高效液相色譜詳解

高效液相色譜詳解演示文稿當前1頁，總共40頁。優(yōu)選高效液相色譜當前2頁，總共40頁。一、液固吸附色譜法

固定相：硅膠：

YWG(無定形)5~6umYQG(球形)3~4um原理：吸附特點：峰易拖尾適用：分離極性化合物采用來固體吸附劑作為固定相高分子多孔微球：YSG

原理：吸附+分配兼小孔凝膠作用特點：柱選擇性好，峰形好，柱效低適用：分離弱極性化合物當前3頁，總共40頁。一、液固吸附色譜法流動相：底劑（烷烴）+有機極性調(diào)節(jié)劑例：正己烷或庚烷+氯仿---

分離機理:利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異溶質(zhì)分子極性↑，洗脫能力↓，k↑，tR↑溶劑系統(tǒng)極性↑，洗脫能力↑，k↓，tR↓出柱順序：強極性組分后出柱，弱極性組分先出柱硅膠吸水量↑，LSC→LLC當前4頁，總共40頁。二、液液分配色譜法

固定相：固定液——極性→NLLC固定液——非極性→RLLC載體+固定液（物理或機械涂漬法）缺點：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實用正相色譜——固定液極性>流動相極性（NLLC）反相色譜——固定液極性<流動相極性（RLLC）流動相：各種溶劑當前5頁，總共40頁。正相色譜極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱適于分離極性組分反相色譜極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于分離非極性組分

分離機理:利用組分在兩相中溶解度的差異二、液液分配色譜法當前6頁，總共40頁。三、反相鍵合相色譜法

固定相：采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠-C18H37（ODS，C18）、硅膠-苯基等流動相：極性較強的溶劑+極性調(diào)節(jié)劑：一般以水為基礎(chǔ)溶劑

例：水+甲醇，乙腈，THF當前7頁，總共40頁。

分離機理——疏溶劑作用理論非極性的烷基鍵合相——硅膠表面的十八烷基“分子毛”——較強的疏水特性。三、反相鍵合相色譜法當前8頁，總共40頁。分子中非極性部分——疏水烷基

——締合作用，分子保留分子極性部分——極性流動相

——離開固定相，減小保留兩種作用力之差，決定分子在色譜中的保留行為溶質(zhì)分子：同系物中，碳數(shù)越多，K越大引入極性基團，K值變小引入非極性基團，K值變大流動相：流動相的極性增加（增加水的含量），K值變大。溶質(zhì)的離解程度越高，K值越小。（可加入少量弱酸堿抑制解離，提高分離效果）當前9頁，總共40頁。改變流動相配比可分離極性化合物用水和無機鹽的緩沖液為流動相可分離易離解的樣品有機酸、有機堿等。

用途

三、反相鍵合相色譜法

主要用于分離非極性至中等極性的各類有機化合物當前10頁，總共40頁。固定相：采用極性大的氰基或氨基鍵合相四、正相鍵合相色譜法流動相：非極性或極性小的溶劑（如正已烷）+極性調(diào)節(jié)劑（如氯仿、甲醇，乙醇等）

分離機理：利用溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、誘導力、或氫鍵作用力當前11頁，總共40頁。四、正相鍵合相色譜法用途：多用于分離極性或中等極性化合物流動相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱極性大的組分后出柱氰基鍵合相：與硅膠的柱選擇性相似（極性稍小）分離物質(zhì)也相似氨基鍵合相：與硅膠性質(zhì)差別大，堿性分析極性大物質(zhì)、糖類等當前12頁，總共40頁。五、離子鍵合相色譜法

固定相：硅膠為基質(zhì)，鍵合各種離子交換基團，如一SO3H、一CH2NH2、－C00H流動相：一般采用緩沖溶液。分離原理：與離子交換色譜類同用途：多用于分離離子形化合物如酸、無機陰陽離子、氨基酸等當前13頁，總共40頁。六、反相離子對色譜法固定相：非極性鍵合相離子對試劑：烷基磺酸鈉→分析堿四丁基季胺鹽→分析酸流動相：極性流動相加入離子對試劑原理：被測組分與流動相中反離子形成中性離子對，增加k和tR，以改善分離用途：主要用來分離強極性有機酸和有機堿當前14頁，總共40頁。七、反相離子抑制色譜法固定相：非極性鍵合相調(diào)節(jié)流動相pH值，抑制組分解離以改善分離流動相：酸性物質(zhì)——加入酸HActR↑，k↑

