膜片鉗技術(shù)的原理與日常維護(hù)詳解

膜片鉗技術(shù)的原理與日常維護(hù)詳解演示文稿當(dāng)前1頁，總共33頁。（優(yōu)選）膜片鉗技術(shù)的原理與日常維護(hù)當(dāng)前2頁，總共33頁。細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和離子通道：細(xì)胞膜由脂質(zhì)雙分子層和蛋白質(zhì)組成，蛋白質(zhì)又包括整合蛋白和表面蛋白。第一部分：膜片鉗基礎(chǔ)及原理當(dāng)前3頁，總共33頁。離子通道是一種特殊的膜蛋白，它橫跨整個(gè)膜結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞內(nèi)部與部外聯(lián)系的橋梁和細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換的孔道，當(dāng)通道開放時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的一些無機(jī)離子如Na,kCa等帶電離子可經(jīng)通道順濃度梯度或電位梯度進(jìn)行跨膜擴(kuò)散，從而形成這些帶電離子在膜內(nèi)外的不同分布態(tài)勢(shì)，這種態(tài)勢(shì)和在不同狀態(tài)下的動(dòng)態(tài)變化是可興奮細(xì)胞靜息電位和動(dòng)作電位的基礎(chǔ)。這些無機(jī)離子通過離子通道的進(jìn)出所產(chǎn)生的電活動(dòng)是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，只有在此基礎(chǔ)上才可能有腺體分泌、肌肉收縮、基因表達(dá)、新陳代謝等生命活動(dòng)。離子通道結(jié)構(gòu)和功能障礙決定了許多疾病的發(fā)生和發(fā)展。因此，了解離子通道的結(jié)構(gòu)、功能以及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系對(duì)于從分子水平深入探討某些疾病的病理生理機(jī)制、發(fā)現(xiàn)特異性治療藥物或措施等均具有十分重要的理論和實(shí)際意義.當(dāng)前4頁，總共33頁。如何研究離子通道對(duì)離子通道的研究主要從結(jié)構(gòu)、功能以及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系三方面進(jìn)行研究1.結(jié)構(gòu)研究：分子生物學(xué)方法確定蛋白質(zhì)序列；X光繞射方法確定其三維立體結(jié)構(gòu)。2.功能研究：電生理測(cè)定通過離子通道的電流或測(cè)量細(xì)胞膜電流或膜電位的變化，反映離子通道個(gè)體或群體的分子活動(dòng)。3.結(jié)構(gòu)和功能相結(jié)合：利用基因突變技術(shù)在一級(jí)結(jié)構(gòu)的特定部位刪除、添加或改變殘基的序列，然后檢測(cè)突變后的功能改變。當(dāng)前5頁，總共33頁。離子通道功能觀察的兩種技術(shù)對(duì)離子通道功能的研究，主要采用記錄離子通道電流來間接反映離子通道功能，目前有如下兩種技術(shù)電壓鉗(Voltageclamp)技術(shù)膜片鉗(patchclamp)技術(shù)當(dāng)前6頁，總共33頁。