儲(chǔ)存篩選出所需要的克隆當(dāng)前25頁，總共42頁。（三）人工合成DNA片段當(dāng)前26頁，總共42頁。（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA

1PCR的原理：1985年Mullis發(fā)明PCR（

polymerasechainreaction）快速擴(kuò)增DNA的方法。該法模仿體內(nèi)DNA的復(fù)制過程，首先使DNA變性，兩條鏈解開，然后使引物模板退火，二者堿基配對(duì)，DNA聚合酶隨即以4種dNTP為底物，在引物的引導(dǎo)下合成與模板互補(bǔ)的DNA新鏈。重復(fù)此過程，DNA以指數(shù)方式擴(kuò)增。擴(kuò)增的公式為:Y=(1+X)n

式中y一產(chǎn)量;X--擴(kuò)增效率;n一循環(huán)次數(shù)。當(dāng)前27頁，總共42頁。PCR技術(shù)原理示意圖靶序列變性和引物復(fù)姓循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3變性和引物復(fù)姓鏈延伸Tag酶鏈延伸當(dāng)前28頁，總共42頁。二、目的DNA和載體的體外連接目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前，一般須先把含目的基因的DNA片段組入合適的克隆載體。當(dāng)前29頁，總共42頁。三、將重組的DNA復(fù)合物導(dǎo)入受體細(xì)胞基因克隆的受體細(xì)胞：是能攝取外源DNA(基因)并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞。目前用作基因克隆受體的原核生物主要是大腸桿菌，藍(lán)藻和農(nóng)桿菌等也被廣泛應(yīng)用。感受態(tài)細(xì)胞:指處于能攝取外界DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞。當(dāng)前30頁，總共42頁。

（一）重組DNA分子轉(zhuǎn)化

大腸桿菌是用得最廣泛的基因克隆受體。轉(zhuǎn)化（transformation）：攜帶目的基因的外源DNA分子通過與膜結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞，并在其中穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程。以質(zhì)粒為載體。

當(dāng)前31頁，總共42頁。轉(zhuǎn)化當(dāng)前32頁，總共42頁。（二）噬菌體重組體的轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染：通過噬菌體(病毒)顆粒感染，把DNA導(dǎo)入被感染的受體細(xì)胞的過程。含目的基因的DNA與噬菌體（病毒）載體的重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，必須進(jìn)行體外包裝。當(dāng)前33頁，總共42頁。四、重組克隆的篩選方法（一）利用載體的特殊標(biāo)記進(jìn)行篩選當(dāng)前34頁，總共42頁。當(dāng)前35頁，總共42頁。（二）對(duì)菌落原位雜交法鑒定克隆先制備含目的基因的DNA片段的探針，隨后采用斑點(diǎn)雜交或DNA印跡(southernblotting)等方法進(jìn)行鑒定。（1）斑點(diǎn)雜交法提取待鑒定的克隆子的總DNA，直接固定在分子雜交的膜上，用含目的基因DNA片段的探針與其雜交，若出現(xiàn)明顯的雜交信號(hào)，可認(rèn)為是真的克隆子。當(dāng)前36頁，總共42頁。（2）southern雜交法斑點(diǎn)雜交、菌落雜交和噬菌斑雜交只能說明克隆子中含目的基因，但不能顯示目的基因定位在受體細(xì)胞內(nèi)的染色體基因組上還是其他基因組上。而southern雜交（DNA印跡）則可對(duì)它進(jìn)行定位。

當(dāng)前37頁，總共42頁。（三）免疫學(xué)方法鑒定克隆蛋白質(zhì)印跡（westernblotting）法：提取克隆子總蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳按分子大小分開后，轉(zhuǎn)移到供雜交用的膜上，隨后與放射性同位素或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，通過抗原抗體反應(yīng)，在雜交膜上顯示出明顯的雜交信號(hào)，表明受體細(xì)胞中存在目的基因表達(dá)產(chǎn)物。當(dāng)前38頁，總共42頁。第三節(jié)DNA重組技術(shù)的應(yīng)用前景當(dāng)前39頁，總共42頁?；蚬こ虘?yīng)用大腸桿菌生產(chǎn)人類生長(zhǎng)激素當(dāng)前40頁，總共42頁。二、植物基因