堿性物質(zhì)——加入堿NH3·H2OtR↑，k↑調(diào)節(jié)pH范圍：3.0~8.0pH>8.0破壞鍵合相與載體的結(jié)合pH<3.0腐蝕柱子離子抑制劑：弱酸、弱堿性物質(zhì)、一定pH緩沖液用途：主要用來分離極弱酸堿、兩性化合物當前15頁，總共40頁。八、親和色譜法（AC）原理：利用生物大分子和固定相表面的生化特異性親和力進行選擇性分離固定相：生物專一性配基+載體流動相：一定pH的緩沖液用途：蛋白、酶、抗體分離生物和醫(yī)藥分析當前16頁，總共40頁。第四節(jié)HPLC分離條件的選擇1、渦流擴散項

A：A=2dp

dp—填充物平均直徑；—填充不規(guī)則因子使用細顆粒固定相球形固定相并填充均勻當前17頁，總共40頁。2、分子擴散項B/u：B=2Dm—彎曲因子Dm—流動相中的擴散系數(shù)流動相是液體，室溫操作，Dm小流速在最佳流速以上，u較大

在HPLC中,B/u較小，可忽略即：

H=A+Cu當前18頁，總共40頁。3、傳質(zhì)阻力項(Cu)使用細顆粒固定相并填充均勻使用低黏度的流動相流速不宜過快:HPLC一般流量為1ml/min左右當前19頁，總共40頁。dP變小，A、C均變小塔板高度受u的影響也較小4、固定相顆粒dP對柱效的影響影響HPLC柱效的最主要因素

固定相顆粒粒度小的dP是保證HPLC高柱效的主要措施當前20頁，總共40頁。1、小粒度，均勻的球形固定相2、低粘度的流動相；流速不宜過快3、適當?shù)闹鶞氐谒墓?jié)HPLC分離條件的選擇HPLC分離條件：當前21頁，總共40頁。第五節(jié)HPLC的建立與應(yīng)用一、建立HPLC分析方法的一般步驟

1、根據(jù)被分析樣品的特性選擇適用于樣品分析的一種HPLC分離方式。材料來源、濃度范圍組分特性、結(jié)構(gòu)、分子量、溶解性等當前22頁，總共40頁。

當前23頁，總共40頁。一、建立HPLC分析方法的一般步驟

分離模式選擇反相鍵合相色譜離子抑制色譜離子對色譜液-固吸附色譜2、選擇色譜分離模式和色譜柱色譜柱選擇固定相類型、粒度、柱長、柱內(nèi)徑當前24頁，總共40頁。一、建立HPLC分析方法的一般步驟

3、根據(jù)樣品性質(zhì)和分析目的選擇檢測器樣品具有紫外吸收特性紫外吸收檢測器樣品具有發(fā)射熒光特性熒光檢測器樣品無紫外吸收或弱紫外吸收蒸發(fā)光散射檢測器分析目的：定性分析質(zhì)譜檢測器HPLC-MS當前25頁，總共40頁。一、建立HPLC分析方法的一般步驟

合適的保留時間和分析速度最佳的柱效和適當?shù)姆蛛x度根據(jù)分析目的不同，要求的分離度也不同。等度洗脫和梯度洗脫簡單樣品、單一成分定量：等度洗脫復(fù)雜樣品、多成分分析或指紋圖譜：梯度洗脫4、流動相的選擇和優(yōu)化當前26頁，總共40頁。一、建立HPLC分析方法的一般步驟