電壓鉗技術(shù)(VoltageClamp)：電壓鉗技術(shù)，是20世紀(jì)初由Cole發(fā)明，Hodgkin和Huxley完善，其設(shè)計(jì)的主要目的是為了證明動(dòng)作電位的產(chǎn)生機(jī)制，即動(dòng)作電位的峰電位是由于膜對(duì)鈉的通透性發(fā)生了一過性的增大過程。但當(dāng)時(shí)沒有直接測(cè)定膜通透性的方法，于是就用膜對(duì)某種離子的電導(dǎo)來代表該種離子的通透性，膜電導(dǎo)測(cè)定的依據(jù)是電學(xué)中的歐姆定律，如膜的Na電導(dǎo)GNa與電化學(xué)驅(qū)動(dòng)力（Em-ENa)和膜電流INa的關(guān)系GNa=INa/（Em-ENa).因此可通過測(cè)量膜電流，再利用歐姆定律來計(jì)算膜電導(dǎo)，但是，利用膜電流來計(jì)算膜電導(dǎo)時(shí)，記錄膜電流期間的膜電位必須保持不變，否則膜電流的變化就不能代表膜電導(dǎo)的變化。這一條件是利用電壓鉗技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。下張幻燈中的右邊兩張圖是Hodgkin和Huxley在半個(gè)世紀(jì)以前利用電壓鉗記錄的搶烏賊的動(dòng)作電位和動(dòng)作電位過程中的膜電流的變化圖，他們的實(shí)驗(yàn)首次證明參與動(dòng)作電位的離子流由Na,k,漏（Cl）三種成分組成。并對(duì)這些離子流進(jìn)行了定量分析。這一技術(shù)對(duì)闡明動(dòng)作電位的本質(zhì)和離子通道的的研究做出了極大的貢獻(xiàn)。當(dāng)前7頁，總共33頁。coleK+電流Na+電流當(dāng)前8頁，總共33頁。電壓鉗的原理：用兩根尖端直徑0.5um的電極插入細(xì)胞內(nèi)，一根電極用作記錄電極以記錄跨膜電位，用另一根電極作為電流注入電極，以固定膜電位。從而實(shí)現(xiàn)固定膜電位的同時(shí)記錄膜電流。電位記錄電極引導(dǎo)的膜電位（Vm）輸入電壓鉗放大器的負(fù)輸入端，而人為控制的指令電位（Vc）輸入正輸入端，放大器的正負(fù)輸入端子等電位，向正輸入端子施加指令電位（Vc）時(shí)，經(jīng)過短路負(fù)端子可使膜片等電位，即Vm=Vc,從而達(dá)到電位鉗制的目的，并可維持一定的時(shí)間。Vc的不同變化將導(dǎo)致Vm的變化，從而引起細(xì)胞膜上電壓依賴性離子通道的開放，通道開放引起的離子流反過來又引起Vm的變化，致使Vm≠Vc,Vc與Vm的任何差值都會(huì)導(dǎo)致放大器有電壓輸出，將相反極性的電流注入細(xì)胞，以使Vc=Vm，注入電流的大小與跨膜離子流相等，但方向相反。因而注入的電流被認(rèn)為是標(biāo)本興奮時(shí)的跨膜電流值（通道電流）。指令電位（Vc)+_Vo電位記錄電極（Vm)電流注入電極(I)當(dāng)前9頁，總共33頁。電壓鉗的缺點(diǎn)：電壓鉗技術(shù)目前主要用于巨大細(xì)胞的全細(xì)胞電流研究，特別在分子克隆的卵母細(xì)胞表達(dá)電流的鑒定中發(fā)揮其它技術(shù)不能替代的作用。但也有其致命的弱點(diǎn)：1、微電極需刺破細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，以致造成細(xì)胞漿流失，破壞了細(xì)胞生理功能的完整性；2、不能測(cè)定單一通道電流。因?yàn)殡妷恒Q制的膜面積很大，包含著大量隨機(jī)開放和關(guān)閉著的通道，而且背景噪音大，往往掩蓋了單一通道的電流。

3、對(duì)體積小的細(xì)胞(如哺乳類中樞神經(jīng)元，直徑在10－30μm之間)進(jìn)行電壓鉗實(shí)驗(yàn)，技術(shù)上有更大的困難。由于電極需插入細(xì)胞，不得不將微電極的尖端做得很細(xì)，如此細(xì)的尖端致使電極阻抗很大，常常是60～8OMΩ或120～150MΩ（取決于不同的充灌液）。這樣大的電極阻抗不利于作細(xì)胞內(nèi)電流鉗或電壓鉗記錄時(shí)在短時(shí)間（0.1μs）內(nèi)向細(xì)胞內(nèi)注入電流，達(dá)到鉗制膜電壓或膜電流之目的。再者，在小細(xì)胞上插入的兩根電極可產(chǎn)生電容而降低測(cè)量電壓電極的反應(yīng)能力.當(dāng)前10頁，總共33頁。NeherSakmannHodgkinHuxley1963年諾貝爾獎(jiǎng)，提出離子通道概念1991年諾貝爾獎(jiǎng)，提出膜片鉗技術(shù)當(dāng)前11頁，總共33頁。膜片鉗

(Patch-clamp)技術(shù)探頭計(jì)算機(jī)模數(shù)轉(zhuǎn)換膜片鉗放大器樣品池單細(xì)胞當(dāng)前12頁，總共33頁。膜片鉗（PatchClamp)的基本原理利用尖端直徑0.5-1um的玻璃電極吸附到細(xì)胞膜表面，通過負(fù)壓吸引使電極尖端和細(xì)胞膜形成緊密封接，使與電極尖開口處相接的細(xì)胞膜小片區(qū)域（patch）與其周圍在電學(xué)上絕緣，在此基礎(chǔ)上固定膜電位(clamp)，然后對(duì)電極尖端下面積僅為幾平方微米的細(xì)胞膜片上一個(gè)或幾個(gè)離子通道的電流進(jìn)行記錄。從而將電生理學(xué)技術(shù)提高到記錄和研究單個(gè)蛋白質(zhì)的分子水平.當(dāng)前13頁，總共33頁。膜片鉗與電壓鉗的區(qū)別

膜片鉗

電壓鉗

相同點(diǎn)都是通過鉗制膜電位而記錄離子通道電流

不同點(diǎn)

鉗制方法不同高阻封接細(xì)胞內(nèi)插入電極所用電極不同低阻抗電極2-15MΩ高阻抗電極10-100MΩ鉗制面積不同小片膜整個(gè)或大塊細(xì)胞膜記錄的通道數(shù)不同一個(gè)或幾個(gè)所有通道當(dāng)前14頁，總共33頁。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，可組建不同的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。但也有一些共同的基本組成部件，其中包括電子學(xué)部件:放大器；計(jì)算機(jī)接口，數(shù)據(jù)采集、分析系統(tǒng)。光學(xué)部件和光電接口：顯微鏡；監(jiān)視器等。機(jī)械系統(tǒng):防震臺(tái)等。輔助系統(tǒng)：電極拉制器；切片機(jī)；孵育槽；灌流系統(tǒng)等第二部分:膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)組成當(dāng)前15頁，總共33頁。HekaEPC10單細(xì)胞膜片鉗系統(tǒng)當(dāng)前16頁，總共33頁。HekaEPC10腦片膜片鉗系統(tǒng)當(dāng)前17頁，總共33頁。Axon200B單細(xì)胞膜片鉗系統(tǒng)當(dāng)前18頁，總共33頁。Axon200B腦片膜片鉗系統(tǒng)當(dāng)前19頁，總共33頁。Axon700B腦片膜片鉗系統(tǒng)當(dāng)前20頁，總共33頁。EPC10doubleEPC10plus國內(nèi)正規(guī)代理商：北京先儀譜科技有限公司Add:北京市海淀區(qū)善緣街1號(hào)立方庭1-921室Website:Tel漢東樂科技有限公司地址：武漢市江漢區(qū)常青路284號(hào)航天花園301-1-3B室網(wǎng)站：電話前21頁，總共33頁。Axon200BAxon700B國內(nèi)正規(guī)代理商北京馬普科學(xué)儀器有限公司地址：北京市朝陽區(qū)立湯路218號(hào)明天生活館C1546網(wǎng)站：電話18901292166E-mail:sheneo@當(dāng)前22頁，總共33頁。細(xì)胞貼附式全細(xì)胞記錄式外面向外式內(nèi)面向外式單通道電流膜電位或膜電流膜片鉗的幾種記錄模式極其形成：各種記錄模式的形成過程第三部分：膜片鉗實(shí)驗(yàn)操作指南當(dāng)前23頁，總共33頁。當(dāng)前24頁，總共33頁。膜片鉗實(shí)驗(yàn)的基本過程：1、液體配制：主要根據(jù)研究通道的不同，配制相應(yīng)的液體，基本原則是保持兩個(gè)平衡：滲透壓平衡和酸堿平衡。所有液體在使用前必須過濾。2.標(biāo)本制備3.記錄4、資料分析：（1）一般電學(xué)性質(zhì)：通過I-V關(guān)系計(jì)算單通道電導(dǎo)，觀察通道有無整流。通過離子選擇性、翻轉(zhuǎn)電位或其它通道激活條件初步確定通道類型。（2）動(dòng)力學(xué)：開放時(shí)間、開放概率、關(guān)閉時(shí)間、通道的時(shí)間依賴性失活、開放與關(guān)閉類型（簇狀猝發(fā)（Burst）樣開放與閃動(dòng)樣短暫關(guān)閉（flickering）），化學(xué)門控性通道的開、關(guān)速率常數(shù)等。（3）通過對(duì)全細(xì)胞激活曲線或失活曲線的分析，可得到半數(shù)激活或失活電壓Vh及斜率因子K。（4）藥理學(xué)：阻斷劑、激動(dòng)劑或其它調(diào)制因素對(duì)通道活動(dòng)的影響。（5）綜合分析得到最后結(jié)論。