4.分析條件的優(yōu)化溫度流速檢測條件進樣量當前27頁，總共40頁。一、建立HPLC分析方法的一般步驟

6、由獲得的色譜圖進行定性分析和定量分析。制備標準工作曲線精密度試驗重復(fù)性試驗加標回收率試驗樣品穩(wěn)定性考察5、建立分析方法并驗證當前28頁，總共40頁。29二、實驗技術(shù)（一）樣品處理1.溶劑萃取HPLC分析通常是使用與水不混溶的有機溶劑從水相中萃取待測的有機化合物。常用有機溶劑：氯仿，乙醚，乙酸乙酯，正丁烷等萃取次數(shù)：3～5次萃取液處理：合并萃取液，進行蒸發(fā)濃縮，在用適當?shù)挠袡C溶劑（如色譜純甲醇）溶解。當前29頁，總共40頁。30利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，與基體分離，然后用洗脫液洗脫，收集洗脫液，適當處理（蒸發(fā)濃縮）后用適當溶劑溶解，供HPLC測定。（一）樣品處理2.固相萃取二、實驗技術(shù)當前30頁，總共40頁。31（一）樣品處理二、實驗技術(shù)3.樣品過濾用0.45um的微孔濾膜的樣品過濾頭過濾。當前31頁，總共40頁。321.過濾：流動相用0.45μm的微孔濾膜過濾2.脫氣：離線脫氣、在線脫氣二、實驗技術(shù)（二）流動相處理不能使用腐蝕性的溶劑。如強酸。流動相不能含有任何顆粒。流動相中無機鹽的濃度要盡量小(一般幾十mmol/L)分析完成要及時用足量的水將緩沖鹽沖走，然后用甲醇或乙腈沖洗系統(tǒng)。當前32頁，總共40頁。33避免壓力和溫度的急劇變化和任何機械震動樣品要進行預(yù)處理；在分析柱前安裝保護柱流動相要適宜，不能對固定相產(chǎn)生破壞注意色譜柱的pH使用范圍、耐壓限度注意色譜柱的方向性，色譜柱不能反沖。每次色譜分析完成后，要及時對色譜柱進行沖洗保存色譜柱在合適的溶劑中，一般是甲醇或乙睛二、實驗技術(shù)（三）色譜柱使用注意事項當前33頁，總共40頁。34紫外檢測器：流動相在測定波長處不能有紫外吸收熒光檢測器：流動相不能含有熒光物質(zhì)或使熒光熄滅的物質(zhì)蒸發(fā)光散射檢測器：流動相要易揮發(fā)，不含有難揮發(fā)的無機鹽二、實驗技術(shù)（四）不同檢測器對流動相的不同要求當前34頁，總共40頁。二、HPLC定性定量分析方法1、定性分析色譜鑒定法：保留時間對照化學鑒定法：利用專屬化學反應(yīng)對分離后收集的組分定性色譜-光譜聯(lián)用定性非在線色譜光譜聯(lián)用法：色譜光譜聯(lián)用儀當前35頁，總共40頁。二、HPLC定性定量分析方法2、定量分析外標法：外標工作曲線法、外標一點法、外標二點法等不需知道校正因子，但需進樣量準確內(nèi)標法：內(nèi)標工作曲線法、內(nèi)標一點法、內(nèi)標二點法、內(nèi)標對比法當前36頁，總共40頁。1、在食品分析中的應(yīng)用食品營養(yǎng)成分分析：蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、礦物質(zhì)等；食品添加劑分析：甜味劑、防腐劑、著色劑、抗氧化劑等；食品污染物分析：霉菌毒素、微量元素、多環(huán)芳烴等。2、在環(huán)境分析中的應(yīng)用多環(huán)芳烴、農(nóng)藥（如氨基甲酸脂類）殘留等。三、HPLC的應(yīng)用當前37頁，總共40頁。3、在生命科學中的應(yīng)用分子水平上研究生命科學、遺傳工程、臨床化學、分子生物學等必不可少的工具低分子量物質(zhì)：氨基酸、有機酸、有機胺、類固醇、卟啉、糖類、維生素等分離和測定高分子量物質(zhì)：多肽、核糖核酸、蛋白質(zhì)和酶的純化、分離和測定三、HPLC的應(yīng)用當前38頁