當(dāng)前25頁，總共33頁。10μM10μMa膜片鉗使用的標(biāo)本

1.單細(xì)胞：急性分散細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞2.腦片或組織塊。3.整體動(dòng)物。要求：膜片鉗80%的時(shí)間在于制備細(xì)胞。細(xì)胞表面要干凈,不能有膠質(zhì)細(xì)胞等蛋白質(zhì)物質(zhì)。細(xì)胞狀態(tài)良好，表面光滑，無麻斑，無腫脹或皺縮。腦片單細(xì)胞當(dāng)前26頁，總共33頁。電流信號(hào)單通道電流全細(xì)胞電流突觸電流電壓信號(hào)閾電位靜息電位動(dòng)作電位膜片鉗記錄的信息電壓鉗模式電流鉗模式當(dāng)前27頁，總共33頁。1.單通道電流1.典型的單通道電流呈一種振幅相同而持續(xù)時(shí)間不等的脈沖樣變化。有兩個(gè)電導(dǎo)水平，即0和1，分別對(duì)應(yīng)通道的關(guān)閉和開放狀態(tài)。2.有的矩形脈沖簇狀發(fā)放時(shí)，通道電流不在同一水平，可以明顯觀察到不同數(shù)目離子通道所形成的電流臺(tái)階，從而可推斷出被測(cè)膜片的通道數(shù)目。3.有的通道可記錄到圓滑型和方波形兩種形式。4.有些通道開放活動(dòng)是持續(xù)開放，中間被閃動(dòng)樣的關(guān)閉所中斷，形成burst開放。有些通道開放活動(dòng)是簇狀開放與短期平靜交替出現(xiàn)，形成簇狀發(fā)放串（Cluster)當(dāng)前28頁，總共33頁。2.全細(xì)胞電流全細(xì)胞電流是一些形狀各異的電流曲線IAcurrents2nA20msNa+

currentsIKcurrentsVh=-80mV40mV-60mV當(dāng)前29頁，總共33頁。3.Glu受體電流2s1nA500ms1nA當(dāng)前30頁，總共33頁。250ms400pA5.mEPSC4.sEPSC突觸電流當(dāng)前31頁，總共33頁。6.神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢划?dāng)前32頁，總共33頁。第四部分：膜片鉗的應(yīng)用

膜片鉗技術(shù)發(fā)展至今，已經(jīng)成